Name: משיכת ממברנה צינוריות מן שלפוחית Unilamellar ענק (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: למד שיטת משיכת ננו-צינוריות מממברנות ליפידיות לחקירת אינטראקציות חלבון-ממברנה מעוקלת. השיטה מאפשרת כימות קשרי חלבונים ומאפיינים מכניים של ממברנות בתהליכים כמו אנדוציטוזה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים תודה בנואה Sorre דמיאן Cuvelier, פייר Nassoy, פרנסואה Quemeneur, גיל Toombes על תרומתם חיוני להקים את שיטת nanotube בקבוצה. שייכת הקבוצה ת כדי consortium CNRS את CellTiss, את Labex CelTisPhyBio (ANR-11-LABX0038), פריז מדעי et פרסים (ANR-10-IDEX-0001-02). פ-סי Tsai מומן על ידי EMBO מלגת לטווח ארוך (ALTF 1527-2014) ופעולות מארי קירי (H2020-MSCA-אם-2014, פרוייקט ממברנה-אזרין-אקטין). טרשת נפוצה הוא עמית ג'וניור מהבחורים סימונס החברה של.

המחברים אין לחשוף.

השיטה של משיכת צינורות מן האנשים שנגדם מעניקה מידע עשיר על מערכת חלבון ממברנלי, זה לא רק אמצעי למדידת התכונות המכאניות הבסיסית של הקרום, אך זה עוזר לשפוך אור על המושבים בין חלבוני ממברנה עקמומיות. כפי שפורט במבוא, טכניקות אחרות קיימים כדי למדוד את ההשפעות של עיקול קרום חלבונים, על-ידי המקננת החלבונים עם תת מיקרון ליפוזומים קשור משטח passivated18,19 או על ידי התבוננות היווצרות ספונטנית של בקוריאנית ב micropipette aspirated האנשים שנגדם עם ההזרקה של חלבון<sup class...

