הדמיה לחיות תאים תאים פטרייתי לחקור מצבים של ערך ולוקליזציה Subcellular של הצמח נגד פטריות Defensins

צמח defensins לשחק תפקיד חשוב בהגנה צמח נגד פתוגנים. עבור שימוש יעיל של אלה פפטידים נגד פטריות כמו סוכני פטריות, הבנת את מצבי הפעולה (מואה) היא קריטית. . הנה, שיטת הדמיה לחיות תאים מתואר ללמוד היבטים קריטיים מואה של פפטידים אלה.

המטרה הכוללת של שיטת הדמיה זו של תאים חיים היא לחקור היבטים קריטיים של מנגנוני הפעולה של דפנסינים צמחיים אנטי-פטרייתיים בתאי פטרייה. עם הופעתן של טכניקות מיקרוסקופיה קונפוקליות מתקדמות, הדמיית תאים חיים הפכה לכלי רב עוצמה לחקר דרכי הפעולה של דפנסינים צמחיים אנטי פטרייתיים. תוך שימוש בטכנולוגיה זו, אנו מציגים כאן שיטה שתעזור לענות על שאלת מפתח בהבנת דרכי הפעולה של דפנסינים צמחיים אנטי פטרייתיים.

ההתמקדות שלנו היא כיצד פפטידים אלה מופנמים בתאי הפטרייה וכיצד פפטידים אלה ממוקמים באברוני התא או מתפזרים בציטופלזמה. כדי ליצור תרחיף קונידיאלי של זן PH-1 של Fusarium graminearum, הגדר תחילה תרביות של הזן על צלחות המכילות מדיום שלם. תרבו אותם בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס במשך חמישה ימים.

כדי לייצר קונידיה, יש לחסן ארבעה פקקים בקוטר 10 מילימטר של התרבית בת החמישה ימים לתוך 50 מיליליטר של מדיום קרבוקסימתיל צלולוז. תרבו את הפקקים הללו במשך ארבעה עד שבעה ימים בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס על שייקר סיבובי המכוון ל-180 סל"ד. כאשר לתרבויות יש צבע אדום, נוצרו הקונידיות.

כדי לאסוף את הקונידיה בתרחיף, מערבל את התרבית הנוזלית, וסנן מיליליטר אחד ממנה דרך שתי שכבות של חומר סינון, לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של שני מיליליטר. צנטריפוגה את המתלה למשך שתי דקות, והשליכו את הסופרנטנט. לאחר מכן, שטפו את הכדור במיליליטר מים סטריליים, וחזרו על הצנטריפוגה.

לאחר מכן, השעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של 2x SFM. לאחר מכן, ספרו את הקונידיה באמצעות המוציטומטר, והתאימו את צפיפות המתלה ל-100,000 קונידיה למיליליטר. כדי ליצור תרחיף קונידיאלי של Neurospora crassa, העבירו קונידיה מתרביות מלאי לצינור משופע המכיל את מדיום האגר של ווגל, ודגרו על הצינורות בטמפרטורת החדר באור קבוע למשך חמישה ימים.

לאחר חמישה ימים, העבירו כמות קטנה של תרבית גידול, באמצעות לולאת חיסון, לצינור מיקרו-צנטריפוגה המכיל שני מיליליטר של המדיום הנוזלי של ווגל. הקפד לערבב את הקונידיה מהלולאה. לאחר מכן, סנן את המתלה, צנטריפוגה אותו והשהה מחדש את כדור הקונידיה במדיום של ווגל ללא שלב כביסה.

לבסוף, כוונן את המתלה הסופי ל-100,000 קונידיה למיליליטר. להכנת תכשיר נבט למיקרוסקופיה קונפוקלית, פיפטה 50 מיקרוליטר של תרחיף קונידיה על צלחת תרבית של 35 מילימטר, ותן לקונידיה לנבוט במשך שלוש עד שש שעות בטמפרטורת החדר. למיקרוסקופיה קונפוקלית, פיפטה 50 מיקרוליטר של תרחיף קונידיאלי למיקרו-באר של 10 מילימטר של צלחת תחתית זכוכית.

