Name: A השתנה- Hybrid מערכת אחת עבור חלבון Heteromeric מורכבות- DNA אינטראקציה מחקרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: למדו שיטה מתקדמת לחקר אינטראקציות מורכבות בין חלבונים הטרומריים ל-DNA בשיטת שמרים אחד-היברידית מותאמת. שיטה זו מאפשרת זיהוי אינטראקציות הכוללות מספר חלבונים או גורמי שעתוק לחקירת גנומיקה תפקודית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לס&quot;ס ואנג, מ &#39;עמר וא&#39; גאלה לקריאה ביקורתית של כתב היד. מחקר שפורסם בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מספרי פרסים RO1GM067837 ו RO1GM056006 (כדי SAK). התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.

<html> 1. בניית וכתב פלסמיד ההכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR להגביר את אזורי האמרגן / &quot;שברי&quot; (רצוי ~ 250 - 500 BP) של ה- DNA היעד להיות מנותח עבור שיבוט נוסף לתוך וקטור כניסה באמצעות E. coli (TOP10). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם אישור רצף, subclone שיבוט חיובי ב וקטור ביטוי pGLacZi תואם 7 כפי שתואר לעיל 8 , 9 , 10 , 11 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את המתח שמרים עבור שילוב האמרגן (YM4271) על ידי רקומבינציה הומולוגיים של pGLacZi לייצר זן כתב השמרים כפי שתואר קודם לכן 12 , 13 . השינוי ואישור השלבים של זן שמרים עם אזור ה- DNA יחד עם המתכון של התקשורת לא מתואר כאן, כמו השלבים דומים פרוטוקול Y1H קלאסיהתחת = &quot;xref&quot;&gt; 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . PEXP-AD502 שליטה פלסמיד ניתן להשתמש למטרות הנורמליזציה בעוד quantifiying β-galactosidase פעילות כפי שתואר לעיל 8 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשכפל את TF או חלבון של עניין ולאחר מכן לשכפל את השותף אינטראקציה חלבון לתוך pDEST22 ו pDEST32ΔDBD (pDEST32 מינוס DNA מחייב דומיין) ביטוי וקטורים. השברים המרה שמרן מקדם שיבוטים TF משמשים בהמשך בפרוטוקול. </li></ol> 2. השתנה Y1.5H פרוטוקול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 1 (אחר הצהריים), להתחיל עם 5 מ&quot;ל של תרבות SD-Ura מ צלחת פטרי או מלאי גליצרול ו דגירה לילה ב 30 ° C שייקר. הערה: תרבות זו ניתן להתחיל מ צלחת טרי מפוספס או ישירות מתוך 25% או 30% גליצרול המניות של שמריםלשכפל עם קטע ה- DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 2 (אחר הצהריים), לחסן 10 מ&quot;ל של התקשורת YPDA עם 500 μL של תרבות לילה דגירה לילה ב 30 ° C שייקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 3 (מוקדם בבוקר וכל אחר הצהריים): הכינו תאים המוסמכים (מוקדם בבוקר). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 100 מ&quot;ל של התקשורת YPDA עם 2 מ&quot;ל של תרבות לילה דגירה של 30 ° C שייקר. לגדל את התרבות הטרייה עד OD 600 מגיע 0.4-0.8 (3-5 שעות). הערה: בדוק את OD 600 של התרבות לילה ולוודא כי נקודת המוצא OD 600 עבור שלב זה הוא 0.1 - 0.2. שימוש בתרבות מעל או מתחת לגיל יכול להאריך את הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 5 דקות ב 1000 xg ו 21 ° C. מחק את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש pellets ב 10 מ&quot;ל של מים סטריליים באמצעות מערבולת או pipetting למעלה ולמטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 5 דקות ב 1000 xg ו 21 ° C. מחק את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ReconstituTe ב 2 מ&quot;ל של Tris-Ethylenediaminetetraaceticacid (TE) / ליתיום אצטט (LiAc) באמצעות מערבולת או pipetting למעלה ולמטה. הערה: ראה מתכון TE / LiAc בטבלה 1 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 5 דקות 1000 xg ו 21 ° C. מחק את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re- להשעות גלולה ב 4 מ&quot;ל של TE / LiAc + 400 μL של סלמון זרע DNA (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל) pipetting למעלה ולמטה ולהמשיך לשלב הבא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Co- טרנספורמציה: הלם חום התאים (מאוחר אחר הצהריים) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפיץ 20 μL של תאים לכל היטב צלחת 96-היטב ערבוב (U-bottom). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 150 ng (~ 1.5 μL) כל אחד pDEST22: TF פלסמיד, pDEST32ΔDBD: TF פלסמיד ו PEXP-AD502 בתוספת pDEST32ΔDBD: TF (בקרת נורמליזציה) לבארות. הערה: תוצאות אופטימליות צפויות עם ~ 150 ng כל אחד pDEST22: TF ו pDEST32ΔDBD: TF פלסמיד להצלחה שיתוף השינוי. יכול להשתנות עם הבעות לבנות פלסמיד, ולכןצריך להיות מותאם עם כל ניסוי. עוד שליטה pDEST22-TF בתוספת pDEST32deltaDBD יכול גם להיכלל על פי שיקול דעתו של המשתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μL של TE / LiAc / פוליאתילן גליקול (PEG) לכל טוב ( לערבב שלוש פעמים ). הערה: ראה מתכון TE / LiAc / PEG בטבלה 1 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את הצלחת עם חותם לנשימה ו דגירה של 20 - 30 דקות (יכול להיות ארוך) ב 30 מעלות צלזיוס (ללא צורך תסיסה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הלם חום במשך 20 דקות ( דווקא ) ב 42 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט התאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 5 דקות ב 1000 xg ו 21 ° C. הסר supernatant באמצעות פיפטה רב. הוסף 110 μL של TE ומערבבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 5 דקות ב 1000 xg ו 21 ° C. הסר 100 μL של supernatant באמצעות פיפטה רב. Re- להשעות את גלולה עם האגרוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת תאים על SD-Trp-Leu צלחות אגר. דגירה צלחותב 30 ° C עד לשלב הבא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 5 (אחר הצהריים): להעביר את התאים על צלחות חדשות באמצעות פונצ&#39;ר / משכפל microplate. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים צלחת 96-סטרילי ערבוב גם (U- תחתית) עם 50 μL של TE באמצעות פיפטה רב ערוצי. טרום רטוב את האגרוף ב TE. הערה: את puncher או את שכבת microplate צריך להיות מעוקרים לפני שלב זה ולאחר מכן מאוחר יותר בפרוטוקול. הדרך הנפוצה של מעקר אגרופים כגון טבילה אותו באתנול (100%, לא בכיתה ביולוגיה מולקולרית) ולאחר מכן שריפת אותו אל הלהבה ניתן ליישם. המתן 1 דקות כדי לצנן את הסיכות puncher. זהירות: אם ביצוע עיקור על הספסל; ודא הספסל הוא מראש לנקות עם אתנול ללא חומר דליק סביב. ללבוש ציוד מגן אישי אישי (PPE). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פונץ מושבות מחדש להשעות צלחת TE- מלא. הערה: אם יש צמיחה חלקה על הצלחת, מושבות ניתן אגרוף ישירותכדי TE- מלא צלחת או לחילופין, מושבה אחת (במקרה של מושבות מרובות) יש לבחור באמצעות קיסם מעוקר לצלחת TE מלא ולאחר מכן אגרופים ניתן להשתמש לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר אותם על חדש SD-Trp-Leu אגר צלחות עבור כיסוי משטח אופטימלי. דגירה צלחות על 30 מעלות צלזיוס עד לשלב הבא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 7 (אחר הצהריים): להתחיל תרבות למדוד פעילות β-galactosidase. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים צלחת 96-סטרילי ערבובית (U-bottom) עם 50 μL של SD-Trp-Leu התקשורת באמצעות פיפטה רב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים בלוק סטרילי 96-סטרילי היטב עם 180 μL של SD-Trp-Leu התקשורת באמצעות פיפטה רב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום רטוב את האגרוף בתקשורת ולהעביר מושבות מן הצלחת μL 50 של התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 20 μL של שמרים ל 180 μL של SD-Trp-Leu התקשורת חותם את הבלוק עם חותם לנשימה. לִדגוֹרעבור 36 שעות ב 30 ° C שייקר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 9 (בוקר): הפעל את התרבות למדידה אנזימטית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 100 μL של התרבות 500 μL של התקשורת YPDA בבלוק מעוקרים היטב 96 היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את צלחת היטב מעוקר היטב עם חותם לנשימה ו דגירה של 3 - 5 שעות ב 30 מעלות צלזיוס עם תסיסה בסל&quot;ד 200 (עד 600 OD 0.3-0.6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש להשעות את התרבות ולהעביר 125 μL באמצעות פיפטה רב ערוצי על צלחת ספקטרופוטומטר (למדוד OD 600 ). הערה: זהירות: לא לוותר על הירידה האחרונה כדי למנוע בועות, אם OD 600 הוא מתחת 0.3 - 0.6, דגירה התאים הנותרים עבור 1 - 2 שעות יותר על פי הקריאה. התרבות 125 μL בשימוש בשלב זה ניתן להשליך או להעביר לראש המקורי עמוק לחסום לפי שיקול דעתו של המשתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים הנותרים בבלוק היטב לעומק במשך 10 דקות ב 3000 xg ו 21 ° C. הסר supernatanלא על ידי הפיכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μL של Z-buffer ו מערבולת. הערה: נא לראות את המתכון למאגר Z בטבלה 1 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 5 דקות ב 3000 xg ו 21 ° C. הסר supernatant על ידי היפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μL Z- חיץ ו מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את הצלחת עם רדיד איטום שיכול להתנגד להקפיא להפשיר מחזורי. בצע 4 מחזורים של הקפאה / הפשרה באמצעות חנקן נוזלי במכסה המנוע ולאחר מכן 42 מעלות צלזיוס באמבט מים (2 דקות כל אחד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 200 μL Z- חיץ / ביתא-mercaptoethanol (β-ME) / Ortho-nitrophenyl-β-galactoside (ONPG) (12 מ&quot;ל, 21 μL, 8.4 מ&quot;ג בהתאמה תניב פתרון 20 מ&quot;ל, תמיד להכין טרי ). הערה: ONPG ייקח קצת זמן כדי להמיס כראוי כדי להכין את הפתרון שעה לפני שמגיעים לשלב זה. ONPG משמש כמצע למדידת פעילות β-galactosidase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עד 17 - 24 שעות ב 30 ° C (לבדוק בין, אם צבע מפתחת קודם לכן יחסי ציבורלהמשיך לשלב הבא). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 10 (בוקר): עצור את התגובה למדוד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 110 μL 1M Na 2 CO 3 להפסיק את התגובה ואת זמן ההקלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 3000 xg ו 21 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 125 μL של supernatant באמצעות multichannel ולמדוד OD 420 . הערה: זהירות, לא לוותר על הירידה האחרונה כדי למנוע בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב פעילות β-gal: 1000 x OD 420 / (time (min) x volume (mL) x OD 600 בגיליון אלקטרוני. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Saghbini, M., Hoekstra, D., Gautsch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Media+formulations+for+various+two-hybrid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Media formulations for various two-hybrid systems.</a> Methods Mol Biol. 177, 15-39 (2001).</li>
<li>Reece-Hoyes, J. S., Marian Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+one-hybrid+assays%3A+A+historical+and+technical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Yeast one-hybrid assays: A historical and technical perspective.</a> Methods. 57 (4), 441-447 (2012).</li>
<li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li>
<li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tandem+Affinity+Purification+%28TAP%29+Method%3A+A+General+Procedure+of+Protein+Complex+Purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification.</a> Methods. 24 (3), 218-229 (2001).</li>
<li>Gavin, A. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+the+yeast+proteome+by+systematic+analysis+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes.</a> Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).</li>
<li>Tripathi, P., Carvallo, M., Hamilton, E. E., Preuss, S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+B-BOX32+interacts+with+CONSTANS-LIKE3+to+regulate+flowering%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis B-BOX32 interacts with CONSTANS-LIKE3 to regulate flowering.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 114 (1), 172-177 (2017).</li>
<li>Helfer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LUX+ARRHYTHMO+encodes+a+nighttime+repressor+of+circadian+gene+expression+in+the+Arabidopsis+core+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">LUX ARRHYTHMO encodes a nighttime repressor of circadian gene expression in the Arabidopsis core clock.</a> Curr Biol : CB. 21 (2), 126-133 (2011).</li>
<li>Pruneda-Paz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-scale+resource+for+the+functional+characterization+of+Arabidopsis+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors.</a> Cell Rep. 8 (2), 622-632 (2014).</li>
<li>Wanke, D., Harter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Plant+Regulatory+DNA+sequences+by+the+Yeast-One-Hybrid+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Plant Regulatory DNA sequences by the Yeast-One-Hybrid Assay.</a> Methods Mol Biol. 479, 291-309 (2009).</li>
<li>Klein, P., Dietz, K. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+DNA-Binding+Proteins+and+Protein-Protein+Interactions+by+Yeast+One-Hybrid+and+Yeast+Two-Hybrid+Screen%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of DNA-Binding Proteins and Protein-Protein Interactions by Yeast One-Hybrid and Yeast Two-Hybrid Screen.</a> Methods Mol Biol. 639, 171-192 (2010).</li>
<li>Breton, G., Kay, S. A., Pruneda-Paz, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Arabidopsis+Transcriptional+Regulators+by+Yeast+One-Hybrid+Screens+Using+a+Transcription+Factor+ORFeome%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of Arabidopsis Transcriptional Regulators by Yeast One-Hybrid Screens Using a Transcription Factor ORFeome.</a> Methods Mol Biol. 1398, 107-118 (2016).</li>
<li>Deplancke, B., Vermeirssen, V., Arda, H. E., Martinez, N. J., Walhout, A. J. M. <a target="_blank" href="http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/5/pdb.prot4590.full">Gateway-Compatible Yeast One-Hybrid Screens.</a> CSH Protoc. 2006 (5), (2006).</li>
<li>Deplancke, B., Dupuy, D., Vidal, M., Walhout, A. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gateway-compatible+yeast+one-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A gateway-compatible yeast one-hybrid system.</a> Genome Res. 14 (10B), 2093-2101 (2004).</li>
</ol>