תהליכים תאיים רבים, כגון אנדוציטוזה, סחר, היווצרות של filopodia, זיהום, וכדומה, מלווים בשינוי דרמטי הצורה של קרום התא1,2. בתא, מספר חלבונים להשתתף תהליכים אלה על ידי איגוד הקרום ושינוי הצורה שלהם. הדוגמאות הבולטים ביותר הם בני משפחת חלבונים Bin/Amphiphysin/מ א (בר), המכיל מאפיין מהותי מעוקל בר תחום3,4,5,6,7. בדרך כלל, הם אינטראקציה עם הקרום על-ידי שמירה התחום בר אל פני השטח, במקרים רבים, גם רדודות הוספת amphipathic helices bilayer. הצורה, בגודל תשלום של התחום בר יחד עם מספר amphipathic helices קובע: (1) לכיוון קרום עקמומיות (כלומר, אם הם יניעו invaginations או בליטות), (2) בסדר גודל של קרום עקמומיות5,8. ראוי לציין, כאן עקמומיות חיובית מוגדרת בתור הצד הקמור של קרום מעוקל, קרי, הבליטה כלפי בחלקיק אינטראקציה, ושליליות אחרת. יתר על כן, מחקרים כמותיים של בר חלבונים חשף כי השפעתם על הקרום תלויה סט של פרמטרים פיזיקליים: משטח צפיפות של חלבונים, מתח הממברנה ממברנה צורה (שטוח לעומת צינורי לעומת כדורית הצורה)7. בהתאם פרמטרים אלה בר חלבונים יכולים: (1) מתנהג כמו חיישנים עקמומיות ממברנה, (2) לכופף ממברנות או (3) זירוז ממברנה scission7.
בשל המספר העצום של רכיבים מעורב שינוי צורה קרום התא, לומד בהיבטים כמותיים של התופעה, כגון אנדוציטוזה, ויוו הוא מאוד מאתגר. במבחנה הכינון של רכיבים מינימלי מחקה מעוקל ממברנות התא מספק אמצעי כדי להשיג הבנה מכניסטית של איך מתעקל קרום חלבונים לפעול. מאמר זה מתאר פרוטוקול שתפעילי. מחדש ממברנה nanotube במבחנה באמצעות חוץ-גופית, מיקרוסקופיה קונפוקלית מלקחיים אופטיים. הגישה ניתן ללמוד, באופן כמותי, כמה חלבונים, שומנים, או מולקולות קטנות אינטראקציה עם ממברנות מעוקל. האנשים שנגדם השומנים משמשים כמודלים של קרום התא, עקמומיות של מי הוא זניח בהשוואה לגודל של מולקולות מתעקל ממברנה אינטראקציה. . הם מוכנים באמצעות שיטת electroformation9 שבו השלפוחיות המוגלתיות נוצרות על ידי לחות סרט השומנים ונפיחות זה לתוך האנשים שנגדם תחת זרם חילופין (AC)10. מצעים הנפוץ ביותר שבו גדלים כשמרוגזים לוחיות גם מוליך למחצה מצופה תחמוצת בדיל אינדיום (ITO) או פלטינה חוטים (Pt-חוטים)11. בעבודה זאת, האנשים שנגדם גדלים Pt-חוטים כמו בשיטה זו הוכח לעבוד הרבה יותר טוב מאשר החלופה בקבלת כשמרוגזים בנוכחות מלחים מאגר12. למרות פרוטוקול electroformation מתואר כאן בפירוט מספיק כדי לשחזר את הכל, אנו להפנות את הקורא למאמרי הקודם בו תוארו דומה ושיטות אחרות של עשיית כשמרוגזים פרט13,14. בידיים שלנו, electroformation-Pt-חוטים בהצלחה הניב כשמרוגזים שילוב של ליפידים סינטטי או טבעי השומנים תמציות במאגר המכיל ~ 100 מ"מ NaCl. יתר על כן, היה גם אפשר לתמצת חלבונים בתוך האנשים שנגדם במהלך צמיחה. תא electroformation לדוגמה מוצג איור 1A; היא כוללת שני ~ 10-ס מארוך Pt-חוטי מוכנס לתוך בעל עשוי טפלון (PTFE) זה יכול להיות אטום משני הצדדים עם coverslips זכוכית דקה ~ 1-2 סנטימטרים (איור 1 א').
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56086/56086fig1.jpg"> איור 1: הגדרת הניסוי. (א) electroformation בוס קאמרית עם מחברים חשמליים המוצמד Pt-חוטים. שמאל (B): מערכת ניסויית מציג את המיקרוסקופ, תא ניסיוני מעל המטרה, שני micropipettes (ימינה ושמאלה) לחבר micromanipulators ונוסף תא ניסיוני עבור צינור למשוך וחלבון זריקה. משמאל: מבט מקרוב על תא ניסיוני רכוב מעל המטרה מציג את הטיפים של השאיפה, את micropipettes הזרקה שנוספה. (ג) A המזרק המצויד מתקן דק מוכנס לתוך micropipette בקצה האחורי שלו. החלק התחתון הוא להציג מקרוב מנפק פנימה micropipette עם הקו המקווקו כחול חלוקה לרמות של micropipette. מערכת זו משמשת כדי למלא את micropipette עם קזאין passivate משטח זכוכית וגם בחזרה מילוי עם שמן מינרלי בעת הצורך. (ד) A מערכת המשמשת האחות µL כמויות של הפתרון חלבון. המחט מחוברת מזרק, אבובים אשר מחובר micropipette הזריקה. הטיפ micropipette בקפידה שקוע בתוך תמיסת חלבון, aspirated אז כדי למלא את הטיפ micropipette. Micropipette ואז בחזרה מלא שמן מינרלי באמצעות מערכת שמוצג בחלונית ג <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56086/56086fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
