הקרנת חלקיקים ביואקטיביים בתאי החיסון Phagocytic עבור מעכבי איתות כמו קולטן איתות

המטרה הכוללת של הליך סינון זה היא לזהות ננו-חלקיקים ביו-אקטיביים חדשים שיכולים לעכב איתות קולטנים דמויי טול. שיטה זו יכולה לעזור לך לזהות פיזית ננו-מעכבים חדשים המכוונים לאיתות קולטנים דמויי אגרה בתאי חיסון מולדים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מהירה וחזקה וקלה לביצוע באמצעות מערכות תאים מדווחים.

היישומים של טכניקה זו מתרחבים לטיפול במחלות דלקתיות רבות מכיוון שאיתות קולטנים דמויי טול נמצא מעורב בפתוגנזה של מחלות אלה. למרות ששיטה זו יכולה לספק סינון גבוה וננו-חלקיקי זהב, ניתן ליישם אותה גם על מערכות ננו-חלקיקים אחרות כמו גם על מולקולות קטנות טיפוליות והביולוגיות. כדי להתחיל בהליך זה, הכינו את אמצעי התרבות כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

לאחר מכן, הוסף 100 מיליליטר מים טהורים במיוחד ללא אנדוטוקסין לבקבוק זכוכית נקי של 125 מיליליטר. יש להוסיף שקית אחת של אבקת מצע פוספטאז אלקליין עוברי מופרש, ולסובב את התמיסה בעדינות עד להמסה מלאה. דגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה כדי להבטיח פירוק מוחלט של המצעים.

בעזרת קרום של 0.2 מיקרומטר, סנן את התמיסה. יש לאחסן בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד שמוכן לשימוש. לאחר מכן, הוסיפו שקית אחת של אבקת מצע לוציפראז לשפופרת צנטריפוגה של 50 מיליליטר המכילה 25 מיליליטר מים טהורים במיוחד ללא אנדוטוקסין.

לאחר שהאבקה נמסה לחלוטין, יש לאחסן בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד שבוע עד שתהיה מוכנה לשימוש. לאחר מכן, הכן את פתרונות המלאי של כל הריאגנטים האחרים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר התרבות והכנת התאים, העבירו אותם מבקבוק התרבות לצינור צנטריפוגה.

סובב את התאים ב -300 פעמים G למשך חמש דקות. לאחר מכן, השעו אותם מחדש במדיום R-10 בריכוז של 1 X 10 ל-6 תאים למיליליטר. הוסף כמות של תמיסת PMA לתרחיף התא כך שהריכוז הסופי הוא 50 ננוגרם למיליליטר.

שופכים את תרחיף התאים למאגר מגיב סטרילי. בעזרת פיפטה רב-ערוצית, העבירו 100 מיקרוליטר של מתלה התאים לכל באר של צלחת תרבית תחתונה שטוחה של 96 בארות. דגירה בחממת תרבית תאים למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, השתמש בשואב ואקום כדי להסיר בזהירות את מדיום התרבות. בעזרת מיקרוסקופ הפוך, בדוק את התאים כדי לוודא שהמקרופאגים הנגזרים נדבקים בתחתית הבאר. שטפו בעדינות את התאים פעמיים באמצעות 100 מיקרוליטר PBS לבאר לכל שטיפה.

לאחר מכן, הוסיפו 100 מיקרוליטר מדיום R-10 טרי לכל באר. תנו לתאים לנוח יומיים באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לפני ביצוע בדיקת הכתב. ראשית, קבע את מינון ה-LPS האופטימלי כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

לאחר מכן, הוסף 180 מיקרוליטר של תמיסת Quanti-Blue מחוממת מראש לכל באר של צלחת תחתונה שטוחה חדשה של 96 בארות. לאחר מכן, העבירו 20 מיקרוליטר של סופרנטנט מכל דגימה לצלחת. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה עד שעתיים כדי לאפשר לצבע להתפתח מוורוד לכחול כהה.

לאחר שהצפיפות האופטית היא מעל אחת, השתמש בקורא צלחות כדי לקבוע את הספיגה ב-655 ננומטר. כדי להתחיל בניתוח של הפעלת IRF, העבירו 10 מיקרוליטר של סופרנטנט טרי מכל דגימה לצלחת לבנה תחתונה שטוחה טרייה עם 96 בארות. בעזרת הזרקה אוטומטית, הוסף 50 מיקרוליטר מתמיסת הלוציפראז לכל באר.

לאחר מכן אסוף מיד את הזוהר היטב כדי לייצר עקומת תגובת מינון כדי לקבוע את ריכוז ה-LPS האופטימלי עבור סינון ננו-חלקיקים. לאחר מכן, צנטריפוגה 20 נפחים של התמיסה ההיברידית פפטיד-GMP בצינורות אפנדורף של 1.5 מיליליטר ב -18,000 פעמים G למשך 30 דקות. השליכו בזהירות את הסופרנטנטים.

