Name: הדמיה לחיות תאים תאים פטרייתי לחקור מצבים של ערך ולוקליזציה Subcellular של הצמח נגד פטריות Defensins (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: חקור מנגנוני פעולה של דפנסינים צמחיים נגד פטריות בתאי פטריות חיים באמצעות מיקרוסקופיית קונפוקל מתקדמת. למד כיצד פפטידים אלה נקלטים ומותמרים בתוך התאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ד ר ר הווארד ברג, מנהל מתקן מיקרוסקופ משולבת במרכז דונלד Danforth צמח המדע, להדרכה שלו ולעזור עם מיקרוסקופיה קונפוקלית. המחברים יש אין ניגוד אינטרסים להכריז.

1. תיוג של Defensins עם Fluorophores
<ol>
	<li>בחר fluorophore בעל השפעה מינימלית על המאפיינים מיקרוביאלית כמו גם ספיגת ועל לוקליזציה של defensin בתוך התא החי. הערה: בחירת fluorophore האופטימלי תלוי מטרות ספציפיות ניסיוני. ספקטרלי והכימיות, פוטוסטביליטי, אחראי על fluorophore וגודל גם להתייחס.</li>
	<li>תווית defensin עם fluorophore שנבחר באמצעות פפטיד המתאים של תיוג ערכת ולמשקאות מסחרי. לחלופין, מבחינה כימית לסנתז defensins התווית על-ידי fluorophore. במחקר זה, תווית MtDef5 defensin עם DyLight550 באמצעות תיוג מסחרי קיט על פי הפרוטוקול ואת tetramethyl rhodamine היצרן (טמרה)-defensin MtDef4 שכותרתו כימית סונתז מסחרית. הערה: מומלץ כי מסונתז כימית fluorophore מתויג פפטידים (במיוחד עבור פפטידים קצרים של חומצות אמינו 50 או פחות) לשמש מאז שניתן לחבר את fluorophore N - או C-מסוף השאריות פפטיד כדי להבטיח השפעה מינימלית על שלה פעילות מיקרוביאלית. סינתזה של פפטידים ארוכים עם יותר משלושה חוב דיסולפידי הוא מאתגר. במקרה זה, מומלץ פפטיד זה להיקרא עם fluorophore אופטימלי באמצעות פפטיד זמינים מסחרית מתאימים תיוג קיט.</li>
	<li>מבחן במבחנה פעילות מיקרוביאלית של defensin שכותרתו ולקבוע את הריכוז המעכב מינימלי (MIC) נגד פטריות להיחקר. הערה: במחקר זה, המיקרופון של DyLight550-MtDef5, TMR-MtDef4 היה נחוש נגד Neurospora crassa Fusarium graminearum.</li>
</ol>
2. מדיום הגידול ומתרבויות פטרייתי
<ol>
	<li>העברת conidia מתרבות מניות crassa ש שיפוע הצינור המכיל של ווגל אגר בינוני21 , דגירה בטמפרטורת החדר בתאורה במשך 5 ימים.</li>
	<li>תרבות graminearum פ זן PH-1 על צלחות המכיל שלם בינוני (ס מ)22 -28 ºC במשך 5 ימים. לייצור של conidia, לחסן 4 פקקים (10 מ מ קוטר) של בן 5 יום התרבות של פ graminearum PH-1 לתוך 50 מ של carboxymethyl תאית (CMC) בינונית (15 גר' carboxymethyl תאית, 1 g תמצית שמרים, 0.5 g MgSO4.7 H2O, NH 1 g 4 אין3ו- 1 g ח'2PO4) ותרבות 4-7 ימים-ºC 28 ב שייקר רוטרי ב 180 סל ד.</li>
</ol>
3. הכנה של הבולם Conidial
<ol>
	<li>ההשעיה conidial graminearum פ
	<ol>
		<li>מערבולת התרבות נוזלי פ graminearum , conidia לאסוף על-ידי סינון 1.5 mL תרבות פטרייתי דרך שתי שכבות של חומר סינון (כגון Miracloth) לתוך צינור microcentrifuge 2 מ"ל. Centrifuge את המתלים conidial ב 13,226 x g מהירות microcentrifuge למשך 2 דקות.</li>
		<li>למחוק את תגובת שיקוע והוסף 1 מ"ל של מים סטריליים לשטוף בגדר.</li>
		<li>Centrifuge המתלים conidial ב 13,226 x g מהירות microcentrifuge עבור 2 דק להשליך את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 1 מ"ל של X SFM (מדיה פטרייתי סינתטי) 223.</li>
		<li>לספור את conidia באמצעות hemocytometer תחת מיקרוסקופ אור.</li>
		<li>התאם את המתלים conidial כדי 105 conidia/mL עם 2 X SFM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>(ש ע) crassa הבולם conidial
	<ol>
		<li>העברת כמות קטנה של תרבות גדל (בן 5 יום) crassa ש באמצעות ללולאה חיסון לרכבת התחתית microcentrifuge המכיל 2 מ של המדיום הנוזלי של ווגל.</li>
		<li>מערבולת המתלה conidial ומסנן דרך סינון החומר לתוך צינור microcentrifuge.</li>