שפופרת הנאנו ממברנה, הנעות בטווח מ מ-7 nm מספר מאות ננומטר, יכול להיות משך של בוס על ידי כוח חיצוני. שיטה זו תוכנן בתחילה כדי למדוד את המאפיינים אלסטי של קרום התא ושלפוחיות, כגון ה15,כיפוף קשיחות16. בעבודותיו האחרונות, השיטה הוארך כדי ללמוד את האינטראקציה של חלבונים עם ממברנות מעוקל מאת microinjecting את החלבונים ליד ה-7,nanotube משך17. פותחו שיטות אחרות ללמוד מתעקל קרום חלבונים. בשיטה אחת, חלבונים מודגרת עם ליפוזומים בגודל שונה קשור משטח passivated. מיקרוסקופיה קונפוקלית משמש כדי למדוד את חלבון מחייב כפונקציה של ליפוזום קוטר, אשר יכולה להצביע על עקמומיות-induced המיון18,19. שיטה נוספת החלבונים מוזרקים סמוך בוס aspirated מיקרו כדי למדוד את היכולת שלהם באופן ספונטני זירוז בקוריאנית20,21. השיטה המתוארת ב פרוטוקול זה הוא לצורכיכם ללמוד מתעקל ממברנה החלבונים המעורבים אנדוציטוזה, שבו רוב החלבונים בדרך כלל המפגש ממברנה preformed צינורות חיבור של invagination ממברנה המכילים מטען עם קרום פלזמה שטוח המשמש כבסיס. יתר על כן, בשיטה זו, בניגוד ב וזמינותו עם עגינה ליפוזומים קטנים, nanotube ממברנה ללא הרף מחובר הקרום; לכן, זה שיווי משקל מכני עם הבוס, המצב צפוי ויוו. לפיכך, הממברנה הבסיסית פיזיקה חל, אנחנו יכולים להסיק שפע של תכונות מכניות שלנו מדידות22,23,24.
עבור יישום מלא של שיטה זו, הציוד הנדרש כולל מיקרוסקופ קונפוקלי מלקחיים אופטיים, micropipettes אחד או שניים מחובר מיכל מים (איור 1B). על ידי שילוב של כל השלושה, זה האפשרות במקביל למדידת מתח הממברנה, עקמומיות ממברנה, צפיפות המשטח של חלבונים, צינור כוח25. השאיפה micropipette הוא חיוני, היא בנויה בקלות על-ידי הוספת micropipette של זכוכית בעל מחובר מיכל מים, השולטת, באמצעות לחץ הידרוסטטי, שאיפה הלחץ26. את micropipette ואת המחזיק נשלטים על-ידי micromanipulator ו, באופן אידיאלי, בכיוון אחד על ידי אלמנט פייזו-למפעיל לתנועה דיוק. כדי למשוך שפופרת הנאנו, microaspirated בוס תקוע בקצרה בגודל מיקרון חרוז ואז משם יצירת שפופרת הנאנו. ביישום זה, החרוז מתקיים על ידי מלקחיים אופטיים, אשר ניתן לבנות על-ידי ביצוע של פרוטוקול שפורסמו27. זה אפשרי לוותר של מלקחיים אופטיים, למשוך צינוריות בדרכים שונות, אם כי במחיר של מדידות מדויקות כוח. אם זה יותר מדי אתגרי לבנות מלכודת אופטי או אם כוח המידות הם לא חיוניים, כמו למשל אם אדם פשוט רוצה לבדוק את ההעדפה של חלבונים לממברנות מעוקל, יכול להיות משך צינור חרוז aspirated בקצה השני micropipette28. . זה גם ניתן למשוך צינורות באמצעות כוח כבידה29 או30,31לזרום... יתר על כן, מיקרוסקופיה קונפוקלית אינה חיונית גם; עם זאת, זה הוא העדיף אז למדידת צפיפות המשטח של חלבונים. זה גם מאפשר מדידת הרדיוס nanotube מפני קרינה פלואורסצנטית האינטנסיביות של ליפידים בצינור, ובכך ללא תלות ממברנה כוח ומתח. מסיקה רדיוס שפופרת של קרינה פלואורסצנטית חשוב במיוחד אם היחסים בין כמויות אלה סוטה משוואות ומבוססת בשל נוכחותם של חלבוני ממברנה-דבקה25. חשוב, אחד לא יכול לחלק של מלכודת אופטי והן מיקרוסקופיה קונפוקלית, כפי שזה לא יהיה אפשר למדוד את שיפוע הצינור.
השיטה כפי שמתואר פרוטוקול זה שימש ללמוד עקמומיות-induced המיון של חלבונים שונים ממברנה פריפריאלי על צינוריות, בעיקר אלה של בר משפחה25,32,33,34 . היא שודרה גם בערוץ אשלגן transmembrane conically בצורת ש-kvap מועשר על מעוקל צינוריות. באותה דרך כמו בר חלבונים35. על-ידי מיטוב השיטה כדי לכמס חלבונים בתוך בסדר, פרנקי, האינטראקציה של חלבונים עם עקמומיות שלילית נחקר לאחרונה בשם טוב36. יתר על כן, שיטה זו שימש התירי את היווצרות החלבון פיגומים25,37 , ללמוד את המנגנון של הממברנה scission או קו המתח38, חלבון dynamin39, או על ידי בר חלבונים40,41. בנוסף חלבונים, מולקולות קטנות או יונים יכול גם לגרום עקמומיות. באמצעות שיטה זו, יונים של סידן הוצגו לזירוז עקמומיות חיובית תחת תנאים ללא מלח42. מעניין, גם הוכח כי שומנים יכולות לעבור עקמומיות מיון, למרות רק עבור קומפוזיציות הסמוכים demixing נקודה43,44. לסיכום, שיטת יכול לשמש על ידי חוקרים המעוניינים לחקור איך גם רכיבים ממברנלי אינטגרלי (למשל, שומנים או חלבונים transmembrane) או באופן עקיף מחייב מולקולות (גם בתוך או מחוץ כשמרוגזים) אינטראקציה עם ממברנות cylindrically מעוקל, נקודות מבט מכני ולא כמותית. זה גם מיועד למעוניינים מדידת תכונות מכניות של קרום עצמה22,23,45.

