A השתנה- Hybrid מערכת אחת עבור חלבון Heteromeric מורכבות- DNA אינטראקציה מחקרים

שמרים שונה אחד assay היברידית שתוארו כאן היא הרחבה של שמרים קלאסיים אחד היברידית (Y1H) assay ללמוד ולאמת את האינטראקציה מורכבים חלבון ה- DNA heteromeric במערכת heterologous עבור כל מחקר גנומי פונקציונלי.

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לחקור ולאמת את האינטראקציה בין קומפלקס חלבון הטרומרי ל-DNA במערכת הטרולוגית עבור כל מחקר גנומי פונקציונלי בסביבת מעבדה רגילה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הגנומיקה הפונקציונלית, כגון גנומיקה מתוכננת. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מזהה אינטראקציות DNA של חלבונים הכוללות יותר מחלבון אחד או גורם שעתוק אחד.

התחל הליך זה אחר הצהריים של מה שיוגדר כיום הראשון. התחל תרבית של 5 מיליליטר במדיום מוגדר סינטטי או SD ללא אוראציל מצלחת פטרי מפוספסת טרייה. דגירה למשך הלילה בשייקר של 30 מעלות צלזיוס.

למחרת אחר הצהריים, יש לחסן 10 מיליליטר של מדיום YPDA ב-500 מיקרוליטר של תרבית הלילה ולדגור למשך הלילה בשייקר של 30 מעלות צלזיוס. מוקדם בבוקר למחרת, יש לחסן 100 מיליליטר של מדיום YPDA עם 2 מיליליטר של תרבית הלילה. גדל את התרבות הטרייה הזו ב-30 מעלות צלזיוס עד שהצפיפות האופטית ב-600 ננומטר, מגיעה ל-0.4 עד 0.8.

צנטריפוגה ב 1000 פעמים G ו -21 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט. הוסף 10 מיליליטר מים סטריליים והרכיב מחדש את הגלולה על ידי מערבולת.

צנטריפוגה ב 1000 פעמים G ו -21 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. השליכו את הסופרנטנט, הוסיפו 2 מיליליטר של ליתיום אצטט TE והרכיבו מחדש את הגלולה על ידי מערבולת. צנטריפוגה ב 1000 פעמים G ו -21 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

השליכו את הסופרנטנט. הוסף 4 מיליליטר של ליתיום אצטט TE בתוספת 400 מיקרוליטר DNA של זרע סלמון והשהה מחדש את הגלולה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. התאים מוכנים כעת לטרנספורמציה כפי שמודגם בקטע הבא.

טרנספורמציה משותפת של התאים מתבצעת בצלחת ערבוב תחתית U של 96 באר. ראשית, יש לחלק 20 מיקרוליטר של תאים מוכשרים לבאר בצלחת 96 הבאר. לאחר מכן, הוסף לבארות, 150 ננוגרם כל אחד משני הפלסמידים ובקרת הנורמליזציה.

סכימה זו מציגה את הלוח הכללי שהוגדר לטרנספורמציה משותפת של תאי השמרים עם חלבון מעניין. ניתן לשנות את הגדרת הצלחת בהתאם לצורך הניסוי ולמספר אזורי ה-DNA או השברים שנבדקו. הוסף 100 מיקרוליטר של TE ליתיום אצטט פוליאתילן גליקול לבאר וערבב שלוש פעמים על ידי פיפטינג.

מכסים את הצלחת בחותם נושם ודוגרים בחום של 30 מעלות צלזיוס למשך 20 עד 30 דקות. הלם חום בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות בדיוק. לאחר הלם החום, צנטריפוגה ב 1000 פעמים G ו -21 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.

השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להסיר את הסופרנטנט. מוסיפים 110 מיקרוליטר TE ומערבבים. שוב צנטריפוגה למשך 5 דקות.

הסר 100 מיקרוליטר של הסופרנטנט מכל באר. טבלו אגרוף ב-100% אתנול, הדליקו אותו, המתינו דקה אחת עד שפיני האגרוף יתקררו, ולאחר מכן השתמשו באגרוף הסטרילי כדי להשעות מחדש את הגלולה. העבירו תאים לטריפטופן SD ולוצין נושרים צלחות מקדחה.

דגרו את הצלחות בחום של 30 מעלות צלזיוס למשך יומיים. אחר הצהריים של היום החמישי, הוציאו את צלחות המקדחה מהחממה. מלאו כל באר של צלחת הערבוב הסטרילית של 96 בארות ב-50 מיקרוליטר TE. הרטיבו מראש אגרוף סטרילי ב-TE, אגרפו את המושבות מצלחת הנשירה SD טריפטופן ולוצין, והשעו אותן מחדש בצלחת המלאה ב-TE.

