בידוד ותרבות של עכברים ראשיים Keratinocytes מ neonatal ומבוגרים עור עכבר

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד קרטינוציטים ראשוניים של עכברים מעור יילודים או עכברים בוגרים מההתמיינות שלהם במבחנה או לחקור את התגובות החיסוניות המולדות שלהם לחשיפה ל-UVB. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של האפידרמיס לגבי אופן ויסות התמיינות הקרטינוציטים או כיצד קרטינוציטים אפידרמיסיים מגיבים לגירויים חיצוניים. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שניתן לבודד את הקרטינוציטים באופן קונבנציונלי מעור עכבר, יילודים ועכבר בוגר וכי ניתן לתרבת אותם עם הסרום שלנו.

מי שידגים איתי את ההליך יהיה פנגוו לי, עמית מחקר מהמעבדה שלי. התחל בהסרת הגפיים של פראי מסוג C57 BL6 ביום אפס לשני עכברים שלאחר הלידה, ממש מעל פרק כף היד הסתבך במפרקים וחתך את הזנב לחלוטין והשאיר כדור קטן. הכנס מספריים חדים דרך חור הזנב וחתוך את העור לאורך קו האמצע הגבי של הגוף עד לפתח בצוואר.

בעזרת מלקחיים אחד, אחוז בגוף החשוף והשתמש במלקחיים אחרים כדי לתפוס את העור. לאחר מכן מקלפים בעדינות את כל העור מהגוף ומעל גדמי הרגליים בתנועה מתמשכת אחת, תוך הקפדה לא לשבור את העור לחתיכות. שוטפים את העור הקלוף עם 50 מילימטרים של PBS סטרילי בצלחת פטרי של 10 סנטימטר ומכניסים את העור לצינור של שני מיליליטר המכיל קר כקרח, מאגר עיכול מפוזר, תוך הקפדה על כך שהעור לא מקופל.

לאחר איסוף כל יריעות העור של היילוד, הנח את הצינור על מסובב בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת בבוקר, הוציאו את תכולת הצינור לצלחת פטרי חדשה. לאחר מכן, העבירו כל פיסת רקמה לצלחת פטרי חדשה המכילה 50 מיליליטר PBS סטרילי כדי להסיר כל דיספוז עודף.

השתמש בשני מלקחיים, הניח את דגימות העור בכלי פטרי בודדים, צד האפידרמיס כלפי מטה ומתח בזהירות את קפלי העור כך שהחלקים יוארכו במלואם על תחתית הכלים. הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת עיכול מבוססת טריפסין לכל מנה והשתמש במלקחיים אחד כדי להרים לאט כל דרמיס למעלה והרחק מהאפידרמיס, תוך החזקת האפידרמיס במקומו עם מלקחיים שניים. צף את האפידרמיסים המבודדים בתמיסת הטריפסין כשמפלסי הבסיס פונים כלפי מטה וכסו את הכלים.

לאחר מכן דגרו את חתיכות העור על שייקר אופקי בטמפרטורת החדר, עם תסיסה עדינה למשך 20 דקות. בתום הדגירה, הוסף שני מיליליטר של מדיום גידול קרטינוציטים בתוספת לכל אפידרמיס לכל צלחת פטרי והשתמש במלקחיים כדי לשפשף במרץ את יריעות האפידרמיס ולשחרר את התאים הבודדים מרקמת העור. כאשר המדיום הופך עכור, הטה את הכלים כדי לאפשר איסוף והעברה של מתלי התאים לצינור חדש.

השארת רקמת האפידרמיס שנותרה בצלחת. לאחר הסבב השלישי של איסוף התאים, יש לשלש בעדינות את תרחיף התאים המאוגד כמה פעמים כדי לפרק את כל גושי התאים, ולסנן את התאים דרך מסננת של 100 מיקרון לצינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר. אסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ותלה בעדינות את הגלולה במיליליטר אחד של מדיום גידול קרטינוציטים קר על קרח, לספירה.

זרע את התאים בצפיפות של 5x10 עד סנטימטר רביעי בריבוע במצע גידול קרטינוציטים בכלים מתורבתים, מצופים מראש במוצר מטריצה חוץ-תאי המקדם חיבור תאים. לאחר מכן דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני, והחליפו את הסופרנטנט מדי יום במדיום טרי עד שהתאים הגיעו למפגש המתאים. כדי לבודד קרטינוציטים מעכבר בוגר, הסר תחילה את הזנב בבסיסו.