<table><tbody><tr><td>1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DOPC)</td><td>Avanti</td><td>850375</td><td>ליפיד לדוגמה המשמש בנתונים עבור איור 3</td></tr><tr><td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] [DSPE-PEG(2000)-biotin]</td><td>Avanti</td><td>880129</td><td>שומן ביוטיניל</td></tr><tr><td>BODIPY-TR-C5-ceramide</td><td>בדיקות מולקולריות (ThermoFisher)</td><td>D7540</td><td>ליפיד פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>BODIPY- FLC5-hexadecanoyl phosphatidylcholine (HPC*)</td> <td>בדיקות מולקולריות (ThermoFisher)</td><td></td> <td>ליפיד פלואורסצנטי לכיול צפיפות חלבון ביצים</td></tr><tr><td>L-&alpha;-phosphatidylcholine (eggPC)</td> <td>Avanti</td><td>840051</td><td>המשמש לכיול קבוע רדיוס הצינור</td></tr><tr><td>&בטא;-קזאין מחלב בקר (>99%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6905</td><td>המשמש לפסיביזציה של המיקרופיפטה וה תא ניסיוני</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>D(+) גלוקוז</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>אוסמומטר 10708976001</td><td></td></tr><tr><td></td><td>לוזר</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>חוטי Pt, קוטר 0.5 מ"מ, 99.99% טהור</td><td>Goodfellow ארה"ב</td><td>PT005139</td><td>משמש למחולל</td></tr><tr><td></td><td>פונקציית</td> אלקטרופורמציה של GUV <td>n/a</td><td>המשמש ליצירת זרם לאיטום שפכטל אלקטרופורמציה GUV</td></tr><tr><td></td><td>Vitrex (מ- CML צרפת)</td> <td>CRIT 140013</td><td>משמש לאיטום סוניקטור</td></tr><tr><td></td><td></td> אמבטיה של תא האלקטרופורמציה <td>n/a</td><td>שימושי לניקוי תא האלקטרופורמציה, אך לא קריטי</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך של ניקון TE2000, מערכת קונפוקלית eC1 (ניקון), עם שני קווי לייזר (&lambda; = 488 ננומטר ו-543 ננומטר); פינצטה אופטית המושרה על ידי לייזר גל רציף של סיבי איטרביום 5 W (&lambda; > 1070 ננומטר; IPG GmBH גרמניה)</td><td></td><td></td><td>דוגמה למערכת מיקרוסקופיה קונפוקלית המצוידת בפינצטה אופטית</td></tr><tr><td>מיקרומניפולטורים</td><td></td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>נימי בורוסיליקט (עם רדיוסים פנימיים וחיצוניים של 0.78 מ"מ ו-1 מ"מ, בהתאמה)</td><td>מכשיר הרווארד</td><td>30-0036</td><td></td></tr><tr><td>חולץ מיקרופיפטה</td><td>מכשיר סאטר</td><td>P-2100</td><td></td></tr><tr><td>microforge</td><td>Narishige</td> מפעיל פיזואלקטרי <td>MF-800</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Physik Instrumente</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>חרוזים מצופים סטרפטווידין מפוליסטירן (קוטר 3.2 ומיקרו; מ)</td> <td>ספרוטק</td><td>SVP-30-5</td><td></td></tr></tbody></table>