המחברים אינם מכריזים על ניגוד עניינים.

ההליך הסטנדרטי הקיים של Y1H מתאים לזיהוי טרף חלבון בודד המחייב את הפיתיון הדנ&quot;א שלו. עם שינויים טכניים שונים, המערכת הקיימת כבר רתמה להגדרת רשתות רגולטוריות תמלוליות. עם זאת, TFs ידועים לתפקד כחלק ממכלול מורכב של שניים או יותר TFs או חלבונים, עם רק חלק TF מסוגל לחייב את ה- DNA. חלבונים או TFs אשר מחזיקים רק את תחומים מחייב חלבון וחסרים את היכולת לקשור ד.נ.א. נוטים יותר לעבוד במכלול, עדיף עם TF כי הוא מסוגל מחייב את הדנ&quot;א. תפוקה גבוהה המסכים באמצעות Y1H המסורתית מדי פעם מ...

<html> באופן כללי, כדי להבין אינטראקציות DNA- חלבון, assay Y1H היא המערכת המועדפת בהצלחה בשימוש במעבדה הגדרה 1 . Assay בסיסי Y1H כוללת שני מרכיבים: א) כתב עם דנ&quot;א של עניין בהצלחה משובטים במעלה הזרם של הגן קידוד חלבון הכתב; ו - ב) ביטוי ביטוי אשר יפיק חלבון היתוך בין TF של עניין ושדה ההפעלה שעתוק שעתוק (AD). ה- DNA של עניין הוא נפוץ המכונה &quot;פתיון&quot; בעוד חלבון היתוך המכונה &quot;טרף&quot;. בשנים האחרונות, גרסאות מרובות של assay Y1H פותחו כדי להתאים לצרכים ספציפיים עם היתרונות שלהם 2 . Assay Y1H הקיים יכול להיות מיושם בהצלחה לזהות ולאמת אינטראקציה של חלבון אחד בכל פעם עם הפיתיון DNA שלה, אבל חסר את היכולת לזהות אינטראקציות DNA חלבון heterodimeric או multimeric. &quot;השיטה המתוארת כאן היא גרסה שונה של Y1H הקיים החוקרים המאפשרים בו זמנית ללמוד חלבונים מרובים המחייבים את רצף ה- DNA שלהם היעד.המטרה של assay זה היא לבטא את החלבון של עניין עם תחום ההפעלה (pDEST22: TF) ולהעריך את ההפעלה של אזורי ה- DNA המועמד התמזגו לכתב בנוכחות ו / או היעדרות של שותף חלבון אינטראקציה (pDEST32ΔDBD-TF) במערכת שמרים.ה assay זה יאפשר לנו לקבוע אם האינטראקציה בין שני אלה חלבונים נדרשים להפעלת המטרה.זו מערכת תואמת שיבוט GATEWAY ולכן ניתן להשתמש בהגדרת מעבדה רגילה.זה מבוסס על שינוי ישיר, אשר מספק את הקלות של שיתוף טרנספורמציה של TFs שונים במערכת שמרים לכן, זוהי אסטרטגיה יתרון כדי לאמת את מתחמי חלבון מחייב את מטרות DNA אפשרי שלהם במבחנה מולקולרית ופונקציונלית אימות Fאו כל מערכת. טכניקות הנוכחי כגון טנדם זיקה טיהור (TAP) שיטות יקרים ועבודה אינטנסיבית, אך מאפשרים זיהוי של hetrocomplexes חלבון בקנה מידה גדול 3 , 4 , 5 . זה שונה שמרים אחד היברידית ניתן לבצע בהצלחה במסגרת מעבדה רגילה בקנה מידה קטן ( איור 1 ) והוא גם חסכוני. Assay Y1.5H יכול להקל על חוקרים ברחבי הקהילה לבדוק ולאמת את ההשערה שלהם לקראת הגדרת תפקידו של חלבון רב מחייב מורכבים היעד DNA משותף באמצעות מערכת heterologous. בהתבסס על הממצאים, ההשערה יכולה להיות מאומתת ב- vivo במערכת המחקר המועדפת. לאחרונה, השתמשנו בגישה זו כדי להגדיר את תפקידו של TF ואת אופן הפעולה שלה כדי להסדיר פריחה ב Arabidopsis 6 .