		<li>Centrifuge המתלים conidial במהירות מקסימלית microcentrifuge עבור 2 דק. להשליך את תגובת שיקוע, resuspend בגדר conidial ב 1 מ"ל של המדיום הנוזלי של ווגל.</li>
		<li>לספור את conidia באמצעות hemocytometer תחת מיקרוסקופ אור.</li>
		<li>התאם את המתלים conidial כדי 105 conidia/mL בינונית נוזלי של ווגל.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. לדגום קונפוקלית והכנה
<ol>
	<li>לוקליזציה subcellular של MtDef4 defensin לתוך תאים פטרייתי
	<ol>
		<li>פיפטה 50 µL של כל השעיה conidial (105 conidia/mL) לתוך microwell 10 מ מ של 35 מ מ זכוכית התחתון microwell מנות. עבור הצפיה conidia, ישירות להמשיך לשלב הבא, או להכנה germlings, µL 50 פיפטה crassa ש ו פ graminearum conidia לתוך הכלים תרבות 35 מ מ ולתת לנבוט במשך 3-6 שעות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>להוסיף 50 µL של defensin fluorescently עם תוויות על המיקרופון כדי כל מנה microwell, תקופת דגירה של 2.5 h. המיקרופון של התווית על-ידי fluorophore defensins המשמש כאן (שלב 1.3) 3 מיקרומטר crassa ש וגם פ graminearum , המיקרופון של TMR-MtDef4 crassa ש ו פ graminearum היה 1 מיקרומטר ו 12 מיקרומטר, בהתאמה.</li>
		<li>להוסיף 2 µL של ממברנה סלקטיבית לצבוע FM4-64 (הריכוז הסופי: 5 מיקרומטר) בתרבות צלחת ואת תקופת דגירה של 30 דקות לטעון מיד על מיקרוסקופ קונפוקלי עבור הדמיה.</li>
		<li>בחר את לייזר אור לבן (יקלו). להשתמש את nm מקורות 488 לייזר שני 550 ננומטר לגרות צבע TMR-MtDef4 ו- FM4-64, בהתאמה. זריחה של TMR-MtDef4-580-700 nm ויוכל לזהות צבע FM4-64-690-800 ננומטר. הערה: בצע מיקרוסקופיה קונפוקלית בחדר חשוך.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>זמן לשגות הדמיה של הפנמה של MtDef5 defensin
	<ol>
		<li>פיפטה µL 50 crassa ש ו פ graminearum conidial השעיה (105 conidia/mL) לתוך 10 מ מ microwell של 35 מ מ זכוכית התחתון microwell מנות. Microwell 10 מ מ הוא ללא ציפוי ויש לו כוס כיסוי מס 1.5 בתחתית. עבור הצפיה conidia, ישירות להמשיך לשלב הבא. להשגחה של germlings, דגירה conidia במשך 3-6 שעות בטמפרטורת החדר לפני שתמשיך עם מיקרוסקופ.</li>
		<li>הפעל יקלו. בחר את השורה לייזר ב 550 ננומטר לרגש את התווית על-ידי fluorophore defensins המשמש כאן (שלב 1.3) ואת FM4-64 בעוצמה 1.00% ולהפעיל את גלאי המתאימים. התווית על-ידי fluorophore defensins המשמש כאן (שלב 1.3) התגלה ב- 560-600 nm, FM4-64dye התגלה ב- 690-800 ננומטר. הערה: השתמש לייזר נמוך עוצמה תא חי הדמיה כמו עוצמת לייזר גבוה יכול לגרום נזק לתאי פטרייתי בשידור חי.</li>
		<li>הר המנה microwell על המיקרוסקופ. למצוא את התאים באמצעות מטרות x 10 בתחילה, ואז לעבור 100 x / 1.44 שמן. המטרה הגדלה גבוהה יותר. הערה: הגדרת מצב סריקה כדי xyzt (שילוב של Z-מחסנית ומצבי בצילום מואץ), Z עמדה, זום, התדירות של לכידת התמונה, וכו '.</li></ol></li></ol>לפני שתמשיך לשלב הבא.
		<li>להוסיף 50 µL של התווית על-ידי fluorophore defensins המשמש כאן (שלב 1.3) של המיקרופון של מיקרומטר 3 ו 2 µL של צבע ממברנה סלקטיבית FM4-64 (ריכוז סופי 5 מיקרומטר) כל מנה microwell והתחל הדמיה בצילום מואץ. למקם חתיכות קטנות של ניירות סינון רטוב הכלים microwell כדי למנוע התאיידות. התדירות של לכידת תמונה 3 דקות 30 s והיה שתקופת הכוללת 2 וחצי שעות. הערה: הוספת defensin ו- fluorophore לאחר הרכבה מאכל microwell במיקרוסקופ ניתן defocus האזור של ריבית. לכן, לאחר הוספת defensin, fluorophore microwell, אזור של עניין צריך להיות refocused אשר יכול לגרום לעיכוב ברכישת התמונה.</li>
		<li>לשימוש מיקרוסקופ קונפוקלי עבור הדמיה כל קונאפוקלית ולבצע את מיקרוסקופ בטמפרטורת החדר בחדר חשוך.</li>

