דור של כרומטין יליד Immunoprecipitation רצף ספריות לניתוח צפיפות נוקלאוזום

המטרה הכללית של נוהל זה היא להפיק ספריות ריצוף של שיקוע חיסוני של כרומטין במצבו הטבעי (native chromatin immunoprecipitation sequencing) לצורך ניתוח צפיפות נוקלאוזומים. שיטה זו יכולה לענות על שאלות בתחום האפיגנטיקה, כגון חשיפת מאפיינים אפיגנומיים באוכלוסיית תאים ברמת נוקלאוזום בודד ופירוק חתימות כרומטין הטרוגניות לרכיביהם הרציפים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא הניצול של תכונת ה-MNase לגישה מועדפת לאזורי כרומטין פתוחים, כדי להפיק מדידה המשלבת נגישות ל-MNase עם מודיפיקציות של היסטונים.

בדרך כלל, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו יתקשו להשיג עיכול MNase אופטימלי. התחילו את הפרוטוקול בהכנת תאים כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. ביום הראשון, הפשירו כל משק תאים באמבט מים של 37°C למשך 10 שניות.

לאחר מכן, העבירו את התאים לקרח. לכל משקע תאים, הוסיפו מיד בופר ליזיס (lysis buffer) בריכוז 1X קר מאוד בתוספת PIC בריכוז 1X, עד לריכוז סופי של 10,000 תאים ל-20 microliters. ערבבו 10 פעמים באמצעות פיפוט מעלה ומטה, תוך הקפדה שלא ייווצרו בועות.

בעבודה על קרח, העבירו מנות של 20 µL מכל אחד מהליזאטים שהתקבלו לבארות בלוח 96-בארות. כסו את הלוח בעטיפה פלסטית לפני דגירה על קרח למשך 20 דקות. סמנו את הלוח כ-MNase ורשמו את הבארות במפתח תבנית.

ממש לפני השלמת הליזיס של 20 דקות, מהלו את האנזים MNase one באמצעות תמיסת הדילול MNase one dilution buffer לריכוז סופי של 20 units per microliter ושמור אותו על קרח. בעבודה על קרח, הכן את תערובת המאסטר (master mix) לעיכול של MNase one כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, חלק 20 microliters של תערובת המאסטר לכל שורה של דגימות, בתוספת נפח עודף של חמישה microliters לתוך פלטת מאגר של 96 בארות.

לאחר סיום דגירה של הליזאטים, הוצא את פלטת עיכול ה-MNase מהקרח. באמצעות פיפט רב-ערוצי, הוסף 20 µL של תערובת מאסטר לעיכול MNnase לכל שורה של דגימות, וערבב על ידי שאיבה ופליטה (pipetting up and down) 10 פעמים. החלף את הטיפים בין השורות.

לאחר מכן, דגרו את הפלטה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות בדיוק. כדי להפסיק את התגובה לאחר חמש דקות, השתמשו בפיפט רב-ערוצי להוספת 6 µL של EDTA בריכוז 250 µM לכל שורת דגימות, וערבבו על ידי שאיבה ופליטה מספר פעמים. הקפידו להחליף טיפים בין השורות.

לאחר הוספת EDTA, שנו את הגדרת הפפטה ל-20 microliters, וערבבו 10 פעמים כפי שנעשה קודם לכן כדי להבטיח עצירה מלאה של תגובת העיכול. לבסוף, הוסיפו ששה microliters של 10X lysis buffer לכל שורה של הדגימות שעובדו עם MNase וערבבו היטב באמצעות שאיבה ופליטה (pipetting) 10 פעמים. כסו את הפלטה בכיסוי פלסטיק והדגירו על קרח למשך 15 דקות.

הכינו את פלטת קומפלקס הנוגדן-חרוזי ואת פלטת הטיהור המוקדם כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. בצעו ספינ מהיר לשתי הפלטות על ידי צנטריפוגה למשך 10 שניות ב-200 ×g. לאחר מכן, הניחו את פלטת קומפלקס הנוגדן-חרוזי על מגנט לפלטות והמתינו 15 שניות עד שהתמיסה תהפוך לצלילה. הסירו בזהירות והשליכו את העילאי באמצעות פיפטה מבלי להפריע לחרוזים.

לאחר מכן, הוצא את הפלטה מהמגנט של הפלטה ושמור אותה על קרח. הנח את פלטת תגובת הניקוי המוקדם (pre-clearing) על מגנט של פלטה והמתכן 15 שניות עד שהחרוזים יפרידו והתמיסה תהפוך צלולה. מבלי להפריע לחרוזים, השתמש בפפיטה כדי להעביר בזהירות את העלייה (supernatant) לבארות התואמות בפלטת קומפלקס הנוגדן-חרוז הנשמרת על קרח.

ערבבו בעדינות כל באר על ידי שאיבה והזרקה (pipetting) 15 פעמים. אטמו היטב את הפלטה באמצעות כיסוי אלומיניום והדגירו למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C על פלטפורמה מסתובבת. לאחר ההדגרה, סמנו מחדש את הפלטה כ-IP Reaction.

ביום השני, כוון את המערבל המחומם ל-65 °C, ולאחר מכן הכן על קרח תמיפת שטיפה עם ריכוז מלח נמוך ותמיפת שטיפה עם ריכוז מלח גבוה. בצע ספינ מהיר ללוח תגובת ה-IP למשך 10 שניות ב-200 ×g. הנח את לוח תגובת ה-IP על מגנט ללוחות והמתן 15 שניות עד שהתמיסה תהיה צלולה. באמצעות פיפט רב-ערוצי, ובלי להפריע לחרוזי המגנט, הסר בזהירות את הנוזל העליון והשליכו.