משיכת ממברנה צינוריות מן שלפוחית unilamellar ענק

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

העיצוב מחדש של קרום התא הוא חלק בלתי נפרד של תופעות סלולר רבות, כגון אנדוציטוזה, סחר בבני אדם, היווצרות של filopodia, וכו '. הרבה חלבונים שונים לשייך ממברנות מעוקל בגלל היכולת שלהם לחוש או זירוז עקמומיות ממברנה. בדרך כלל, תהליכים אלה כוללות מספר רב של חלבונים הפיכתם מורכב מדי ללמוד באופן כמותי בתא. אנו מתארים את פרוטוקול שתפעילי. מחדש ממברנה מעוקל במבחנה, מחקה את מבנה הסלולר מעוקל, כגון בצוואר endocytic. שלפוחית unilamellar ענק (בוס) משמש כמודל של קרום התא, אשר מתח ולחץ פנימי נשלט עם השאיפה micropipette. החלת של נקודת כוח מושך על הבוס באמצעות מלקחיים אופטיים יוצר שפופרת הנאנו עקמומיות גבוהה מחובר קרום שטוח. שיטה זו באופן מסורתי שימש כדי למדוד את התכונות המכאניות הבסיסית של ממברנות השומנים, כגון כפיפת קשיחות. בשנים האחרונות, זה הורחבה כדי ללמוד איך חלבונים אינטראקציה עם ממברנה עקמומיות ועל הדרך שבה הם משפיעים על הצורה והן את המכניקה של ממברנות. מערכת המשלבת חוץ-גופית, microinjection, מלקחיים אופטיים, מיקרוסקופיה קונפוקלית מאפשר מדידה של עקמומיות הממברנה מתח הממברנה, צפיפות המשטח של חלבונים, במקביל. מ מדידות אלה, שניתן להסיק נכסים חשובים רבים מכני ולא מורפולוגי של מערכת חלבונים-הממברנה. בנוסף, אנו להניח את פרוטוקול של יצירת כשמרוגזים בנוכחות ריכוז מלח פיזיולוגית, שיטה לכימות צפיפות המשטח של חלבונים על הקרום של עוצמות קרינה פלואורסצנטית שכותרתו חלבונים ושומנים.

הניסוי למשוך צינור יכול לתת מידע חיוני מכני על הקרום. בהיעדרו של חלבונים או מולקולות אחרות לכפות זוג עם ממברנה עקמומיות, הקרום, שפופרת radius יכול להיות קשור עם קרום המתח על-ידי החלת המילטוניאן Canham-Helfrich את משוואת לרכבת התחתית מהכלא בוס50,51 
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56086/56086eq3v6.jpg">(משוואת 1)
<p class="jove_content" f...

חלבונים רבים בתא לחוש, זירוז עקמומיות ממברנה. אנו מתארים שיטה למשוך ממברנה צינוריות מן השומנים שלפוחית את האינטראקציה של חלבונים או כל מולקולה עקמומיות-פעיל עם ממברנות מעוקל חוץ גופית בתוך.