<ol><li>Jones, J. D. G., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nature/journal/v444/n7117/full/nature05286.html">The plant immune system.</a> Nature. 444 (7117), 323-329 (2006).</li>
<li>Tavormina, P., De Coninck, B., Nikonorova, N., De Smet, I., Cammue, B. P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Plant+Peptidome%3A+An+expanding+repertoire+of+structural+features+and+biological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+cell%22%5BJournal%5D)">The Plant Peptidome: An expanding repertoire of structural features and biological functions.</a> Plant cell. 27 (8), 2095-2118 (2015).</li>
<li>Van Der Weerden, N. L., Bleackley, M. R., Anderson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+and+mechanisms+of+action+of+naturally+occurring+antifungal+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+and+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Properties and mechanisms of action of naturally occurring antifungal peptides.</a> Cell. and Mol. Life Sci. 70 (19), 3545-3570 (2013).</li>
<li>Van der Weerden, N. L., Anderson, M. A. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/profile/Marilyn_Anderson/publication/257691605_Plant_defensins_Common_fold_multiple_functions/links/02e7e5269aee227c27000000.pdf">Plant defensins: Common fold, multiple functions.</a> Fungal Biol Rev. 26 (4), 121-131 (2013).</li>
<li>De Coninck, B., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1749461312000346">Modes of antifungal action and in planta functions of plant defensins and defensin-like peptides.</a> Fungal Biol Rev. 26 (4), 109-120 (2013).</li>
<li>Kaur, J., Sagaram, U. S., Shah, D. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S174946131100042X">Can plant defensins be used to engineer durable commercially useful fungal resistance in crop plants?</a> Fungal Biol. Rev. 25 (3), 128-135 (2011).</li>
<li>Vriens, K., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+plant+defensins%3A+Mechanisms+of+action+and+production%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Antifungal plant defensins: Mechanisms of action and production.</a> Molecules. 19 (8), 12280-12303 (2014).</li>
<li>Sagaram, U. S., Kaur, J., Shah, D. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/bk-2012-1095.ch015">Antifungal plant defensins: Structure-activity relationships, modes of action, and biotech applications.</a> ACS Symp. Ser. 1095, 317-336 (2012).</li>
<li>Thevissen, K., Francois, I. E. J. A., Aerts, A. M., Cammue, B. P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+sphingolipids+as+targets+for+the+development+of+selective+antifungal+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Fungal sphingolipids as targets for the development of selective antifungal therapeutics.</a> Curr. Drug Targets. 6 (8), 923-928 (2005).</li>
<li>Thevissen, K., Kristensen, H. H., Thomma, B. P. H. J., Cammue, B. P. A., Francois, I. E. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+antifungal+plant+and+insect+defensins%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of antifungal plant and insect defensins.</a> Drug Discov. Today. 12 (21-22), 966-971 (2007).</li>
<li>Aerts, A. M., François, I. E. J. A., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mode+of+antifungal+action+of+plant%2C+insect+and+human+defensins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The mode of antifungal action of plant, insect and human defensins.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65 (13), 2069-2079 (2008).</li>
<li>Van Der Weerden, N. L., Lay, F. T., Anderson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plant+defensin%2C+NaD1%2C+enters+the+cytoplasm+of+Fusarium+oxysporum+hyphae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The plant defensin, NaD1, enters the cytoplasm of Fusarium oxysporum hyphae.</a> J. Biol. Chem. 283 (21), 14445-14452 (2008).</li>
<li>Lobo, D. S., Pereira, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+Pisum+sativum+Defensin+1+Interacts+with+Neurospora+crassa+Cyclin+F+Related+to+the+Cell+Cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Antifungal Pisum sativum Defensin 1 Interacts with Neurospora crassa Cyclin F Related to the Cell Cycle.</a> Biochemistry. 46 (4), 987-996 (2007).</li>
<li>El-Mounadi, K., Islam, K. T., Hernandez-Ortiz, P., Read, N. D., Shah, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+mechanisms+of+a+plant+defensin+MtDef4+are+not+conserved+between+the+ascomycete+fungi+Neurospora+crassa+and+Fusarium+graminearum%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antifungal mechanisms of a plant defensin MtDef4 are not conserved between the ascomycete fungi Neurospora crassa and Fusarium graminearum.</a> Mol. Microbiol. 100 (3), 542-559 (2016).</li>
<li>Baxter, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tomato+Defensin+TPP3+Binds+Phosphatidylinositol+%284%2C5%29-Bisphosphate+via+a+Conserved+Dimeric+Cationic+Grip+Conformation+To+Mediate+Cell+Lysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+and+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Tomato Defensin TPP3 Binds Phosphatidylinositol (4,5)-Bisphosphate via a Conserved Dimeric Cationic Grip Conformation To Mediate Cell Lysis.</a> Mol. and Cell. Biol. 35 (11), 1964-1978 (2015).</li>