העבירו את ההיברידיות לצינור טרי אחד ושטפו אותם פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS. לאחר מכן, השעו מחדש את הכלאיים השטופים בנפח אחד של מדיום R-10. מערבבים נפחים שווים של הכלאיים המרוכזים וה-LPS המכיל מדיום R-10 כך שהריכוז הסופי של ההיברידיות וה-LPS הוא 100 ננו-מולרי ו-10 ננוגרם למיליליטר, בהתאמה.

לאחר מכן, הסר את מדיום התרבות מצלחת תרבית המקרופאגים. הוסף 100 מיקרוליטר מתערובת ה-LPS ההיברידית לכל באר, עם שלושה שכפולים לכל מצב. כלול בקרה שלילית ובקרת LPS.

דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לאחר מכן, העבירו את המדיום של כל באר לצינור צנטריפוגה נפרד. צנטריפוגה את הצינורות בטמפרטורה של 18, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

מעבירים את הסופרנטנטים לצלחת תחתונה עגולה טרייה של 96 בארות. כדי להתחיל בבדיקת הכתב על דגימות אלה, הוסף 180 מיקרוליטר של תמיסת Quanti-Blue מחוממת מראש לכל באר של צלחת תחתונה שטוחה חדשה של 96 בארות. לאחר מכן, העבירו 20 מיקרוליטר של הסופרנטנטים מכל דגימה לצלחת זו.

דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה עד שעתיים עד שהצבע הכחול הכהה מתפתח לצפיפות אופטית מעל אחת. לאחר מכן, השתמש בקורא צלחות כדי להקליט את הספיגה ב-655 ננומטר. לאחר מכן, העבירו 10 מיקרוליטר של סופרנטנט טרי מכל דגימה לצלחת לבנה תחתונה שטוחה שקופה של 96 בארות.

בעזרת מזרק אוטומטי, הוסף 50 מיקרוליטר מתמיסת הלוציפראז לכל באר, ורשום מיד את הזוהר היטב. לאחר מכן, אמת את ההשפעה המעכבת של המועמדים הפוטנציאליים, והעריך את ספציפיות ה-TLR כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. במחקר זה, ההפעלה של NF-Kappa B AP1 מזוהה על ידי הבדיקה הקולורימטרית SEAP, שבה הפעלת TLR-4 על ידי LPS מביאה להפעלה של NF-Kappa B AP1 ולייצור SEAP.

ה-SEAP המשוחרר ממיר את המצע, מה שמוביל לשינוי צבע שהוא פרופורציונלי לכמות ה-SEAP המשתחררת בעת הגירוי. זה מכומת על ידי מדידת הספיגה ב-655 ננומטר. לאחר מכן, הפעלה בתיווך LPS של IRF הובילה לביטוי של לוציפראז, המזרז את המצע ליצירת זוהר.

ריכוז LPS אופטימלי של 10 ננוגרם למיליליטר נקבע מתגובות מינון אלה כדי לסנן ספרייה שהוקמה בעבר של היברידיות פפטיד-GMP. מכאן, מזוהה קבוצה של בני כלאיים ביכולתם החזקה לעכב הפעלה המופעלת על ידי LPS הן עבור NF-Kappa B AP1 והן עבור IRF. אימות הפעילות המעכבת הזו מראה שככל שריכוז ה-LPS עולה, ההשפעות המעכבות של ההיברידיות פוחתות, כצפוי.

לאחר מכן מבוצע אימונובלוטינג כדי לאשר את פעילות העיכוב. נראה כי ההכלאה המובילה מפחיתה זרחון p65, מעכבת פירוק אלפא I-Kappa B ומעכבת זרחון IRF3, מה שמאשר כי ההיברידית העופרת, P12, מסוגלת לעכב איתות TLR-4 המתווך LPS. חקירה נוספת מגלה כי P12 גם מפחית את איתות NF-Kappa B AP1 בתיווך TLR-2 ו-TLR-5, כמו גם הפעלת IRF בתיווך TLR-3, מה שמצביע על כך של-P12 יש פעילות מעכבת חזקה במסלולי TLR מרובים.

לאחר הליך זה, יש לבצע אמצעים אחרים כמו אימונובלטינג ובדיקת ציטוטוקסיות על מנת לאמת את תוצאות הבדיקה ולמנוע גילוי חיובי כוזב. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים אחרים בתחום הננו-רפואה לחקור ננו-מעכבים באיתות קולטנים דמויי טול כטיפולים מהדור הבא ואינפורמטיבי.