משיכת ממברנה צינוריות מן שלפוחית Unilamellar ענק

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

המטרה הכוללת של מתודולוגיית משיכת ננו-צינורות זו היא לחקור כמותית את האינטראקציות בין חלבונים ספציפיים מעניינים לבין ממברנות מעוקלות מאוד. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה של קרומי התאים, כגון אנדוציטוזיס וסחר תוך תאי. טכניקה זו מאפשרת לנו לכמת ישירות כיצד חלבונים נקשרים לממברנות מעוקלות ומעוותים אותם באופן הדדי.בתחילה, שיטה זו שימשה למדידת התכונות המכניות הבסיסיות של ממברנות השומנים. לאחרונה, הוא יושם כדי להבהיר מנגנונים חשובים באינטראקציות של ממברנות חלבון, במיוחד ממברנות מעצבות חלבון. התחל באיסוף השלפוחיות הענקיות החד-כיווניות ישירות מחוטי הפלטינה של תא האלקטרופורמציה.כדי לבנות את תא הניסוי, הנח שני כיסויי זכוכית מלבניים המרוחקים מילימטר אחד זה מזה על בסיס מתכתי, והשאירו פתחים לאורך הקצוות הארוכים גדולים מספיק כדי לאפשר לקצה מיקרופיפטה מזכוכית להגיע לפחות למרכז החדר. מלאו גם את תא הניסוי וגם מיקרופיפטה מזכוכית בחמישה מיליגרם למיליליטר של תמיסת בטא-קזאין טהורה ביותר, והקפידו להימנע מבועות. בזמן שהתא עובר פסיביזציה, הרכיבו אותו על מיקרוסקופ אור שבמרכזו מעל המטרה, והכניסו את קצה המיקרופיפטה של השאיפה דרך הפתח לאורך הקצה הארוך עד שהקצה נמצא מעל המטרה.כוונן את מפלס מיכל המים כך שלחץ השאיפה יהיה קרוב לאפס, ומלא מיקרופיפטה בהזרקה עם המולקולה המעניינת המומסת במאגר ניסיוני בריכוז הניסוי המתאים. הרכיבו את המיקרופיפטה ההזרקה בתוך מיקרומניפולטור, והכניסו את המיקרופיפטה דרך הצד השני של תא הניסוי. בתום הדגירה, הוציאו את תמיסת הבטא-קזאין מהתא, ושטפו את החדר מספר פעמים עם מאגר ניסיוני.לאחר מכן, הוסף כמה מיקרוליטרים של תמיסת שלפוחית לתא, ואחריהם כמה מיקרוליטרים של חרוזים מצופים סטרפטווידין, לריכוז סופי של 0.1 כפול 10 לשיעור החרוזים השלילי של 3% לנפח או פחות. לאחר שהשלפוחיות והחרוזים התייצבו בתחתית החדר, אפשר למאגר הניסוי להתאדות למשך כ-15 דקות, ובשלב זה השלפוחיות אמורות להתנדנד באופן גלוי תחת מיקרוסקופ אור. כאשר השלפוחיות מתקליטונים כראוי, שאפו שלפוחיות בודדות לתוך המיקרופיפטה עד שאורכי הממברנות בתוך הפיפטה שווים או גדולים מרדיוס הפיפטה.כאשר זוהתה לשון שאיפה בגודל מתאים, אטום את הקצוות הפתוחים של החדר בשמן מינרלי. כדי להגדיר את מיקום האפס של לחץ השאיפה, מקם את קצה פיפטת השאיפה ליד חרוז, והתאם את גובה מיכל המים כך שהחרוז לא יישאב פנימה ולא יתפוצץ על ידי הפיפטה. התאמת גובה המים היא קריטית כדי לשלוט במתח הממברנה של השלפוחית הנשאבת על ידי המיקרופיפטה.שאפו שלפוחית, והזיזו את המיקרופיפטה למעלה ומחוץ לפוקוס מבלי לשבור את המיקרופיפטה. בעזרת פינצטה אופטית, לכוד חרוז במרחק של כ-20 מיקרומטר מתחתית החדר. החזר את השלפוחית למיקוד הרחק מהחרוז ומיושר עם המלכודת האופטית, והקלט את תנועת החרוז למשך דקה עד שתיים כדי למדוד את מיקום שיווי המשקל.הפחיתו את הלחץ בתוך המיקרופיפטה ככל האפשר מבלי לאבד את השלפוחית כדי להפחית את מתח הממברנה, והביאו בזהירות את השלפוחית במגע עם החרוז למשך כשנייה כדי לבסס את קשרי הסטרפטווידין-ביוטין. לאחר מכן, בעזרת מפעיל פייזו, משוך בעדינות את השלפוחית לאחור כדי ליצור ננו-צינור. הגדל את לחץ השאיפה כדי ליצור מחדש את לשון השאיפה וליישר את הצינור בתוך ציר פיפטת השאיפה.הביאו את הצינור והשלפוחית לפוקוס מלא, והקליטו את תנועת החרוז במהירות רכישה של 30 הרץ ואת גובה מיכל המים ביחס למצב האפס למשך מספר דקות במיקרוסקופ שדה בהיר. לאחר קבלת כל התמונות, רשום שוב את תנועת החרוז בלחצי שאיפה ומתחים שונים של הממברנה. כדי להזריק חלבונים או מולקולות מעניינות, הביאו את המיקרופיפטה להזרקה ליד הננו-צינורית, דאגו שהחרוז במלכודת האופטית לא יופרע, והזריקו בעדינות את החלבונים בלחץ של פסקל אחד עד שניים.לאחר שקשירת החלבון התייצבה, חזור על המדידות ההדרגתיות בנוכחות החלבונים שנוספו, כפי שהודגם עבור הממברנה החשופה. מדידות כוח ורדיוס על ננו-צינורות הנמשכים משלפוחיות DOPC של 100% הן עצמאיות, שכן הכוח נמדד מתזוזה של החרוז במלכודת האופטית והרדיוס מעוצמת הקרינה, מה שמספק שתי דרכים לחישוב קשיחות כיפוף הממברנה. ההעשרה היחסית של חלבוני BAR או תעלת אשלגן על צינורות הממברנה מעל השלפוחיות הבסיסיות מצביעה על כך שהחלבונים נוטים יותר להיקשר לממברנות מעוקלות.ואכן, קשירה של חלבון N-BAR אנדופילין A2 לממברנה מפחיתה בהדרגה את כוח הצינור לאפס, מה שמעיד על היווצרות פיגום תלת מימדי השומר על יציבות הצינור. בעקבות הליך זה, ניתן לשלב טכניקות אחרות כדי לענות על שאלות נוספות, למשל, מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה לאיתור ארגון חלבון על צינורות ממברנה או מעקב אחר חלקיקים בודדים למדידת ניידות חלבון.

