לוקליזציה כמותית של חלבון גולג'י על ידי הדמיה המסה מרכז של זריחה
10 באוגוסט 2017
ההתאמה המדויקת של תושבים גולג'י חיוני להבנת פונקציות הסלולר של גולג'י. עם זאת, מיקרוסקופ אופטי קונבנציונאלי אין אפשרות לפענח את מבנה תת-גולג'י. כאן נתאר את פרוטוקול שיטה סופר-רזולוציה מיקרוסקופיה קונבנציונאלי המבוסס באופן כמותי לקבוע לוקליזציה תת-גולג'י של חלבון.
המטרה הכוללת של שיטה מבוססת הדמיה זו היא למקם כמותית חלבון גולג'י ברזולוציה ננומטרית. שיטה זו יכולה לסייע במענה על השאלות המרכזיות בחקר מכשיר הגולגי, כגון ארגון הגולגי ואופן פעולתו. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא משתמשת במיקרוסקופ אור קונבנציונלי ובכלי תוכנה.
כדי להתחיל, תרב תאי HeLa בבקבוק T25 ב-DMEM בתוספת 10% FBS ודגר את התרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני. כאשר התאים מגיעים לכ-80% התנגשות, שאיפו את מדיום התרבית והוסיפו מיליליטר אחד של 25% טריפסין EDTA לבקבוק. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות.
הסר את התאים מהאינקובטור והוסיף מיליליטר אחד של מדיום שלם כדי לשטוף בעדינות את התאים מדופן הבקבוק. העבר את התאים המנותקים לצינור צנטריפוגה סטרילי וסובב את הצינור ב-500 גרם למשך שתי דקות כדי לפלוט את התאים. לאחר שאיפת הסופרנאנט, השתמשו במיליטר אחד של מדיום שלם כדי לתלות את כדור התא.
הסר את המדיום מהבאר של לוח עם 24 בארות המכיל כיסוי זכוכית מחוטא וזרע כ-100,000 תאים לתוך הבאר. השתמש במדיום מלא כדי להעלות את נפח הבאר ל-5 מיליליטר. לאחר מכן, דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני.
כאשר התאים מגיעים ל-80% קונגלונסי, יש להשתמש ב-80 ננוגרם של GalT-mCherry וב-320 ננוגרם של DNA פלסמיד TPST1-EGFP ובמגיב טרנספקציה כדי להעביר את התאים בהתאם לפרוטוקול היצרן. לאחר דגירה של התאים במשך ארבע עד שש שעות, החליפו את המדיום והחזירו את התאים לאינקובטור למשך 12 שעות. שאופים את המדיום בבאר והוסיפו 5 מיליליטר של 33 מיקרומולד נוקודאזול המכיל מדיום שלם, ואז דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך שלוש שעות.
לאחר ניקוי החלקות כיסוי זכוכית לפי פרוטוקול הטקסט, השתמש פעם אחת ב-PBS המכיל 1 מיקרוגרם למיקרוליטר של BSA כדי לדלל חרוזי פלואורסצנט רב-צבעיים באורך 110 ננומטר עד 80 פעמים. מערבולת קצרה בצינור כדי לפזר את אגרגטים החרוזים. באמצעות קצה פיפטה, מרחו 60 מיקרוליטר של חרוזים מדוללים על משטח כיסוי נקי.
בחושך, הנח את הכיסוי בקערת 35 מ"מ וכסה אותה בנייר אלומיניום. ייבשו את הכיסוי בחושך במייבש שמחובר למשאבת ואקום. לאחר מכן השתמשו ב-50 מיקרוליטר של מדיום התקנה כדי להרכיב את המכסה על מגלש זכוכית.
כיסויי כיסוי נקיים כראוי חיוניים להסרת פסולת פלואורסצנטית. כדי לצלם חרוזים רב-צבעוניים בערוצים ירוקים, אדומים ואדומים רחוקים, בתחילת סשן ההדמיה, יש לצלם ערימות תלת-ממדיות של תמונות, תוך צילום שלושה חלקים מעל ומתחת למישור המוקד הטוב ביותר. שמור את הערימות כקבצי TIFF.
