Morphometric ושיטת ניתוח הסלולר עבור המפרקתי הנמוך מאתר הלסת
11 בינואר 2018
כתב יד זה מציג שיטות לניתוח morphometric, שינויים סלולריים בתוך בעצם הלסת של מכרסמים.
המטרה הכללית של ניסוי זה היא לבחון את ההשפעות של עומס דחיסתי בסחוס המבני של השליש התחתון של הלסת התחתונה (mandibular condylar cartilage) בעכברים, באמצעות מדידות מורפומטריות בצילומי רנטגן ואנליזה היסטולוגית. מדדים אלו יכולים לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח הנוגעות לשינויים מבניים ותאיים בתוך השליש התחתון של הלסת התחתונה במכרסמים. היתרון המרכזי של הטכניקה המוצגת כאן הוא שניתן להשתמש בה כדי לנתח בעלי חיים קטנים אחרים בעלי שלד או כאלו המשתתפים בניסוי.
עבור פרוטוקול זה, הכינו לסני השכן מבודדים ומנוסחים שמוכנים לשימוש. העבירו את הלסניאות לתוך מערכת קבינה לצילומי רנטגן על גבי צלח פטרי. לאחר מכן, בצעו צילומי רנטגן במתח של 26 kilovolts למשך חמש שניות.
כעת, פתחו את התמונות בתוכנת הניתוח כדי לבצע מדידות מורפומטריות. ראשית, השתמשו בכפתור היחידות כדי להגדיר את סרגל הציר (scale bar). לאחר מכן, בחרו שש נקודות אנטומיות באמצעות סגנון סימון 2.
ראשית, בחרו את הנקודות האחוריות ביותר של תבלול הלסת התחתונה (mandibular condyle) כנקודה אחת. לאחר מכן, בחרו את בליטת החיתוך (incisored process) עבור נקודה שתיים. לאחר מכן, בחרו את הנקודה העמוקה ביותר במגרעת הסיגמואידית (sigmoid notch) עבור נקודה שלוש.
בשלב הבא, בחרו את הנקודה העמוקה ביותר בקיעור של זרוע הלסת התחתונה (mandibular ramus), נקודה ארבע, ולאחר מכן בחרו את הנקודה הקדמית ביותר של פני השטח המפרקייים של התהודה (condylar articular surface), נקודה חמש. כעת, בחרו את הנקודה האחורית ביותר של פני השטח המפרקייים של התהודה כנקודה שש והמשיכו בבדיקת מדידות אורך באמצעות כלי המדידה של האורך. לאחר מכן, השתמשו בכלי הקו המאונך מנקודות שלוש וארבע כדי למדוד את אורך ראש התהודה, שהוא אורך המאונך מנקודה אחת לקו שבין נקודות שלוש וארבע.
לאחר מכן, מדדו את אורך הלסת התחתונה, בין נקודות אחת ושתיים. לסיום, מדדו את רוחב ראש התהליך המפרקי (condyle head), שנמצא בין נקודות חמש ושש. כדי לשמור את הנתונים, העתיקו את רשימת המדידות בצד ימין של המסך.
לפני הטמעת הלסתות התשובות, אך שאינן דקלציפיות, השרה אותן למשך לילה בסוכרוז בריכוז 30% ב-PBS. למחרת, הסר בניתוח רקמות רכות עודפות וגזור בזהירות את התהודה המנדיבולרית (mandibular condyle). כעת, הנח את הדגימות בתבניות פלסטיק, כאשר הפני המדיאלי של התהודה פונה לבסיס התבנית והדגימה מקבילה לתחתית התבנית.
לאחר מכן, טבול אותם בשרף להטמעה וקרר את השרף באמצעות פיסת קרח יבש. בשלב הבא, מלא את התבניות עד הסוף בעוד שרף להטמעה. העבר אותם למתיל בוטאן דו-מתיל קר, שקולל באמצעות מקפיא או קרח יבש.
לאחר הקירור, יש לשמור את הדגימות בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס או 80- מעלות צלזיוס לצורך חיתוך. כדי לכמת את הביטוי של Col10a1 ב-MCC של חיתכים סגיטליים של קונדילים, יש לפתוח את התמונות ההיסטולוגיות בתוכנה לניתוח תמונות ולבחור את אזור העניין באמצעות כלי הלסו (lasso). במקרה זה, נבחר אזור ה-MCC.
שימו לב למספר הפיקסלים באזור, כפי שמופיע בתיבת ההיסטוגרמה. לאחר מכן, בחרו את הפיקסלים האדומים של Col10a1 על ידי התאמת טווח הצבעים. השתמשו בכלי הטפטפת כדי לבחור פיקסל אדום מהתמונה ולחצו על OK. לאחר מכן, רשמו את מספר הפיקסלים האדומים באזור, כפי שמופיע בתיבת ההיסטוגרמה.
