A השתנה- Hybrid מערכת אחת עבור חלבון Heteromeric מורכבות- DNA אינטראקציה מחקרים

המטרה הכללית של ניסוי זה היא לחקור ולתקף את האינטראקציה בין קומפלקס חלבונים הטרומרי ל-DNA במערכת הטרולוגית עבור כל מחקר גנומי תפקודי בסביבת מעבדה רגילה. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח בתחום הגנומיקה התפקודית, כגון גנומיקה תכנונית. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מזהה אינטראקציות בין חלבונים ל-DNA המערבות יותר מחלבון אחד או גורם שעתוק אחד.

התחילו את הפרוצדורה לאחר צהריים של היום שיוגדר כיום הראשון. התחילו תרבית של 5 מיליליטר במצע synthetic defined או SD ללא uracil מתוך צלחת פטרי ששורקה לאחרונה. דגרו למשך לילה במלקוח בטמפרטורה של 30 degree Celsius.

בצהרי היום למחרת, יש להחדיר 500 µL מהתרבית של הלילה ל-10 mL של מצע YPDA ולהדגיר למשך לילה במנער בטמפרטורה של 30 °C. בשעות הבוקר המוקדמות של היום הבא, יש להחדיר 2 mL מהתרבית של הלילה ל-100 mL של מצע YPDA. יש לגדל תרבית רעננה זו בטמפרטורה של 30 °C עד שהצפיפות האופטית ב-600 nm תגיע ל-0.4 עד 0.8.

סבבו בצנטריפוגה במהירות של 1000 ×g ובטמפרטורה של 21 °C למשך 5 דקות. השליכו את תסמיך העל. הוסיפו 10 milliliters של מים סטריליים והשביו את המשקע למצבו המקורי באמצעות וורטקס.

סובב בצנטריפוגה ב-1000 ×g ובטמפרטורה של 21 °C למשך חמש דקות. השלך את הנוזל העליון, הוסף 2 milliliters של TE lithium acetate, והחזר את המשקע למצב נוזלי באמצעות ערבוב ב-vortex. סובב בצנטריפוגה ב-1000 ×g ובטמפרטורה של 21 °C למשך חמש דקות.

שפכו את הנוזל העליון. הוסיפו 4 milliliters של TE lithium acetate פלוס 400 µL של salmon sperm DNA והשאיבו את המשקע על ידי פיפוט למעלה ולמטה. התאים מוכנים כעת לטרנספורמציה כפי שמוצג במקטע הבא.

טרנספורמציה משותפת של התאים מבוצעת בלוח ערבוב בעל 96 בארות עם תחתית בצורת U. ראשית, חלקו 20 µL של תאים כשירים לכל בארה בלוח בעל 96 בארות. לאחר מכן, הוסיפו לבארות 150 ng מכל אחד משני הפלסמידים ומבקרת הנורמליזציה.

סכימה זו מציגה את סידור הפלטה הכללי לטרנספורמציה משולבת של תאי שמרים עם חלבון העניין. ניתן לשנות את סידור הפלטה בהתאם לצורכי הניסוי ולמספר אזורי ה-DNA או הפ фрагמנטים הנבדקים. הוסיפו 100 µL של TE lithium acetate polyethylene glycol לכל באר וערבבו שלוש פעמים באמצעות פיפטינג.

כסו את הצלחת באטם נשמי והדגירו בטמפרטורה של 30 °C למשך 20 עד 30 דקות. בצעו הלם תרמי בטמפרטורה של 42 °C למשך 20 דקות בדיוק. לאחר ההלם התרמי, סבבו בצנטריפוגה ב-1000 ×g ובטמפרטורה של 21 °C למשך 5 דקות.

השתמש בפיפט רב-ערוצי כדי להסיר את העלייה. הוסף 110 µL של TE וערבב. סבב שוב בצנטריפוגה למשך 5 דקות.

הסיר 100 µL מהנוזל העליון (supernatant) מכל באר. טבול מחורר ב-100% ethanol, עקר אותו בלהבה, המתן דקה עד שפיני המחורר יתקררו, ולאחר מכן השתמש במחורר הסטרילי כדי לסuspended את המשקע (pellet). העבר את התאים לצלחות agar מסוג SD tryptophan ו-lucine drop out.

דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 30 °C למשך יומיים. אחר הצהריים של היום החמישי, הוציאו את צלחות המקדח מהמדגר. מלאו כל באר בלוח ערבוב סטרילי בעל 96 בארות עם תחתית בצורת U ב-50 µL של TE. הרטיבו מראש מחורר סטרילי ב-TE, חוררו את המושבות מתוך צלחת ה-SD שבה חסרים טריפטופן ולוסין, והשעיקו אותן בלוח המלא ב-TE.