כדי לצלם מיני-סטאקים של גולג'י, השתמשו ב-TPST1-EGFP וב-GalT-mCherry המועברים בשקופיות מסומנות פלואורסצנטית, כדי למצוא תאים שמבטאים TPST1-EGFP ו-GalT-mCherry ברמה נמוכה או בינונית. רכוש ערימות תמונות תלת-ממדיות כפי שהודגם. כדי לנתח את התמונות, פתח את התמונה J, בחר קובץ, תמונה, פתח, כדי לפתוח סט של תמונות חרוזים המורכב משלושה קבצי TIFF.
בחר תמונה, מחסניות, פרויקט Z, כדי למקם בממוצע שלושה קטעים רצופים סביב החלק הממוקד ביותר בערוץ האדום. הזן את מספר החתך של slice start and stop slice ובין אפשרויות סוג ההקרנה, בחר את עוצמת הממוצע. צייר ROIs ברקע שאין בהם חרוזים בתמונה.
לאחר מכן בניתוח, הגדרת מדידות, בדוק רק ערך אפור ממוצע וסטיית תקן או SD. בצע ניתוח, מדידה, כדי לקבל את עוצמת הרקע הממוצעת והסטיית תקן. בחר תהליך, מתמטיקה, חיסור, כדי להחסיר את התמונה עם הערכים המתאימים של עוצמת הממוצע ברקע ועוד פי שישה מהסטיית התקן. ואז הזן את הערך המחושב התואם לערוץ זה.
חזור על הממוצעת והחיסור עבור ערימות תמונת ערוץ ירוק ואדום רחוק על ידי שימוש באותו פרוסת התחלה ועצירה ואותו ROI ברקע. מאחד את שלוש התמונות המעובדות באמצעות תמונה, צבע, מיזוג ערוצים, על ידי בחירת ערוץ R כאדום, ערוץ G כירוק, וערוץ B ככחול. הפעל את מנהל ה-ROI על ידי בחירת ניתוח, כלים, ROI מנהל.
שרטט ROI מרובע סביב חרוזים בודדים. ואז להוסיף את התשואה למנהל ה-ROI על ידי לחיצה על T במקלדת. תחת ניתוח, הגדר מדידות, בדוק רק את מרכז המסה.
במנהל ה-ROI, בחר בערוץ R ולחץ על מדידה כדי לקבל את קואורדינטות X ו-Y של מרכזי ה-ROI בחלון התוצאות. העתק והדביק את שתי העמודות לגיליון אלקטרוני. קבל את הקואורדינטות של מרכזי ה-ROI עבור ערוץ G וערוץ B. שמור את הגיליון האלקטרוני כ-beads.csv.
בתמונה J, השתמש בהתקנת פלאגינים להתקנת שני המקרו, בדיקת ROI של מקרו, גולג'י, ROI ופלט מאקרו של נתונים בשלושה ערוצים. נקה את מנהל ההשקעה וחלון התוצאות. פתח סט של תמונות גולג'י מיני-סטאק המורכב משלושה קבצי TIFF.
צור תמונות רקע שהוחסרו כפי שהוצג קודם בסרטון לשימוש מאוחר יותר. ואז תשכפל את התמונות. תחת תהליך, מחשבון תמונה, הוסף את תמונות הרקע של ערוץ G, ערוץ R וערוץ B שהוחסרו.
לתמונה שהתקבלה תחת תמונה, כוון, סף, בחר להגדיר להזין אחד כרמת הסף הנמוכה ביותר. תחת ניתוח, ניתוח חלקיקים, הזן גם את טווח הגודל של פיקסל הגודל. הזן 50 לאינסוף, בדוק חריגות בקצוות, והוסף למנהל.
לאחר מכן, השתמשו בתמונה, צבע, מיזוג ערוצים, כדי למזג את שלוש תמונות הרקע שהוחסרו קודם לכן על ידי בחירת ערוץ R כאדום, ערוץ G כירוק, וערוץ B ככחול. לאחר מכן הרץ את בדיקת ה-ROI של מאקרו על ידי בחירת Plugins, Macro, Golgi ROI Inspection. חשוב לבחור כמה שיותר ROI שמכילים מיני-סטאקים בודדים של גולג'י בקבוצת תמונות.
תחת ניתוח, הגדר מדידות, בדוק רק שטח, ערך אפור ממוצע ומרכז מסה. רכישת נתונים על ידי הפעלת כלי המאקרו לפלט מאקרו של שלושה ערוצים. העתק את הקואורדינטות של המרכזים לגיליון אלקטרוני בסדר המפורט כאן.