שבריר הפיקסלים האדומים באזור מייצג את כמות הביטוי של Col10a1. כעת, באמצעות אותה טכניקה בסיסית, כמת את פעילות ה-TRAP ב-MCC ובעצם הסובכונדרלית. ראשית, בחר את הסחוס באזורי העצם הסובכונדרלית כאזורים לניתוח ורשום את סך הפיקסלים.
לאחר מכן, בחרו את הפיקסלים הצהובים שנוצרו על ידי תסבכת ה-ELF97. רשמו את מספר הפיקסלים החיוביים וחשבו את חלקם של הפיקסלים החיוביים ל-TRAP. כעת, כבדו את מספר התאים החיוביים ל-EDU שצבעו כנגד בכחול על ידי DEPI.
שוב, בחרו את אזור העניין ולאחר מכן כמתו את הפיקסלים הכחולים בתוכו. השתמשו בשיטה זו גם כדי לקבוע את מספר הפיקסלים החיוביים ל-EDU באותו אזור. מדידות מורפומטריות של עכברים, שהוכבלו לעומס דחיסה של ה-TMJ, הראו כי העומס הגדיל באופן משמעותי את אורך הלסת התחתונה ואת ראש העשן (condyle head).
עם זאת, העמסה לא הובילה לשינוי משמעותי ברוחב הקונדיל. כימות של פיזור הקולגן גילה עלייה משמעותית בביטוי של Col10a1 וב-MCC של הקונדילים בבעלי חיים שהועמסו. מנגד, ביטוי של Col2a1 לא היה שונה באופן משמעותי מקבוצת הביקורת.
פעילות TRAP עלתה באזור הסובכונדרלי של הקונדילים ובעכברים תחת עומס, וכך גם הפרוליפרציה. צביעת EDU מציינת את מספר התאים הפרוליפרטיביים. התפלגות הפרוטאוגליקן ב-MCC כוונתה על ידי הערכת השטח שנצבע ב-Toluidine blue ומפת המרחקים.
נרשמה עלייה משמעותית במיפוי המרחקים ב-MCC של הcondyles בקבוצה שהופעלה עליה עומס. עם זאת, שטח הצביעה של הפרוטאוגליקנים לא היה שונה באופן סטטיסטי בין הקבוצות. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של אופן ניתוח השינויים התאיים והמבניים ב-mandibular condyle של מכרסמים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
כתב יד זה מציג שיטות לניתוח שינויים מורפומטריים ותאיים בתוך התהליכ של הלסת התחתונה (mandibular condyle) של מכרסמים. המחקר מתמקד בהשפעות של עומס דחיסה בסחוס התהליכ של הלסת התחתונה בעכברים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי העצב
- ביולוגיה
- אורתופדיה
רקע
- הבנת שינויים מבניים ותאיים בלסת התחתונה היא קריטית למגוון מחקרים ביולוגיים.
- עומס דחיסה עשוי להשפיע על בריאות הסחוס ועל התפתחותו.
- מכרסמים משמשים כמודל לחקר שינויים אלה בשל הדמיות אנטומיות לבני אדם.
- ניתוחים רדיוגרפיים והיסטולוגיים חיוניים להערכת שינויים אלו.
מטרת המחקר
- לבחון את השפעותיה של העמסה דוחסת על סחס הcondylar של הלסת התחתונה.
- להשתמש במדידות מורפומטריות להערכת שינויים מבניים.
- לספק פרוטוקול שניתן להחיל על בעלי חיים קטנים אחרים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד וניתוח של לסתות עכבר.
- העברת הלסתות למערכת ארון רנטגן.
- דימות רדיוגרפי במתח של 26 kilovolts למשך חמש שניות.
- ניתוח היסטולוגי להערכת שינויים תאיים.
תוצאות עיקריות
- זיהוי שינויים מורפומטריים בקונודיל המנדיבולו (mandibular condyle).
- הערכה של שינויים תאיים עקב עומס לחיצה.
- הדגמת היעילות של טכניקות הדימות שנעשה בהן שימוש.
- יישומים פוטנציאליים של השיטות במחקרים אחרים בבעלי חיים קטנים.
מסקנות
- המחקר מספק תובנות בעלות ערך לגבי ההשפעות של עומס מכני על סחוס.
- ניתן להתאים את השיטות שפותחו ליישומים רחבים יותר במחקר ביולוגי.