העבירו את המושבות לצלחות אגר SD חדשות, דלות בטריפטופן ובלוצין, כדי להשיג כיסוי פני שטח אופטימלי. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 30 degrees Celsius למשך יומיים. אחר הצהריים של היום ה-7, הוציאו את צלחות האגר מהדגירה.

מלאו כל באער של פלטת ערבוב סטרילית בעלת 96 באערים עם תחתית בצורת U ב-50 microliters של מצע SD ללא tryptophan ו-lucine. מלאו כל באער של בלוק סטרילי בעל 96 באערים עמוקים ב-180 microliters של מצע SD ללא tryptophan ו-lucine. סטריליזו את המחורר, הרטיבו מראש את המחורר ואת המצע, והעבירו מושבות מהפלטה לבאערים המכילים כל אחד 50 microliters של מצע.

העבר 20 µL של שמרים ל-180 µL של מצע SD ללא טריפטופאן ולוצין (tryptophan and lucine drop out medium). אטום את הבלוק באטימה נשמית, ודגרי ב-30 °C עם ניעור למשך 36 שעות. בבוקר של היום התשעה, העבר 100 µL מהתרבית ל-500 µL של מצע YPDA בבלוק סטרילי של 96 בארות עמוקות (deep well block).

כסו באיטום נשמי והדגירו בטמפרטורה של 30 degrees Celsius עם ניעור במהירות של 200 rpm למשך שלוש עד חמש שעות. לאחר שלוש עד חמש שעות, השעו שוב את התרבית והעבירו 125 microliters מכל באר לפלטה לספקטרופוטומטר. מדדו את הצפיפות האופטית ב-600 nanometers כדי לוודא שהיא נסויה בין 0.3 ל-0.6.

סבב במערך צנטריפוגה את התאים שנותרו בבלוק הבארות העמוקות במהירות של 3000 ×g ובטמפרטורה של 21 °C למשך 10 דקות. הסר את supernatant על ידי הפיכה. הוסף 200 µL של Z buffer לכל בארה ובצע vortex.

סבבו בצנטריפוגה ב-3000 G ובטמפרטורה של 21 degrees Celsius למשך חמש דקות. הסירו את הנוזל העליון (supernatant) על ידי הפיכה. הוסיפו 21 µL של Z buffer לכל באער וערבבו באמצעות vortex.

כסו את הפלטה בנייר אלומיניום לאטימה העמיד למחזורי הקפאה והפשרה. בתוך מCסת עבודה (fume hood), בצעו 4 מחזורי הקפאה/הפשרה באמצעות חנקן נוזלי ואמבט מים בטמפרטורה של 42 °C. הוסיפו 200 µL של תמיסת Z buffer beta mercaptoethanol ONPG שהוכנה טרי לכל באר.

דגרו בטמפרטורה של 30 °C למשך 17 עד 24 שעות או עד להתפתחות צבע. בבוקר של היום ה-10, ודאו שהצבע התפתח. הוסיפו 110 µL של נתרבן כרבונט בריכוז 1 M לכל באר כדי לעצור את התגובה.

יש לרשום את הזמן ולערבל את הפלטה במערבל Vortex. יש לצנטריפוג ב-3000 ×g ובטמפרטורה של 21 °C למשך עשר דקות. השתמשו בפיפט רב-ערוצי כדי להעביר 125 µL של עלהיל (supernatant) מכל באר לפלטה עבור ספקטרופוטומטר.

מדוד את הצפיפות האופטית באורך גל של 420 ננומטרים. חשב את פעילות ה-beta galactosidase בגיליון אלקטרוני כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. במחקר זה, אזור הפרומטור באורך 2600 זוגות בסיסים במעלה הזרם מאתר תחילת השעתוק חולק לשש אזורים או מקטעים.

תמונה זו היא דוגמה לצלחת עם צמיחה טובה ותוצאה חיובית לאחר היום החמישי של הפרוטוקול. בתוצאה מייצגת זו, מקטעי DNA מספר אחת וארבע מראים אינטראקציה חיובית עם קומפלקס החלבונים A ו-B. במדידת הפעילות של beta golactisidase, מקטע מספר אחת מראה השראה פי ארבעה של פעילות הגן המדווח.

חשוב לזכור כי הליך זה מומלץ לקבלת מידע על אזורי DNA רק לאחר אישור האינטראקציה המוצעת בין חלבונים, והוא אינו נועד לספק מידע על אתרי מטרה. בעקבות הליכים אלה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון בדיקת chip ו-Msar, כדי להשיב על שאלות נוספות, לדוגמה, זיהוי אתרי המטרה in vivo.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו בוחנים ומאמתים את תפקידם של קומפלקסים של חלבונים מולטימריים הנקשרים למטרה משותפת של DNA.