<li>Kvansakul, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+phosphatidic+acid+by+NsD7+mediates+the+formation+of+helical+defensin-lipid+oligomeric+assemblies+and+membrane+permeabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Binding of phosphatidic acid by NsD7 mediates the formation of helical defensin-lipid oligomeric assemblies and membrane permeabilization.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 113, 11202-11207 (2016).</li>
<li>Poon, I. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositide-mediated+oligomerization+of+a+defensin+induces+cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositide-mediated oligomerization of a defensin induces cell lysis.</a> eLife. 3, e01808(2014).</li>
<li>Muñoz, A., Read, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+and+analysis+shed+light+on+the+complexity+and+dynamics+of+antimicrobial+Peptide+action%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging and analysis shed light on the complexity and dynamics of antimicrobial Peptide action.</a> Front. Immunol. 3, 248(2012).</li>
<li>Hayes, B. M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+mechanism+of+action+of+the+plant+defensin+NaD1+as+a+new+member+of+the+antifungal+drug+arsenal+against+candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Identification and mechanism of action of the plant defensin NaD1 as a new member of the antifungal drug arsenal against candida albicans.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 57 (8), 3667-3675 (2013).</li>
<li>Muñoz, A., Marcos, J. F., Read, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration-dependent+mechanisms+of+cell+penetration+and+killing+by+the+de+novo+designed+antifungal+hexapeptide+PAF26%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Concentration-dependent mechanisms of cell penetration and killing by the de novo designed antifungal hexapeptide PAF26.</a> Mol. Microbiol. 85 (1), 89-106 (2012).</li>
<li>Eaton, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+guanine+nucleotide+exchange+factor+RIC8+regulates+conidial+germination+through+G%CE%B1+proteins+in+Neurospora+crassa%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The guanine nucleotide exchange factor RIC8 regulates conidial germination through Gα proteins in Neurospora crassa.</a> PLoS One. 7 (10), e48026(2012).</li>
<li>Leslie, J. F., Summerell, B. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLeslie%2C+JF+%22The+Fusarium.+laboratory+manual%22">The Fusarium. laboratory manual</a>. , Blackwell Professional. Ames, IA, USA. (2006).</li>
<li>Broekaert, W. F., Terras, F. R. G., Cammue, B. P. A., Vanderleyden, J. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1574-6968.1990.tb04174.x/abstract">An automated quantitative assay for fungal growth inhibition.</a> FEMS Microbiol.Lett. 69 (1-2), 55-59 (1990).</li>
<li>Sagaram, U. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+studies+of+a+phosphatidic+acid-binding+antifungal+plant+defensin+MtDef4%3A+Identification+of+an+RGFRRR+motif+governing+fungal+cell+entry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Structural and functional studies of a phosphatidic acid-binding antifungal plant defensin MtDef4: Identification of an RGFRRR motif governing fungal cell entry.</a> PLoS One. 8 (12), 1-22 (2013).</li>
<li>Uchida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+X-ray+tomography+of+phenotypic+switching+and+the+cellular+response+to+antifungal+peptoids+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Soft X-ray tomography of phenotypic switching and the cellular response to antifungal peptoids in Candida albicans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (46), 19375-19380 (2009).</li>
<li>Nair, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Better+prediction+of+sub-cellular+localization+by+combining+evolutionary+and+structural+information%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins+Struct.+Funct.+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Better prediction of sub-cellular localization by combining evolutionary and structural information.</a> Proteins Struct. Funct. Bioinform. 53 (4), 917-930 (2003).</li>
<li>Scott, M. S., Calafell, S. J., Thomas, D. Y., Hallett, M. T. <a target="_blank" href="http://journals.plos.org/ploscompbiol/article?id=10.1371/journal.pcbi.0010066">Refining protein subcellular localization.</a> PLoS Comput. Biol. 1 (6), e66(2005).</li>
<li>Shagaghi, N., Bhave, M., Palombo, E., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+sequence+of+interactions+of+PuroA+peptide+with+Candida+albicans+cells+by+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Revealing the sequence of interactions of PuroA peptide with Candida albicans cells by live-cell imaging.</a> Sci. Rep. 7, 43542(2017).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