- נדרש מחקר נוסף כדי לבחון השפעות ארוכות טווח של עומס דחיסה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
שיטה זו מאפשרת הערכה כמותית של התאמות מבניות ותאיות בקונידולה המנדיבולרית של עכברים תחת עומס דחיסה, ובכך מספקת מודל פרה-קליני למחקרי מכנו-ביולוגיה הרלוונטיים להפרעות במפרק הלסת (TMJ). באמצעות קישור גירויים מכניים לסממנים מולקולריים והיסטולוגיים, כגון ביטוי של Col10a1, פעילות TRAP והפצת פרוטאוגליקנים, הגישה תומכת בתיקוף מטרות במסלולי הומיאוסטזיס של סחוס. זרימת העבודה המורפומטרית והדימויית מציעה פלטפורמה ניתנת לשכפול ולהרחבה לצורך הפחתת סיכונים בהסברות טיפוליות בתהליכי התפתחות הלסת ובמצבים של אוסטאו-ארתריטיס.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של מסלולי התמרות מכניות (mechanotransduction) בסחוס המפרק הלסתני באמצעות כימות של ביטוי קולגן והתרבות תאית.
- ערך תפעולי: מספק מדדים מורפומטריים והיסטולוגיים סטנדרטיים לתיקוף מעורבות המטרה בתהליכי עיצוב מחדש של הסחוס.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר פלטיים כמותיים, כולל עוצמת פלואורסצנציה מבוססת פיקסלים ומיפוי מרחקים, לצורך הערכה הדירה של שינויים במטריקס החוץ-תאי.
- ערך תפעולי: משתמש בכלי דימיון נגישים (Digimizer, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית) להקמת בדיקות סטנדרטיות לניתוח קולגן ופרוטאוגליקנים במודלים של עצם קטנה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך במידול של תנאי העמסה של ה-TMJ הרלוונטיים למחלה, לצורך הערכת מנגנוני פירוק ותיקון של סחוס.
- ערך תפעולי: מקל על הערכה אורכית של התאמה מבנית ותגובה תאית במודלים של עכברים, מה שמאפשר רציפות פרה-קלינית.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי הגילוי על ידי אספקת נתונים מבניים ופנוטיפיים בשלב מוקדם, המנחים את בחירת המטרה ואת הפחתת הסיכונים המכניסטיים בביולוגיה של רקמת המפרק.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות על בקרה מכנית של התמיינות כונדרוציטים וייצור מטריקס באמצעות נקודות קצה מורפומטריות ומולקולריות כמותיות.
- סריקה: מאפשר מוכנות לבדיקה באמצעות כימות רדיוגרפי והיסטולוגי סטנדרטי של ממדי הקונדיל ומסמנים מולקולריים.
- אנליטיקה: מספק מדידות כמותיות הכוללות אורך ורוחב של הקונדיל, שבר פיקסלים חיוביים ל-Col10a1, פעילות TRAP וספירת תאים חיוביים ל-EDU לצורך ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין עומס מכני לתוצאות היסטולוגיות באזורי התגבשת תוך-סחוסית (endochondral ossification), ובכך תומך בתקפות פרה-קלינית.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתן להתאמה לעצמות אחרות של בעלי חיים קטנים ולאתרי התגבשות שונים, דבר המקדם סטנדרטיזציה בין פרויקטים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בתגובת הסחוס לעומס על ידי קורלציה בין שינויים מבניים למסמנים מולקולריים של היפרטרופיה ושחזור (remodeling).
- ערך תפעולי: מבטיח שחזור באמצעות פרוטוקולי דימות סטנדרטיים וכימות מבוסס תוכנה בין מעבדות.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של "המשך/עצור" (go/no-go) בתהליך תיקוף מטרות על ידי אספקת נתונים אובייקטיביים ומולטי-פרמטריים על הסתגלות רקמה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות מכנו-ביולוגיות המותאם לסיכון, בהתבסס על תוצאות פנוטיפיות כמותיות במודלים פרה-קליניים מתוקפים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בנתיצת מכרסמים, דימות רדיוגרפי וחיתוך היסטולוגי.
- תלוי בגישה למערכות דימות בקרני X, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ותוכנה לניתוח תמונות (למשל, Digimizer).
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולי הכנת הדגימות, הקיבוע (embedding) והחיתוך לצורך כימות מורפומטרי ותאי עקבי.
- התאמה לאתרי עצם אחרים מחייבת תיקוף של נקודות ציון אנטומיות והגדרות של אזורי העניין (region-of-interest).
- מגבלות מעשיות כוללות אילוצים של גודל הרקמה והצורך בטיפול זהיר כדי למנוע דה-קלציפיקציה במהלך ההכנה.