ואז שמור את הגיליון כ-ministacks.csv. המשך לתיקון הזזה כרומטית של המרכזים וחישוב מנה לוקליזציה או LQ לפי פרוטוקול הטקסט. מיקרוסקופ אור מודרני ברמת מחקר, המצויד בעדשה אפוכרומטית פשוטה, כמו זו ששימש כאן, מציג הזזה כרומטית מינימלית.
עם זאת, בדיקה מדוקדקת של תמונת החרוז הצבעונית מגלה זאת. מרכזי הפלואורסצנציה האדומה מוגדרים כמיקומים האמיתיים של החרוזים. ההזזות הכרומטיות היחסיות של פלואורסצנציה ירוקה ואדומה רחוקה ניתנות לייצוג על ידי וקטורים.
השינוי הכרומטי במישור ההדמיה מודגם על ידי הווקטור הירוק והכחול לכל חרוז. כפי שמודגם כאן, תיקון היסט כרומטי מפחית משמעותית את ההזזה הכרומטית. בתאים יונקים, קומפלקס הגולג'י מצטבר באזור הפריק-גרעיני, שלרוב אינו ניתן לפירוק תחת מיקרוסקופ אופטי קונבנציונלי.
לאחר טיפול בנוקודאזול, קומפלקס הגולגי הפרי גרעיני נעלם ועשרות ערימות מיני גולג'י מתאספות באתרי היציאה של הרשתית האנדופלזמית לאורך כל הציטופלזמה. תמונה לדוגמה שנוצרה באמצעות ניתוח התמונה המוצג בסרטון הזה מוצגת כאן. באמצעות כלי בדיקת ROI מקרו גולג'י, נרשמו 40 מיני-סטאקים נבחרים של גולג'י.
לאחר יישום שלושת הקריטריונים, ניתנו לניתוח 21 ערימות מיני גולג'י לחישוב LQs של TPST1-EGFP. לאחר השליטה בטכניקה זו, ניתן לבצע אותה תוך שעה אחת לאחר סימון הפלואורסצנציה. לאחר פיתוחה, שיטה זו סללה את הדרך לחוקרים שחוקרים את מכשיר הגולג'י למקם כמותית חלבון גולג'י ברזולוציה השווה לזו של מיקרוסקופיה אימונואלקטרונית.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה למיקום כמותי של חלבוני גולג'י ברזולוציית ננומטרים באמצעות מיקרוסקופיה קונבנציונלית. הגישה נותנת מענה לשאלות מפתח הנוגעות לארגון ולתפקוד של מנגנון גולג'י.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- מדעי המוח
- טכניקות מיקרוסקופיה
רקע
- מערכת גולג'י ממלאת תפקיד קריטי בתפקוד התאי.
- הבנת המיקום של חלבוני גולג'י חיונית לחקר הארגון שלה.
- למיקרוסקופיה אופטית קונבנציונלית אין את הרזולוציה הדרושה כדי להדגים מבנים תת-גולג'יים.
- מחקר זה שואף להתגבר על מגבלות אלו באמצעות שיטת דימות חדשה.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה למיקום מדויק של חלבוני גולג'י.
- שיפור ההבנה של ארגון מנגנון גולג'י.
- שימוש במיקרוסקופיה קונבנציונלית לדמיון ברזולוציה-על.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- תרבתו תאי HeLa במצע DMEM עם 10% FBS.
- דגרו את התאים ב-37°C וב-5% CO2 עד להגעה ל-80% התמזגות (confluency).
- שאבו את המצע והוסיפו Trypsin EDTA לניתוק התאים.
- השתמשו בכלי תוכנה לניתוח תמונות ולאיתור (localization).
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת לוקליזציה של חלבונים בגולג'י ברזולוציה ננומטרית.
- היא מספקת תובנות לגבי הארגון של aparato גולג'י.
- מיקרוסקופיה קונבנציונלית יכולה להשיג רזולוציית-על באמצעות גישה זו.
- התוצאות תורמות להבנת תפקודים תאיים הקשורים לגולג'י.
מסקנות
- שיטה זו של דימוי יעילה לחקר מיקום של חלבוני גולג'י.
- היא מגשרת על הפער בין מיקרוסקופיה קונבנציונלית לבין טכניקות ברזולוציה-על.