pulling-membrane-nanotubes-from-giant-unilamellar-vesicles

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

jetting microfluidic נגד bilayer שומנים ממשק אגל מספק דרך אמינה כדי ליצור שלפוחית ​​עם שליטה על חוסר סימטריה בממברנה, שילוב של חלבונים הטרנסממברני, ואנקפסולציה של חומר. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד מגוון רחב של מערכות ביולוגיות שבי ביומולקולות הממודרת הן רצויה.

השומנים bilayer שלפוחיות דור שימוש Microfluidic jetting

הכינון מחדש של החלבון הטרנסממברני, KvAP, לתוך שלפוחית ​​unilamellar ענקית (GUVs) הוא הוכיח לשתי שיטות התייבשות-החזרת נוזלים - electroformation, ונפיחות בסיוע ג '. בשני השיטות, שלפוחית ​​unilamellar קטנה המכילה החלבון הם התמזגו יחד כדי ליצור GUVs כי אז יכול להיות שנחקר על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ואלקטרופיזיולוגיה תיקון מהדק.

כינונה מחדש של חלבון טראנסממברנלי, יון ערוץ מתח מגודרת, KvAP, לענק Unilamellar שלפוחית ​​למיקרוסקופי וצמד תיקון ללימודים

הפרוטוקול המוצג מתאר את הניתוח של הובלה מתווכת חלבון ממברנה ברמת הטרנספורטר היחיד באמצעות שכבות דו-שכבתיות נטולות שומנים נטולות ממס המשתרעות על פני נקבוביות. זה מושג על ידי יצירת שבבי מערך ננו-נקבוביות המיוצרים בתפזורת, בשילוב עם איסוף וניתוח נתונים מקבילים ביותר, המאפשרים הקמה עתידית של הקרנות אפקטור חלבון ממברנה.