לאחר מכן, בריכוז המעכב המינימלי שנקבע מראש, הוסיפו 50 מיקרוליטר של דפנסינים עם תווית פלואורסצנטית לתרחיף, ודגרו על הקונידיה עם הדפנסינים המסומנים למשך 2.5 שעות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, הוסף שני מיקרוליטר של הצבע הסלקטיבי של הממברנה FM4-64, לריכוז סופי של חמש מיקרומולר. לאחר מכן, דגרו את התרבית למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר לפני בדיקת הקונדיה.

כדי להגדיר את המיקרוסקופ הקונפוקלי, בחר בלייזר האור הלבן. השתמש בלייזרים של 488 ננומטר ו-550 ננומטר כדי לעורר את הדפנסינים המסומנים ברודמין ואת צבע FM4-64, בהתאמה. הגדר את הלייזרים הללו לעוצמה של 1%לאחר מכן, הגדר את אורכי גל הזיהוי ל-580 עד 700 ננומטר עבור הדפנסין המסומן ברודמין ומ-690 עד 800 ננומטר עבור צבע FM4-64.

כעת, אספו את התמונות. להדמיית זמן-lapse, הוסף 50 מיקרוליטר של מתלה קונידיאלי לתוך צלחת מיקרובאר עם תחתית זכוכית. לאחר מכן, הרכיבו את צלחת המיקרובאר על המיקרוסקופ, ומצאו את התאים בהספק נמוך.

לאחר מכן, עבור ליעד שמן של פי 100, 1.44. כדי לצפות בדפנסינים המסומנים ב-DyLight550, הגדר את קו הלייזר ל-550 ננומטר לעירור ומ-560 ל-600 ננומטר לזיהוי. לאחר מכן, הגדר את מצב הסריקה ל-xyzt.

לאחר מכן, הגדר את מיקום Z, הזום, תדירות צילום התמונה וכן הלאה, לפי הצורך. כעת, לתרחיף הקונידיאלי, הוסף 50 מיקרוליטר של דפנסינים המסומנים בפלואורופור בריכוז מעכב מינימלי של שלוש מיקרומולר, והוסף שני מיקרוליטרים של צבע סלקטיבי ממברנה FM4-64 לריכוז סופי של חמש מיקרומולר. לאחר מכן, מקד מחדש את האופטיקה במידת הצורך.

לפני צילום תמונות, הניחו פיסות קטנות של נייר סינון רטוב בצלחת המיקרווול כדי למנוע אידוי. לאחר מכן, עבד עם לכידת תמונה כל 3.5 דקות במשך 2.5 שעות. הדמיית תאים חיים בוצעה כדי לעקוב ולהשוות את ההפנמה והלוקליזציה התת-תאית של שני דפנסינים מ-Medicago truncatula.

דפנסין 4 מסונתז כימית עם תווית רודמין נסחר באופן שונה ב-Neurospora crassa וב-Fusarium graminearum. FM4-64 תייג את ממברנות הפלזמה של שתי הפטריות. עם זאת, בפוסריום, דפנסין ארבע מפוזר בציטופלזמה.

ואילו בנוירוספורה הוא מועבר לגופים שלפוחיתיים. לשם השוואה, דפנסין חמש הודגם באמצעות תווית DyLight550 ב-Neurospora crassa, יחד עם תיוג ממברנת פלזמה על ידי FM4-64. הדמיית זמן-lapse מראה כי דפננסין זה נכנס לתאים תוך 30 עד 40 דקות ולאחר מכן מתפזר דרך הציטופלזמה.

זה שונה מהסחר בדפנסין ארבע, שנכנס לתאים ונשאר כלוא בתוך גופי השלפוחית גם לאחר שלוש שעות. לסיכום, הדמיית תאים חיים היא כלי רב עוצמה להגברת ההבנה שלנו לגבי אופני הפעולה של הבדלים בצמחים אנטי-פטרייתיים. עם צבעים פלואורסצנטיים חיוניים אחרים וסמנים תאיים, יש לו את הגמישות לשינוי עבור פפטידים אנטי-מיקרוביאליים אחרים.

בסופו של דבר, הטכניקה הזו יכולה לסייע בפיתוח אסטרטגיות חדשות לשימוש בפפטידים אנטי-מיקרוביאליים כחומר אנטי-פטרייתי בחקלאות וברפואה.