לאחר מכן הסרה של כשני מילימטרים מקצה הזנב כך שיהיה חור גלוי. השתמש בלהב חד כדי לחתוך לאורך עור הזנב מהבסיס ועד הקצה. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים אחד כדי לתפוס את עצם הזנב החשופה ומלקחיים אחרים כדי לתפוס את העור, קלף בעדינות את רקמת העור מהעצם בתנועה מתמשכת אחת.

חותכים את העור הקלוף בקו האמצע, כך שכל חתיכה תהיה באורך של פחות משניים עד שלושה סנטימטרים, ושוטפים את החלקים ב -15 מיליליטר PBS סטרילי בצלחת פטרי של 10 סנטימטרים. הנח את הקליפות עד חמישה זנבות לתוך צינור של 15 מיליליטר המכיל עד 12 מיליליטר קר כקרח, פיזר את מאגר העיכול ודגר את הקליפות למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס, עם סיבוב. למחרת בבוקר, בודדו את תאי האפידרמיס מיריעות העור המעוכלות חלקית, כפי שהודגם זה עתה עבור דגימות העור של היילודים.

לאחר מכן זרעו את תאי הקרטינוציטים הבוגרים המבודדים בצפיפות רבועה של 1x10 עד לסנטימטר החמישי במדיום גידול קרציטים בכלי תרבית מצופים מראש בקולגן. החלפת הסופרנטנט מדי יום, עד שהתאים מגיעים למפגש המתאים. כדי לגרום להתמיינות הסופית של כל אחד מסוגי תרבית הקרטינוציטים, הוסף סידן כלורי לתאים בריכוזים של 2 ננו-מולרים.

למוות הנובע מקרינת UVB, החלף את מצע הגידול מתרבית קרטינוציטים קונפלונטית, ב-500 מיקרוליטר של PBS וחשוף לזמן קצר את התאים ל-15 מילי-ג'אול לסנטימטר רבוע של UVb. החלף את ה- PBS במצע גידול טרי והחזיר את התאים לחממת תרבית התאים למשך שש שעות. לאחר איסוף המדיום המותנה בכל נקודת זמן ניסויית, כמת את כדאיות התא על ידי ערכת ספירת התאים מסייע לבדיקת כדאיות, בהתאם להוראות היצרן.

לאחר מכן מדוד את ה-TNL לשחרור על ידי הקרטינוציטים המוקרנים לתווך מותנה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. הקרטינוציטים האפידרמליים של המצב הראשוני מצופים ומתוחזקים ב-06 ננו-מולרי סידן כלוריד, גדלו כשכבה חד-שכבתית כאשר התאים הבודדים מציגים צורה מצולעת עם חללים בין-תאיים מובהקים ומפגינים מראה כללי מרוצף כאשר הם מתכנסים. העלאת הסידן כלורי ל-2 מילי-מולר, גורמת לשינוי מורפולוגיה מהיר בתאים.

כאשר התאים הופכים שטוחים והמרחב הבין-תאי המובהק הופך פחות בולט תוך שמונה שעות. וההידבקות בין התא לתא בין הצמתים ההדוקים הופכת בולטת יותר תוך 24 שעות. לאחר 48 עד 72 שעות, היווצרות מעטפת התא המקורנית וריבוד התא האנכי, ניכרים.

צביעת פלואידין של קרטינוציטים שטופלו בסידן גבוה, חושפת היווצרות של הקרנות פילופודיות עשירות בסיבי אקטין בין תאים סמוכים, כבר שלוש שעות, לאחר החלפת סידן. בין שש ל-24 שעות, ניכר שיפוץ נוסף של סיבי אקטין. עם הכמות הבולטת של ריבוד התאים הנראית לעין 48 שעות לאחר חשיפה גבוהה לסידן.

קרינת UVb מעוררת את מוות התאים התלוי בזמן של תרביות קרטינוציטים כפי שמעידים הן הדמיית ניגודיות פאזה והן בדיקת כדאיות התא. ואכן, עד 24 שעות, כמעט כל התאים נעשים מעוגלים ומנותקים, ונמדדים כבלתי כדאיים על ידי בדיקת כדאיות התא. ככל הנראה בשל הרמות הגבוהות של TNF אלפא, שהוקל על ידי הקרטינוציטים, בתגובה לחשיפה ל-UVB.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שכדי לשמור על הקרטינוציט המנותק על הקרח כל הזמן ולצלחת את התאים בהקדם האפשרי כדי למנוע התמיינות סופית של התאים המבודדים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה האפידרמיסית לחקור את תפקידם של קרטינוציטים בהתפתחות העור ובהגנה חיסונית מולדת של העור. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד ולתרבית קרטינוציטים אפידרמיסיים ראשוניים מעור עכבר יילודים או מבוגרים.