- מחקרים עתידיים יכולים להשתמש בשיטה זו כדי לחקור תהליכים תאיים הקשורים לגולג'י.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למקבלי החלטות
מיקום כמותי של חלבוני גולג'י ברזולוציה ננומטרית נותן מענה לפער קריטי במיפוי תתי-אברונים לצורך גילוי מוקדם ותיקוף מטרות. שיטת ה-GLIM מאפשרת ניתוח מרחבי ברזולוציה גבוהה באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה סטנדרטית, ובכך תומכת בביטחון ניבוי במחקרי תעבורת חלבונים ותפקוד אברונים. יכולת זו משפרת את הפחתת הסיכונים המכניסטית ומספקת מידע לקבלת החלטות לגבי פורטפוליו בנקודת המפגש בין ביולוגיה של התא לבין גילוי תרופתי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר מיפוי כמותי של התפלגות חלבונים בתוך גוף גולג'י לצורך תיקוף פונקציונלי של מטרות.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי הבהרת הלוקליזציה של חלבוני מועמדים בתתי-אברונים.
- מקל על חקירה מונחית-השערות של נתיבי תובלה הרלוונטיים למודלים של מחלות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין מערכות תאיים שעברו תיקוף לסריקה המשכית של מווסתים של תהליכי תeובלה (trafficking).
- מספק מנוני לוקליזציה כמותיים להסטנדרטיזציה של תוצרי הבדיקה בין ניסויים שונים.
- מאפשר תהליכי עבודה של דימות ברזולוציה גבוהה הניתנים לשחזור, תוך שימוש בפלטפורמות מיקרוסקופיה קונבנציונליות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מיישר נתוני לוקליזציה תת-תאית עם פנוטיפים של תעתוע (trafficking) הרלוונטיים למחלה, במידה ורלוונטי.
- תומך ברצף מהשלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני על ידי אספקת מדדים מרחביים חסונים.
- מפחית את הסיכון התרגומי על ידי מתן אפשרות למיפוי מדויק של שינויים בלוקליזציה של חלבונים בתגובה להפרעות.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
GLIM משתלב ברצף הגילוי, החל ממחקרי מנגנונים מוקדמים ועד לתיקוף מודלים פרה-קליניים, תוך ניצול תשתית דימות סטנדרטית.
- ביולוגיה של גילוי: מספקת נתונים מרחביים כמותיים לבדיקת השערות והבהרת מסלולים.
- סריקה: סטנדרטיזציה של מדידות לוקליזציה כדי לאפשר הערכה אמינה של תרכובות.
- אנליטיקה: מייצרת מנות לוקליזציה וקואורדינטות מתוקנות של מרכז המסה לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מציעה המשכיות בהערכת סמנים ביולוגיים מרחביים במערכות מודל שונות כאשר הדבר נתמך בנתונים.
- שימוש חוזר ארגוני: מגדירה תהליך עבודה הניתן לשחזור ובעל יכולת הרחבה עבור לוקליזציה של תת-אברונים, הישים למגוון מטרות חלבוניות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות במחקרי תעבורת חלבונים.
- ערך תפעולי: מספק תוצאות כמותיות מהירות באמצעות מכשירים נגישים וניתוח סטנדרטי.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או עצירה (go/no-go) על ידי אספקת מדדים מרחביים חסונים לתיעדוף מטרות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר התקדמות מותאמת סיכונים על ידי הבהרת הלוקליזציה התת-תאית בהקשרים רלוונטיים למחלה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית ובניתוח תמונות כמותי.
- נדרש גישה למיקרוסקופים סטנדרטיים בעלי שדה רחב (wide-field) או מיקרוסקופי קונפוקאליים, ולתוכנה לעיבוד תמונות.
- דורש כיול קפדני לתיקון סטייה כרומטית והחסרת רקע.
- מפיק תועלת מסטנדרטיזציה של פרוטוקולי הדמיה וניתוח בין צוותים שונים.
- הרזולוציה וקצב העיבוד מוגבלים על ידי איכות מערכת ההדמיה ובחירה ידנית של ROI.
שאלות נפוצות בנושא ביו-פרמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:35
Cell Seeding
12:31
Conclusion
10:59
Results: Imaging the Golgi's Center of Fluorescence Mass
2:00
Cell Transfection and Nocodazole Treatment
7:57
Select and Measure Golgi Mini-stacks
4:36
Image Analysis, Acquire Centers of Fluorescent Beads
2:50
Image Acquisition of Multi-color Beads and Golgi Mini-stacks