במחקר זה, מתודולוגיה אמינה של הדמיה לחיות תאים עם השימוש fluorescently שכותרתו defensins פטריות שתואר ללמוד את קינטיקה של ההפנמה של פפטידים אלה לתוך תאים פטרייתי וכדי לקבוע את המטרות subcellular. שיטה זו היא כלי רב עוצמה כדי להמחיש את הדינמיקה של האינטראקציה בין defensins ותאים פטרייתי חנותם והמרגשים.
שיטות שונות שימשו כדי ללמוד על הפנמה ולוקליזציה תאיים של הצמח defensins בתאים פטרייתי. בשיטות אלו, תאים שטופלו defensin בדרך כלל קבוע, לאחר מכן מעובד עבור immunolocalization, מיקרוסקופ אלקטרונים ...

הצמחים התפתחו מערכת חיסונית מולדת מתוחכמים להגנה נגד פתוגנים צמח חיידקים1. הם מבטאים רבים פפטידים ההגנה מארח גן מקודד עם פעילות מיקרוביאלית בשם2. ואכן, רבים של פפטידים אלה מציגים פעילות מיקרוביאלית במבחנה3. Defensins מהווים את אחת הקבוצות הגדולות של פפטידים ההגנה מארח הממלכה של הצמח4. אלה פפטידים עשיר ציסטאין, cationic להפגין פעילות מעכבות צמיחה חזקה נגד פטרייתי, פתוגנים oomycete ריכוזי micromolar, ייצגו אחת השורות הראשונות של הגנה מפני פתוגנים אלה,5,6. בשל פעילותם נגד פטריות חזק, אפשר לנצל defensins ביישומים agribiotechnological ליצירת גידולים עמידים בפני מחלות. ביטוי המכונן של מספר defensins הצמח הוכח כדי לשפר את ההתנגדות המחלה בבדיקות החממה ושדה של העברה6. חשוב לפענח את מנגנוני הפעולה (מואה) של פפטידים פטריות אלה על מנת מלא לרתום את הפוטנציאל שלהם ככלים יעילים עבור הגנת הצומח. עם זאת, מואה של אלה defensins צמח הם הבינו כהלכה. הראיות הנוכחי עולה כי הם מציגים שונות מואה5,6,7,8. כמה defensins לפעול extracellularly פטריות לכוון דופן התא הספציפי/פלזמה ממברנה sphingolipids תושב, לשבש הקרומיות, להפעיל רעילות הסלולר מסלולים9,10,11. לאחרונה, עם זאת, defensins פטריות זה translocate לתוך תאים פטרייתי היה שהתגלו12,13,14. חלק defensins אלה לאגד תושב קרום phospholipids ביו, יוצרים קומפלקסים oligomeric, permeabilize ממברנות פלזמה15,16,17. לפיכך, היבטים מסוימים של מואה של הצמח defensins יש כבר מבואר. עם זאת, מואה של הצמח defensins סביר כוללות מערך מורכב של אירועים אשר עדיין לא מזוהה, משולב לתוך מודל מקיף. בפרט, נותר פער רציני בהבנה שלנו של המטרות הסלולר של פפטידים אלה.
עם ההתקדמות מיקרוסקופ טכנולוגיות ופיתוח של הגששים פלורסנט חדש, טכניקות הדמיה לחיות תאים עכשיו משמשים לעתים קרובות כדי ללמוד מואה של פפטידים מיקרוביאלית (אמפר). טכניקות אלה משלימים שיטות שימוש נרחב כגון immunolocalization, מיקרוסקופ אלקטרונים, מיקרוסקופ כוח אטומי או רנטגן טומוגרפיה18, אשר יש כבר מועסקים בעיקר כדי לנתח את ההשפעות של פפטידים פטריות על המורפולוגיה, הצמיחה של תאים פטרייתי כולל המחקר של דופן התא שלמות, שינוי דפוסי צמיחה/מסעף תא, כמו גם קרום פלזמה permeabilization ולהרוג. למרות זאת, מחקרים אלה היה מוגבל הדמיה תאים בשלב זמן מסוים לאחר הטיפול עם פפטידים במקום ביצוע זמן לשגות הדמיה על אותם התאים כדי לעקוב אחר שינויים דינמיים שלהם בתגובה defensin אתגר. בשנים האחרונות השימוש פפטידים fluorescently שכותרתו בשיתוף עם חיים תא הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית אפשרה ויזואליזציה בזמן אמת של הדינמיקה של המגבר – חיידק אינטראקציות. שניהם באופן טבעי טהור ו מסונתז כימית פפטידים פטריות יכול להיות מתויג עם תוויות פלורסנט (למשל, DyLight, rhodamine, BODIPY או אלקסה עבור חיל הים על בסיס צבע), ישירות ציין במהלך האינטראקציה שלהם עם תאים על-ידי בצילום מואץ הדמיה לחיות תאים. השימוש אלה שכותרתו פפטידים גדל באופן משמעותי את ההבנה שלנו של היבטים שונים של שלהם מואה כולל מצב של ערך, לוקליזציה subcellular, וגדילת ואתרים של פעולה נגד פטריות בתוך תאים חיים פטרייתי 18.
לאחרונה, מספר מחקרים הראו כי פפטידים פטריות שונות כולל צמח defensins הם לנחלתו של חיים תאים פטרייתי12,14,19,20. מואה של אלה defensins סביר כרוכות באינטראקציה עם מטרות תאיים. לאחרונה דיווחנו בפעולה נגד פטריות של צמח defensin MtDef4 שני בפטרייה ascomycete, Neurospora crassa , Fusarium graminearum. MtDef4 הוצגה לשימוש מסלולים שונים עבור ערך התא פטרייתי ולוקליזציה subcellular אלה פטריות14. במחקר זה נעשה שימוש כימי מסונתז tetramethyl rhodamine (טמרה)-הנקרא MtDef4 בשילוב עם צבעי פלורסנט חיוני (קרום בררני לצבוע, FM4-64; צבע ממברנה-permeant, SYTOX ירוק תא מותו כתב לצבוע, יודיד propidium), מעכבי חילוף החומרים. ניתוחים אלה הפגינו את קינטיקה של ההפנמה של MtDef4, שלה מנגנונים תאיים תחבורה שלו מטרות subcellular14.
כאן מוצג עבור הדמיה לחיות תאים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית פרוטוקול. הפרוטוקול מנצל פפטידים שכותרתו fluorescently בשילוב עם צבעי פלורסנט חיוני ללמוד אינטראקציות צמח defensin-פטרייתי, בפרט, המסלולים של טרנסלוקציה המטרות תאיים של defensins בתאים פטרייתי.