<table><tbody><tr><td>ערכת מערכת היברידית pDEST22 וקטור</td><td>Invitrogen</td><td>PQ1000101</td><td>Pro-Quest Two ערכת מערכת היברידית</td></tr><tr><td>pDEST32delatDBD</td> ערכת מערכת היברידית <td>Invitrogen</td><td>PQ1000102</td><td>Pro-Quest Two; ערכת מערכת היברידית זו השתנתה. זה pDEST32 מינוס דומיין מחייב DNA</td></tr><tr><td>pENTR/D-TOPO ערכת שיבוט</td><td>Invitrogen</td><td>K240020</td><td></td></tr><tr><td>YM4271 זן</td><td>Clontech</td><td>K1603-1</td><td>MATCHMAKER מערכת היברידית</td></tr><tr><td>אחת pEXP-AD502</td><td>Invitrogen</td><td>PQ1000101</td><td>Pro-Quest ערכת מערכת היברידית</td></tr><tr><td>שתיים GATEWAY LR Clonase II תערובת אנזימים</td><td>Invitrogen</td><td>11791020</td><td></td></tr><tr><td>YPDA media</td><td>Clontech</td><td>630410</td><td></td></tr><tr><td>SD-Agar</td><td>Clontech</td><td>630412</td><td></td></tr><tr><td>SD מינימלי מדיה</td><td>Clontech</td><td>630411</td><td></td></tr><tr><td>Uracil DO תוסף</td><td>Clontech</td><td>630416</td><td></td></tr><tr><td>טריפטופן Do תוסף</td><td>Clontech</td><td>630413</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Base Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>LiAc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4158</td><td></td></tr><tr><td>Saplmon זרע (10 מ"ג/מ"ל)</td> <td>Invitrogen</td><td>15632011</td><td></td></tr><tr><td>96 צלחת תחתונה עגולה</td><td>היטב Greiner bio-one</td><td>650101</td><td></td></tr><tr><td></td><td>PEG3350 Sigma-Aldrich</td><td>1546547</td><td></td></tr><tr><td>96 בלוק באר עמוק</td><td>USA Scientific</td><td>1896-2000</td><td></td></tr><tr><td>רדיד אטום</td><td>ארה"ב סיינטיפיק</td><td>2923-0110</td><td></td></tr><tr><td>Araseal</td><td>Excel Scientific</td><td>B-100</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>034461-100</td><td></td></tr><tr><td>ONPG</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>73660</td><td></td></tr><tr><td>Na2CO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223484</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</ תת>&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S3139</td><td></td></tr><tr><td>KCL</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83266</td><td></td></tr><tr><td>HCL</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA54-4</td><td></td></tr><tr><td>Drybath</td><td>Thermo Fischer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Voretx</td><td>Thermo Fischer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifgue</td><td>Eppendorf</td><td>צנטריפוגה 5810R</td><td></td></tr><tr><td>קורא צלחות</td><td>מכשיר</td><td></td> מולקולרי <td>SPECTRAMAX PLUS ספקטרופוטומטר</td></tr> <tr><td>מיקרופלייטאינקובטור</td><td>תרמו פישר</td><td>דגם מס' 5250- 37 מעלות, 6250-30 מעלות</td><td></td></tr><tr><td>שייקר אינקובטור</td><td>אמבט מים ניו ברונסוויק</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>תרמו פישר</td><td>איזוטמפ 205</td><td></td></tr><tr><td>פאנצ'ר</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל פאלוקן</td><td>BD פלקון</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>בקבוק</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פלטות (150 מ"מ)</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a השתנה- hybrid מערכת אחת עבור חלבון heteromeric מורכבות- dna אינטראקציה מחקרים

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

במהלך השנים, השמרים assay אחת היברידית הוכיחה להיות טכניקה חשובה לזיהוי ואימות של אינטראקציות פיזיות בין חלבונים כגון גורמי שעתוק (TFs) ואת יעד ה- DNA שלהם. השיטה המוצגת כאן מנצל את המושג הבסיסי של Y1H אבל הוא שונה עוד יותר ללמוד ולאמת מתחמי חלבון מחייב את ה- DNA היעד שלהם. לפיכך, הוא מכונה שמרים שונה אחד היברידית (Y1.5H) assay. Assay זה הוא חסכוני וניתן לבצע בקלות במסגרת מעבדה רגילה. אם כי באמצעות מערכת heterologous, השיטה המתוארת יכול להיות כלי רב ערך כדי לבדוק ולאמת את החלבון heteromeric מורכבים מחייב יעד ה- DNA שלהם (ים) עבור גנומיקה תפקודית בכל מערכת של מחקר, במיוחד גנומיקה הצמח.

הצלחת הכללית הגדרת הליך עבור שיתוף טרנספורמציה של אזורי ה- DNA בתאים שמרים עם חלבון של עניין ( איור 2 ). הצלחת הגדרת יכול להיות שונה בהתאם לצורך של הניסוי ומספר אזורי DNA / שברי נבדק. לאחר יום 5 של פרוטוקול צלחת טובה מבוגר חיובי צריך להיות גלוי כמו באיור 3 . במחקר שלנו, באזור היזם של 2600 BP במעלה הזרם מתחילת האתר שעתוק להתחיל היה מחולק לששה אזורים או שברי (FR 1-6) 6</sup...

שמרים שונה אחד assay היברידית שתוארו כאן היא הרחבה של שמרים קלאסיים אחד היברידית (Y1H) assay ללמוד ולאמת את האינטראקציה מורכבים חלבון ה- DNA heteromeric במערכת heterologous עבור כל מחקר גנומי פונקציונלי.