הסיר את הפלטה מהמגנט לפלטות והנח אותה על קרח. לכל שורה של דגימות בפלטת תגובת ה-IP, הוסף 150 µL של בופר שטיפה בעל מליחות נמוכה קרר בקרח, וערבב באיטיות למעלה ולמטה 10 פעמים כדי לסuspended את החרוזים באופן מלא. הנח את פלטת תגובת ה-IP בחזרה על המגנט לפלטות והסר את העל-נוזל כפי שנעשה קודם לכן.

לאחר מכן, החזיר את הפלטה לקרח וחזור על שלבי השטיפה עבור סך של שתי שטיפות. בעבודה על קרח, הוסף 150 µL של תמיפת שטיפה עם ריכוז מלח גבוה לכל שורה של דגימות בפלטת תגובת ה-IP. ערבב את הדגימות באיטיות על ידי פיפטאג מעלה ומטה 10 פעמים כדי להשעות את החרו지를 באופן מלא.

לאחר הסרת הנוזל העליון כפי שבוצע קודם לכן, הניחו את פלטת תגובת ה-IP על קרח והקפיאו מקדימה פלטת 96 בארות חדשה לצידה. לכל שורת דגימות בפלטת תגובת ה-IP, הוסיפו 150 µL של תמיסת השטיפה בעלת המלח גבוה ומעבדו באיטיות 10 פעמים באמצעות פיפטינג מעלה ומטה כדי להשעיות את החרוזים באופן מלא. לאחר ההשעיה, העבירו כל שורת דגימות לשורה התואמת בפלטת ה-96 בארות החדשה והמקולקרת.

השליכו את הפלטה הישנה. הניחו את פלטת תגובת ה-IP החדשה על מגנט הפלטות והשליכו את הנוזל העליון כפי שנעשה קודם לכן. שמרו את הפלטה בטמפרטורת החדר.

לכל שורה של דגימות בלוחית תגובת ה-IP, יש להוסיף 30 µL של ChIP elution buffer ולערבב בעדינות על ידי פיפוט למעלה ולמטה 10 פעמים. יש להימנע מיצירת בועות. אטמו את הלוחית עם כיסוי PCR והדגירו במערבל מחומם בטמפרטורה של 65 °C למשך שעה וחצי, במהירות ערבול של 1,350 RPM.

לאחר דגירה של שעה וחצי, סובבו את פלטת תגובת ה-IP במהירות של 200 ×g למשך דקה אחת בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הניחו את פלטת תגובת ה-IP על מגנט פלטות והמתינו עד שהתמיסה תהפוך לצלילה. באמצעות פיפט רב-ערוצי, ומבלי להפריע לחרוזי המגנט, העבירו בזהירות 20 µL מהעלה לפלטת 96 באריים חדשה, תוך שימוש בטיפים חדשים עבור כל שורה.

סמנו את הפלטה כ-IP Reaction והשאירו אותה בטמפרטורת החדר. המשיכו לעיכול החלבון ולאחר מכן לבניית הספרייה כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. מוצגים כאן תוצאות מייצגות של כרומטין שעבר עיכול بواسطة MNase באופן אופטימלי, עיכול חסר ועיכול יתר, לפני יצירת הספרייה.

בפרופיל העיכול האופטימלי שולטים גדלי פרגמנטים של נוקלאוזום בודד, תוך הימנעות מעיכול יתר כדי לאפשר השגה של פרגמנטים של נוקלאוזומים מסדר גבוה יותר. עיכול תת-אופטימלי של כרומטין יבוא לידי ביטוי גם בפרופיל של ספריית הרצף שנוצרה מחומר ה-IP. כדי לתקף את הספריות באמצעות qPCR, הוערך פי העשירה של ספריות IP ביחס לספריית הקלט (input) עבור יעדים חיוביים ושליליים.

בנוסף, בדיקה של הקריאות המיושרות (aligned reads) של ספריות עם העשרה גבוהה כפי שהוערכה ב-qPCR בדפדפן גנומי צריכה להראות העשרות שניתן לזהות ויזואלית בהשוואה לספריית הקלט (input library). ספריות ChIP-sequencing מוצלחות לצמיפות נוקלאוזומים יכילו חזרות בעלות מתאם גבוה, כאשר חלק משמעותי מהקריאות המיושרות נמצא בתוך שיאי העשרה שזוהו על ידי MACS2. לאחר שליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בתוך יומיים אם היא מבוצעת כראוי.

לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה כיצד להפיק ספריות ריצוף של שיקוע חיסוני של כרומטין (chromatin immunoprecipitation sequencing) במצב טבעי לצורך ניתוח צפיפות נוקלאוזומים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לוודא שהכרומטין עבר עיכול אופטימלי, ולהשתמש אך ורק בנוגדנים המראים זיקה גבוהה לאפיטופ הרלוונטי ומראים מעט או ללא תגובתיות צולבת עם אפיטופים אחרים. בעקבות פרוצדורה זו, ניתן לבצע מידול חישובי של נגישות ל-MNase כדי לענות על שאלות כגון חתימות אפיגנטיות הנובעות מהטרוגניות בתוך אוכלוסיית תאים.

שיטה זו מספקת תובנה לגבי ההשפעה הקומבינטורית של מיקום הנוקלאוזום והצפיפות המקומית, כמו גם לגבי מודיפיקציות פוסט-טרנסלציוניות של תתי-היסטוניהם, וניתן להחילה על כל מערכת, כגון אדם או עכבר, תאים ראשוניים ורקמות קפואות.