<table><tbody><tr><td>FM4-64 Dye</td><td>Life Technologies</td><td>T13320</td><td></td></tr><tr><td>DyLight 550 ערכת תיוג נוגדנים</td><td>Thermo Scientific</td><td>84530</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית תחתונה Microwell</td><td>כלים מחצלת TeK</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>בד מירה EMD</td><td>Millipore Corp</td><td>475855-1R</td><td></td></tr><tr><td>SP8-X מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ תוכנה</td><td>FiJi</td><td></td><td>לניתוח תמונות</td></tr><tr><td>תוכנת Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td>לניתוח תמונות</td></tr></tbody></table>

הדמיה לחיות תאים תאים פטרייתי לחקור מצבים של ערך ולוקליזציה subcellular של הצמח נגד פטריות defensins

Live-cell Imaging of Fungal Cells to Investigate Modes of Entry and Subcellular Localization of Antifungal Plant Defensins

Defensins ציסטאין-עשיר קטנים הם אחת הקבוצות הגדולות של פפטידים ההגנה מארח נוכח כל הצמחים. Defensins הצמח רבים שהפגינו חזק במבחנה פטריות פעילות נגד רחבת ספקטרום של פתוגנים ופטריות, ולכן יש פוטנציאל לשמש סוכני פטריות מערכת העברה. על מנת לרתום את מלוא הפוטנציאל של הצמח defensins לבקרת מחלות, חשוב להבהיר שלהם מנגנון פעולה (מואה). עם כניסתו של טכניקות מתקדמות במיקרוסקופ, הדמיה לחיות תאים הפך להיות כלי רב עוצמה להבנת הדינמיקה של מואה פטרת של הצמח defensins. כאן, שיטת הדמיה של תאים חיים מבוסס מיקרוסקופיה קונפוקלית מתואר באמצעות שני defensins צמח שכותרתו fluorescently (MtDef4 ו- MtDef5) בשילוב עם צבעי פלורסנט חיוני. טכניקה זו מאפשרת הדמיה בזמן אמת וניתוח של האירועים הדינאמי של הפנמה MtDef4 ו- MtDef5 לתוך תאים פטרייתי. חשוב, וזמינותו זו יוצרת שפע של מידע, כולל הפנמה קינטיקה, מצב של ערך ולוקליזציה subcellular של פפטידים אלה. בשילוב עם כלים אחרים תא ביולוגי, שיטות אלה סיפקו תובנות קריטי הדינמיקה ואת המורכבות של מואה של פפטידים אלה. כלים אלה יכולים לשמש גם כדי להשוות מואה של פפטידים אלה נגד פטריות שונים.