A השתנה- Hybrid מערכת אחת עבור חלבון Heteromeric מורכבות- DNA אינטראקציה מחקרים

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא לחקור ולתקף את האינטראקציה בין קומפלקס חלבונים הטרומרי ל-DNA במערכת הטרולוגית עבור כל מחקר גנומי תפקודי בסביבת מעבדה רגילה. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח בתחום הגנומיקה התפקודית, כגון גנומיקה תכנונית. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מזהה אינטראקציות בין חלבונים ל-DNA המערבות יותר מחלבון אחד או גורם שעתוק אחד.התחילו את הפרוצדורה לאחר צהריים של היום שיוגדר כיום הראשון. התחילו תרבית של 5 מיליליטר במצע synthetic defined או SD ללא uracil מתוך צלחת פטרי ששורקה לאחרונה. דגרו למשך לילה במלקוח בטמפרטורה של 30 degree Celsius.בצהרי היום למחרת, יש להחדיר 500 µL מהתרבית של הלילה ל-10 mL של מצע YPDA ולהדגיר למשך לילה במנער בטמפרטורה של 30 °C. בשעות הבוקר המוקדמות של היום הבא, יש להחדיר 2 mL מהתרבית של הלילה ל-100 mL של מצע YPDA. יש לגדל תרבית רעננה זו בטמפרטורה של 30 °C עד שהצפיפות האופטית ב-600 nm תגיע ל-0.4 עד 0.8.סבבו בצנטריפוגה במהירות של 1000 ×g ובטמפרטורה של 21 °C למשך 5 דקות. השליכו את תסמיך העל. הוסיפו 10 milliliters של מים סטריליים והשביו את המשקע למצבו המקורי באמצעות וורטקס.סובב בצנטריפוגה ב-1000 ×g ובטמפרטורה של 21 °C למשך חמש דקות. השלך את הנוזל העליון, הוסף 2 milliliters של TE lithium acetate, והחזר את המשקע למצב נוזלי באמצעות ערבוב ב-vortex. סובב בצנטריפוגה ב-1000 ×g ובטמפרטורה של 21 °C למשך חמש דקות.שפכו את הנוזל העליון. הוסיפו 4 milliliters של TE lithium acetate פלוס 400 µL של salmon sperm DNA והשאיבו את המשקע על ידי פיפוט למעלה ולמטה. התאים מוכנים כעת לטרנספורמציה כפי שמוצג במקטע הבא.טרנספורמציה משותפת של התאים מבוצעת בלוח ערבוב בעל 96 בארות עם תחתית בצורת U. ראשית, חלקו 20 µL של תאים כשירים לכל בארה בלוח בעל 96 בארות. לאחר מכן, הוסיפו לבארות 150 ng מכל אחד משני הפלסמידים ומבקרת הנורמליזציה.סכימה זו מציגה את סידור הפלטה הכללי לטרנספורמציה משולבת של תאי שמרים עם חלבון העניין. ניתן לשנות את סידור הפלטה בהתאם לצורכי הניסוי ולמספר אזורי ה-DNA או הפ фрагמנטים הנבדקים. הוסיפו 100 µL של TE lithium acetate polyethylene glycol לכל באר וערבבו שלוש פעמים באמצעות פיפטינג.כסו את הצלחת באטם נשמי והדגירו בטמפרטורה של 30 °C למשך 20 עד 30 דקות. בצעו הלם תרמי בטמפרטורה של 42 °C למשך 20 דקות בדיוק. לאחר ההלם התרמי, סבבו בצנטריפוגה ב-1000 ×g ובטמפרטורה של 21 °C למשך 5 דקות.השתמש בפיפט רב-ערוצי כדי להסיר את העלייה. הוסף 110 µL של TE וערבב. סבב שוב בצנטריפוגה למשך 5 דקות.הסיר 100 µL מהנוזל העליון (supernatant) מכל באר. טבול מחורר ב-100% ethanol, עקר אותו בלהבה, המתן דקה עד שפיני המחורר יתקררו, ולאחר מכן השתמש במחורר הסטרילי כדי לסuspended את המשקע (pellet). העבר את התאים לצלחות agar מסוג SD tryptophan ו-lucine drop out.דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 30 °C למשך יומיים. אחר הצהריים של היום החמישי, הוציאו את צלחות המקדח מהמדגר. מלאו כל באר בלוח ערבוב סטרילי בעל 96 בארות עם תחתית בצורת U ב-50 µL של TE. הרטיבו מראש מחורר סטרילי ב-TE, חוררו את המושבות מתוך צלחת ה-SD שבה חסרים טריפטופן ולוסין, והשעיקו אותן בלוח המלא ב-TE.העבירו את המושבות לצלחות אגר SD חדשות, דלות בטריפטופן ובלוצין, כדי להשיג כיסוי פני שטח אופטימלי. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 30 degrees Celsius למשך יומיים. אחר הצהריים של היום ה-7, הוציאו את צלחות האגר מהדגירה.מלאו כל באער של פלטת ערבוב סטרילית בעלת 96 באערים עם תחתית בצורת U ב-50 microliters של מצע SD ללא tryptophan ו-lucine. מלאו כל באער של בלוק סטרילי בעל 96 באערים עמוקים ב-180 microliters של מצע SD ללא tryptophan ו-lucine. סטריליזו את המחורר, הרטיבו מראש את המחורר ואת המצע, והעבירו מושבות מהפלטה לבאערים המכילים כל אחד 50 microliters של מצע.העבר 20 µL של שמרים ל-180 µL של מצע SD ללא טריפטופאן ולוצין (tryptophan and lucine drop out medium). אטום את הבלוק באטימה נשמית, ודגרי ב-30 °C עם ניעור למשך 36 שעות. בבוקר של היום התשעה, העבר 100 µL מהתרבית ל-500 µL של מצע YPDA בבלוק סטרילי של 96 בארות עמוקות (deep well block).כסו באיטום נשמי והדגירו בטמפרטורה של 30 degrees Celsius עם ניעור במהירות של 200 rpm למשך שלוש עד חמש שעות. לאחר שלוש עד חמש שעות, השעו שוב את התרבית והעבירו 125 microliters מכל באר לפלטה לספקטרופוטומטר. מדדו את הצפיפות האופטית ב-600 nanometers כדי לוודא שהיא נסויה בין 0.3 ל-0.6.סבב במערך צנטריפוגה את התאים שנותרו בבלוק הבארות העמוקות במהירות של 3000 ×g ובטמפרטורה של 21 °C למשך 10 דקות. הסר את supernatant על ידי הפיכה. הוסף 200 µL של Z buffer לכל בארה ובצע vortex.סבבו בצנטריפוגה ב-3000 G ובטמפרטורה של 21 degrees Celsius למשך חמש דקות. הסירו את הנוזל העליון (supernatant) על ידי הפיכה. הוסיפו 21 µL של Z buffer לכל באער וערבבו באמצעות vortex.כסו את הפלטה בנייר אלומיניום לאטימה העמיד למחזורי הקפאה והפשרה. בתוך מCסת עבודה (fume hood), בצעו 4 מחזורי הקפאה/הפשרה באמצעות חנקן נוזלי ואמבט מים בטמפרטורה של 42 °C. הוסיפו 200 µL של תמיסת Z buffer beta mercaptoethanol ONPG שהוכנה טרי לכל באר.דגרו בטמפרטורה של 30 °C למשך 17 עד 24 שעות או עד להתפתחות צבע. בבוקר של היום ה-10, ודאו שהצבע התפתח. הוסיפו 110 µL של נתרבן כרבונט בריכוז 1 M לכל באר כדי לעצור את התגובה.יש לרשום את הזמן ולערבל את הפלטה במערבל Vortex. יש לצנטריפוג ב-3000 ×g ובטמפרטורה של 21 °C למשך עשר דקות. השתמשו בפיפט רב-ערוצי כדי להעביר 125 µL של עלהיל (supernatant) מכל באר לפלטה עבור ספקטרופוטומטר.מדוד את הצפיפות האופטית באורך גל של 420 ננומטרים. חשב את פעילות ה-beta galactosidase בגיליון אלקטרוני כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. במחקר זה, אזור הפרומטור באורך 2600 זוגות בסיסים במעלה הזרם מאתר תחילת השעתוק חולק לשש אזורים או מקטעים.תמונה זו היא דוגמה לצלחת עם צמיחה טובה ותוצאה חיובית לאחר היום החמישי של הפרוטוקול. בתוצאה מייצגת זו, מקטעי DNA מספר אחת וארבע מראים אינטראקציה חיובית עם קומפלקס החלבונים A ו-B. במדידת הפעילות של beta golactisidase, מקטע מספר אחת מראה השראה פי ארבעה של פעילות הגן המדווח.חשוב לזכור כי הליך זה מומלץ לקבלת מידע על אזורי DNA רק לאחר אישור האינטראקציה המוצעת בין חלבונים, והוא אינו נועד לספק מידע על אתרי מטרה. בעקבות הליכים אלה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון בדיקת chip ו-Msar, כדי להשיב על שאלות נוספות, לדוגמה, זיהוי אתרי המטרה in vivo.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו בוחנים ומאמתים את תפקידם של קומפלקסים של חלבונים מולטימריים הנקשרים למטרה משותפת של DNA.