תחבורת ממברנה תהליכים נותחה על ידי מערכת שבב nanopore מקבילה מאוד ברזולוצית חלבון יחידה

ניסויים שלב מופרדים unilamellar ענק שלפוחית (כשמרוגזים) לעתים קרובות להזניח את התנאים פיזיולוגית. עבודה זו מציג גישות לחקר השפעת מליחות גבוהה מאגר על נוזל-נוזל שלב ההפרדה בין האנשים שנגדם ל טעונה כפונקציה של טרנס-הממברנה לפתרון האסימטריה ואת הטמפרטורה.

שלב התנהגות של שלפוחית טעונה בתנאים פתרון סימטרי אסימטרי במעקב עם מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית

אנו מציגים טכניקה עבור המיקרומניפולציה ללא מגע של שלפוחית, באמצעות מעברי צבע יון סידן לשפות אחרות. Microinjection של פתרון יון סידן, באזור שלפוחית השומנים ענק, מנוצל כדי לשפץ ממברנה השומנים, וכתוצאה מכך הייצור של בליטות צינורי ממברנה.

ממברנה שיפוץ של שלפוחית ענקית בתגובה מעברי צבע יון סידן לשפות אחרות

נתמכת solid, נטול חלבון, כפול פוספוליפיד bilayer ממברנות (DLBM) יכולה להיהפך מורכב ודינמי, השומנים nanotube רשתות, יכול לשמש מלמטה למעלה 2D, דגמי רשתית תוך-פלזמית.

היווצרות ספונטנית ו שחלוף של השומנים מלאכותי Nanotube רשתות כמודל מלמטה למעלה על רשתית תוך-פלזמית

מטרת הפרוטוקול היא למדוד באופן אמין תכונות מכניות של ממברנה של שלפוחיות ענק על ידי שאיפה מיקרופיפטה.

Obtention של ענק Unilamellar היברידית ושלפוחיות על ידי אלקטרוונטור ומדידה של תכונות מכניות שלהם על ידי שאיפה מיקרופיפטה

פרוטוקול זה מתאר תהליך לייצור רשתות ננו-צינוריות ליפידים באמצעות תנועתיות קינזין גולשת בשילוב עם שלפוחיות ליפידים חד-שכבתיות ענקיות.

ייצור רשתות ננו-צינוריות ליפידים מרובות רכיבים באמצעות בדיקת תנועתיות Kinesin Gliding

מאמר זה מציג שיטה להכנת שלפוחיות ענק חד-תכליתיות (cGUVs) בעלות מבנה שלפוחית בתוך שלפוחית, עם מוליכות חשמלית מותאמת אישית באזורים פנימיים, טבעתיים וחיצוניים. אלקטרופורמציה מסנתזת GUVs פשוטים, שהופכים לסטומטוציטים ו-cGUVs באמצעות הלם אוסמוטי, ומספקים מודל רב ערך לחקר הביופיזיקה של תאים גרעיניים.

סינתזה של שלפוחיות חד-כיווניות ענקיות: מודל ביומימטי של תאים גרעיניים

מדריך זה למתחילים מציג פרוטוקול כללי להכנת שלפוחיות ענק חד-פעמיות (GUVs) באמצעות שיטת העברת טיפות, דן בשלבים הקריטיים ומספק תובנות שיעזרו להתאמות אפשריות הנדרשות ליישומים שונים, כולל ביולוגיה סינתטית ומיקרו-רובוטיקה.

שימוש בשיטת העברת טיפות להכנה אמינה של שלפוחיות יונילמלריות ענקיות

למד שיטת משיכת ננו-צינוריות מממברנות ליפידיות לחקירת אינטראקציות חלבון-ממברנה מעוקלת. השיטה מאפשרת כימות קשרי חלבונים ומאפיינים מכניים של ממברנות בתהליכים כמו אנדוציטוזה.

משיכת ממברנה צינוריות מן שלפוחית Unilamellar ענק

גלה סרטונים נוספים