חיים תא הדמיה בוצע מעקב אחר ולהשוות את הפנמה ואת subcellular לוקליזציה של defensins שני, MtDef4, MtDef5, מ- אספסת truncatula; בתאים פטרייתי. TMR-MtDef4 היה מסונתז כימית בזמן MtDef5 סומן עם Dylight550 (Dylight550-MtDef5). Conidia היו מודגרות עם או defensin בשילוב עם קרום בררני לצבוע FM4-64. איור 1 מראה כי TMR-MtDef4 יש מסלולים שונים סחר ב ש crassa לעומת פ graminearum. Crassa ש, FM4-64 לא לשפה משותפת עם defensin אך מעדיף כתמי...

צמח defensins לשחק תפקיד חשוב בהגנה צמח נגד פתוגנים. עבור שימוש יעיל של אלה פפטידים נגד פטריות כמו סוכני פטריות, הבנת את מצבי הפעולה (מואה) היא קריטית. . הנה, שיטת הדמיה לחיות תאים מתואר ללמוד היבטים קריטיים מואה של פפטידים אלה.

הדמיה לחיות תאים תאים פטרייתי לחקור מצבים של ערך ולוקליזציה Subcellular של הצמח נגד פטריות Defensins

Small cysteine-rich defensins are one of the largest groups of host defense peptides present in all plants. Many plant defensins exhibit potent in vitro ...

המטרה הכללית של שיטת דימות התאים החיים זו היא לחקור היבטים קריטיים של מנגנוני הפעולה של דפנזינים צמחיים נוגדי פטריות בתאי פטריות. עם הופעתן של טכניקות מתקדמות של מיקרוסקופיה קונפוקלית, דימות תאים חיים הפך לכלי רב עוצמה לחקר דרכי הפעולה של דפנזינים צמחיים נוגדי פטריות. תוך שימוש בטכנולוגיה זו, אנו מציגים כאן שיטה שתסייע במתן מענה לשאלות מפתח בהבנת דרכי הפעולה של דפנזינים צמחיים נוגדי פטריות.ההתמקדות שלנו היא באופן שבו פפטידים אלו נספגים לתוך התאים הפטרייתיים, ובאופן שבו פפטידים אלו ממוקמים באברוני התא או מפוזרים בציטופלזמה. כדי להכין תרחיף קונידיות של זן PH-1 של Fusarium graminearum, הגדירו תחילה תרביות של הזן על צלחות המכילות מצע גידול מלא. גדלו אותן בטמפרטורה של 28 °C במשך חמישה ימים.כדי להפיק קונידיות, יש להעביר ארבעה תקעים בקוטר 10 מילימטר מהתרבית בת גיל חמישה ימים לתוך 50 מיליליטר של מצע carboxymethyl cellulose. יש לגדל תקעים אלו במשך ארבעה עד שבעה ימים בטמפרטורה של 28 degrees Celsius על שייקר סיבובי המכוון ל-180 rpm. כאשר התרביות מקבלות גוון אדום, פירוש הדבר כי הקונידיות נוצרו.לאיסוף הקונידיות בתמיסה, ערבבו את תרבית הנוזלים במכשיר vortex, וסננו מיליליטר אחד ממנה דרך שתי שכבות של חומר סינון, אל תוך מבחנה למיקרוצנטריפוגה בנפח שני מיליליטר. סבבו את התמיסה בצנטריפוגה למשך שתי דקות

live-cell-imaging-fungal-cells-to-investigate-modes-entry-subcellular

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מדגים הדמיה חיה של תאים לניתוח פעילות אנטי-פטרייתית בנויטרופילים אנושיים באמצעות קונידיה פלואורסצנטית של כתב אספרגילוס. בתחילה, הן פלואורסצנטיות אדומה והן מגנטה מזוהות בתוך נויטרופילים, בעוד פלואורסצנטיות אדומה פוחתת עם הזמן, מה שמצביע על השפלה של קונידיה ומאשר את הפעילות האנטי פטרייתית של נויטרופילים.

הערכה בזמן אמת של הפעילות האנטי-פטרייתית של תאי חיסון אנושיים ראשוניים

אנו מתארים שיטות למיקרוסקופיה וידאו חי...