a-modified-yeast-one-hybrid-system-for-heteromeric-protein-complex

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

מיתוס מאפשר זיהוי רגיש של אינטראקציות חולף ויציב בין חלבונים לידי ביטוי cerevisiae אורגניזם מודל Saccharomyces. זה כבר מיושם בהצלחה מחקר אקסוגניים ושמרים חלבונים בממברנה נפרד על מנת לזהות שותפים באינטראקציה שלהם באופן תפוקה גבוהה.

Split-יוביקוויטין ממברנה שמרים בהתבסס שני היברידי (מיתוס) מערכת: כלי רב עוצמה עבור זיהוי חלבונים אינטראקציות

אנחנו צריכים לשנות את השמרים קונבנציונאלי שני היברידית ההקרנה, כלי גנטי יעיל בזיהוי אינטראקציה חלבון. שינוי זה ניכר מקצרת את התהליך, מפחית את עומס העבודה, והכי חשוב, מפחיתה את מספר תוצאות חיוביות שגויות. בנוסף, גישה זו היא לשחזור ואמין.

השתנה שמרים-Two-Hybrid System כדי לזהות חלבונים אינטראקציה עם גורם הגדילה Progranulin

בסרטון זה, אנו מדגימים את בדיקת השמרים ההיברידית האחת, אשר מזהה חלבונים מרובים המקיימים אינטראקציה עם דנ"א המטרה. תאי השמרים שעברו טרנספורמציה מכילים את רצף דנ"א המטרה במעלה הזרם של הגן המדווח. בנוסף, הם מבטאים חלבונים של פקטור שעתוק. כאשר החלבונים יוצרים קומפלקסים ונקשרים לדנ"א המטרה, הגן המדווח מתבטא וניתן לזהותו באופן אנזימטי.

בדיקה היברידית שונה של שמרים-אחד לזיהוי אינטראקציות קומפלקס חלבונים הטרומריים-DNA

חלבונים מתקשרים זה עם זה ואינטראקציות אלה קובעות במידה רבה את תפקודיהם. ניתן לזהות שותפים לאינטראקציה עם חלבונים בתפוקה גבוהה in vivo באמצעות בדיקת כושר שמרים המבוססת על בדיקת השלמת שבר חלבון דיהידרופולאט רדוקטאז (DHFR-PCA).

הקרנת הגנום כל חלבונים אינטראקציה ידי חלבון-בר השלמה Assay (PCA) בתאים חיים

אוליגומריזציה של קולטן הריאנודין, תעלת יונים הומו-טטרמרי המתווכת שחרור Ca2+ ממאגרים תוך-תאיים, היא קריטית להתכווצות שרירי השלד והלב. כאן, אנו מציגים שיטות משלימות in vivo ו-in vitro לאיתור אסוציאציה עצמית של חלבון וקביעת סטוכיומטריה של הומו-אוליגומר.

גישות גנטיות ביוכימיים עבור<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; הערכת oligomerization חלבון: מקרה המבחן קולטן Ryanodine

חלבונים מפעיל בקטריאלי חשובים לקביעת זיהומים מוצלחים. פרוטוקול זה מתאר את זיהוי ניסיוני של שותפים מחייבים חלבוניים של חלבון מפעיל חיידקים המארחים הצמח הטבעי שלה. זיהוי אינטראקציות מפעיל אלה באמצעות השנייה היברידי מסכי שמרים הפך לכלי חשוב נפרם אסטרטגיות פתוגניות מולקולריות.

Unravelling תפקידו של מפעיל בקטריאלי מ פתוגן צמחים ללא לעיבוד בעזרת שמרי מסך דו-היברידי

עיבוד אצווה של שמרים 2-היברידית מסכים מאפשר השוואה ישירה של הפרופילים האינטראקציה של מספר חלבונים הפיתיון עם סט מורכב של חלבונים פיוז'ן טרף. כאן, אנו מתארים שיטות מעודן, ריאגנטים החדש וכיצד ליישם ושימושם עבור מסכי כזה.

מסך 2-היברידית שמרים אצווה כדי להשוות בין אינטראקציות חלבון

רצף עמוק של אוכלוסיות השמרים שנבחר עבור אינטראקציות חיוביות שמרים 2-היברידית פוטנציאל התשואות שפע של מידע אודות אינטראקציה שותף חלבונים. כאן, אנו מתארים את הפעולה של ביואינפורמטיקה ספציפי כלים ותוכנות מעודכן המותאם אישית כדי לנתח נתונים רצף כזה המסכים.

Informatic ניתוח של נתוני רצף אצווה שמרים 2-היברידית המסכים

כאן, נציג של שמרים משופר אחד-היברידית הקרנת פרוטוקול כדי לזהות את גורמי שעתוק (TFs) ניתן לאגד לאזור ה-DNA האנושי של עניין. שיטה זו משתמשת צינור ההקרנה תפוקה גבוהה אשר ניתן לחקור את הכריכה של &gt; 1,000 TFs בניסוי יחיד.

מסכי אחד-היברידית משופרת שמרים לזהות גורם שעתוק מחייב את רצפי דנ א אנושי

האינטראקציות של ביומולקולות, כגון אינטראקציות חלבון-חלבון, הן הבסיס המולקולרי של פונקציות ביולוגיות. אם ניתן לבודד מוטנטים ריקים/לקויים שחסרים באופן ספציפי את האינטראקציה הרלוונטית, הם יעזרו מאוד להבין את הפונקציות של אינטראקציה זו. מאמר זה מציג דרך יעילה לבודד מוטציות ריקות/לקויות אינטראקציה.

בידוד מוטנטים ריקים/לקויים באמצעות בדיקת שמרים דו-היברידית

למדו שיטה מתקדמת לחקר אינטראקציות מורכבות בין חלבונים הטרומריים ל-DNA בשיטת שמרים אחד-היברידית מותאמת. שיטה זו מאפשרת זיהוי אינטראקציות הכוללות מספר חלבונים או גורמי שעתוק לחקירת גנומיקה תפקודית.

A השתנה- Hybrid מערכת אחת עבור חלבון Heteromeric מורכבות- DNA אינטראקציה מחקרים

גלה סרטונים נוספים