העבירו את המושבות ללוחות מקדחים חדשים של טריפטופן SD ולוצין, לכיסוי משטח אופטימלי. דגרו את הצלחות בחום של 30 מעלות צלזיוס למשך יומיים. אחר הצהריים של היום השביעי, הוציאו את צלחות המקדחה מהחממה.

ממלאים כל באר של צלחת ערבוב סטרילית של 96 באר בתחתית U עם 50 מיקרוליטר של טריפטופן SD ומדיום נשירה של לוצין. מלאו כל באר של גוש באר סטרילי בעומק 96 ב-180 מיקרוליטר של טריפטופן SD ומדיום נשירה של לוצין. עקרו את האגרוף, הרטיבו מראש את האגרוף והמדיום, והעבירו מושבות מהצלחת לבארות שכל אחת מכילה 50 מיקרוליטר מדיום.

מעבירים 20 מיקרוליטר שמרים ל -180 מיקרוליטר של טריפטופן SD ולוצין נושרים מדיום. אוטמים את הבלוק בחותם נושם, ודוגרים בחום של 30 מעלות צלזיוס עם ניעור למשך 36 שעות. בבוקר היום התשיעי, העבירו 100 מיקרוליטר תרבית ל -500 מיקרוליטר של מדיום YPDA בגוש באר עמוק מעוקר של 96

מכסים בחותם נושם ודוגרים ב-30 מעלות צלזיוס עם תסיסה ב-200 סל"ד למשך שלוש עד חמש שעות. לאחר שלוש עד חמש שעות, השעו מחדש את התרבית והעבירו 125 מיקרוליטר מכל באר לצלחת ספקטרופוטומטר. מדוד את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר כדי להבטיח שהיא בין 0.3 ל-0.6.

צנטריפוגה התאים הנותרים בבאר העמוקה חוסמים ב -3000 פעמים G ו -21 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הסר את ה-supernatant על ידי היפוך. הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר Z לכל באר ומערבולת.

צנטריפוגה בחום של 3000 גרם ו -21 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. הסר את ה-supernatant על ידי היפוך. הוסף 21 מיקרוליטר של מאגר Z לכל באר ומערבולת.

מכסים את הצלחת בנייר כסף עמיד בפני מחזורי הפשרה בהקפאה. במכסה אדים, בצע 4 מחזורי הקפאה/הפשרה באמצעות חנקן נוזלי ואמבט מים של 42 מעלות צלזיוס. הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת Z buffer בטא מרקפטואתנול ONPG שהוכנה לאחרונה לכל באר.

יש לדגור בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 17 עד 24 שעות או עד להתפתחות הצבע. בבוקר היום העשירי, בדקו שהצבע התפתח. הוסף 110 מיקרוליטר של נתרן פחמתי מולארי אחד לכל באר כדי לעצור את התגובה.

רשום את השעה ומערבל את הצלחת. צנטריפוגה בטמפרטורה של 3000 פעמים G ו -21 מעלות צלזיוס למשך עשר דקות. השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להעביר 125 מיקרוליטר של סופרנטנט מכל באר לצלחת ספקטרופוטומטר.

מדוד את הצפיפות האופטית ב-420 ננומטר. חשב את פעילות בטא גלקטוזידאז בגיליון אלקטרוני כמתואר בפרוטוקול הטקסט. במחקר זה, אזור המקדם של 2600 זוגות בסיסים במעלה הזרם מתחילת אתר התחלת השעתוק חולק לשישה אזורים או שברים.

תמונה זו היא דוגמה לצלחת מגודלת וחיובית לאחר היום החמישי של הפרוטוקול. בתוצאה מייצגת זו, מקטעי DNA 1 ו-4 מראים אינטראקציה חיובית עם קומפלקס החלבון A ו-B. לאחר מדידת פעילות בטא גולקטיזידאז, מקטע 1 מראה אינדוקציה פי ארבעה של פעילות הגן המדווח.

חשוב לזכור כי הליך זה מומלץ לקבלת מידע על אזורי DNA רק לאחר אישור האינטראקציה המוצעת של חלבון החלבון ואינו נועד לספק מידע על אתרי היעד. בעקבות הליכים אלה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון בדיקת שבב ו-Msar על מנת לענות על שאלות נוספות. לדוגמה, זיהוי אתרי היעד in vivo.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבדוק ולאמת את תפקידם של קומפלקסים של חלבונים מולטימריים הנקשרים למטרה נפוצה של DNA.