מיקרוסקופיה וידאו חי מתא phagocytosis הפתוגן פטרייתיים

כאן, אנו מתארים פרוטוקול להעריך פעילות אנטי-פטרייתית של תאי מערכת חיסון אנושיים עיקריים בזמן אמת באמצעות נבגי כתב ניאון אספרגילוס בשיתוף עם מיקרוסקופ וידאו חי התאים cytometry זרימה. נתונים המופקים לספק תובנה אינטראקציות אספרגילוס cell- מארח כגון פעילות קוטלת פטריות, phagocytosis, נדידת תאים ועיכוב של גידול פטרייתי.

הדמיה חיה של פעילות אנטי פטרייתי על ידי אדם מן המעלה הראשונה נויטרופילים ומונוציטים בתגובה<em&gt; A. fumigatus</em

גישות מבוססות חלבון פלואורסצנטי לפקח effectors מופרש על ידי חיידקים לתוך התאים המארחים הם מאתגרים. זאת בשל בעיית אי התאימות בין חלבונים פלורסנט ומערכת ההפרשה סוג-III. כאן, מערכת ה-GFP פיצול ממוטב superfolder משמש עבור ויזואליזציה של effectors מופרש על ידי חיידקים לתוך התא הצמח הפונדקאי.

מערכת חלבון פלואורסצנטי ירוק לדמיין Effectors מועברת בין חיידקים במהלך זיהום

צבעי פלורסנט חיוניים הם כלים חיוניים לניתוח הדמיה של תא חי בביולוגיה מודרנית של תאים פטרייתיים. נייר זה מפרט את היישום של צבעי פלורסנט ידוע פחות ידועים עבור מעקב הדינמיקה קרום הפלזמה, אנדו-/אקסוציטוזה וקיר התא מורגנזה בפטריות filamentous.

יישום של ממברנה וקיר תא צבעי פלורסנט סלקטיבית עבור הדמיה בשידור חי התא של פטריות Filamentous

בשל האטימות של האדמה, לא ניתן לדמיין בקלות אינטראקציות בין המיקרובים המרכיבים אותה עם רזולוציה תאית. כאן מוצגים שני כלים מיקרופלואידיים, המציעים הזדמנויות חדשות לחקר אינטראקציות פטרייתיות-מיקרוביאליות. המכשירים הם רב-תכליתיים ופשוטים לשימוש, ומאפשרים שליטה מרחבית-טמפורלית גבוהה והדמיה ברזולוציה גבוהה ברמה התאית.

כלים מיקרופלואידיים לחקר אינטראקציות פטרייתיות-מיקרוביאליות ברמה התאית

כתב יד זה מפרט פרוטוקול חיסון אופטימלי המשתמש בנדן עלי תירס מנותק למחקרים ציטולוגיים, פיזיולוגיים ומולקולריים הניתנים לשחזור של אינטראקציות תירס עם פתוגנים צמחיים פטרייתיים. מעטה העלים מאפשר תצפית בזמן אמת על אינטראקציות תאיות בין הצמח החי לפטרייה ברקמות לא מקובעות.

נדן תירס מנותק להדמיית תאים חיים של זיהום על ידי פתוגנים פטרייתיים של תירס פוליארי

Xenopus עובריים epithelia הם מערכת מודל אידיאלי ללמוד התנהגויות התא כגון פיתוח הקוטביות ולשנות צורה במהלך המורפוגנזה אפיתל. היסטולוגיה מסורתית של דגימות קבוע ויותר כהשלמה הדמיה לחיות תאים confocal. כאן אנו מדגימים שיטות לבודד ברקמות הצפרדע לדמיין לתאי האפיתל לחיות לחיות cytoskeleton שלהם באמצעות תאים מיקרוסקופיה confocal.

Live-תא הדמיה וניתוח כמותי של תאים אפיתל עובריים ב Xenopus laevis</em

הקרינה מבוסס מדידה הכניסה חנות המופעל הסידן בתאים חיים: מתא הסרטן תרבותי כדי סיב שריר שלד

פרוטוקול זה מתאר שיטה להמחשת DNA חלבון איתות הפסקה כפולת גדיל הופעל בתגובה לניזק לדנ"א, כמו גם הלוקליזציה שלה במהלך מיטוזה.

שתי והדמית תא חייה תלת ממדית של חלבוני תגובת ניזק לדנ&quot;א

חקור מנגנוני פעולה של דפנסינים צמחיים נגד פטריות בתאי פטריות חיים באמצעות מיקרוסקופיית קונפוקל מתקדמת. למד כיצד פפטידים אלה נקלטים ומותמרים בתוך התאים.

הדמיה לחיות תאים תאים פטרייתי לחקור מצבים של ערך ולוקליזציה Subcellular של הצמח נגד פטריות Defensins

גלה סרטונים נוספים