משיכת ממברנה צינוריות מן שלפוחית Unilamellar ענק

המטרה הכוללת של מתודולוגיית משיכת ננו-צינורות זו היא לחקור כמותית את האינטראקציות בין חלבונים ספציפיים מעניינים לבין ממברנות מעוקלות מאוד. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה של קרומי התאים, כגון אנדוציטוזיס וסחר תוך תאי. טכניקה זו מאפשרת לנו לכמת ישירות כיצד חלבונים נקשרים לממברנות מעוקלות ומעוותים אותם באופן הדדי.

בתחילה, שיטה זו שימשה למדידת התכונות המכניות הבסיסיות של ממברנות השומנים. לאחרונה, הוא יושם כדי להבהיר מנגנונים חשובים באינטראקציות של ממברנות חלבון, במיוחד ממברנות מעצבות חלבון. התחל באיסוף השלפוחיות הענקיות החד-כיווניות ישירות מחוטי הפלטינה של תא האלקטרופורמציה.

כדי לבנות את תא הניסוי, הנח שני כיסויי זכוכית מלבניים המרוחקים מילימטר אחד זה מזה על בסיס מתכתי, והשאירו פתחים לאורך הקצוות הארוכים גדולים מספיק כדי לאפשר לקצה מיקרופיפטה מזכוכית להגיע לפחות למרכז החדר. מלאו גם את תא הניסוי וגם מיקרופיפטה מזכוכית בחמישה מיליגרם למיליליטר של תמיסת בטא-קזאין טהורה ביותר, והקפידו להימנע מבועות. בזמן שהתא עובר פסיביזציה, הרכיבו אותו על מיקרוסקופ אור שבמרכזו מעל המטרה, והכניסו את קצה המיקרופיפטה של השאיפה דרך הפתח לאורך הקצה הארוך עד שהקצה נמצא מעל המטרה.

כוונן את מפלס מיכל המים כך שלחץ השאיפה יהיה קרוב לאפס, ומלא מיקרופיפטה בהזרקה עם המולקולה המעניינת המומסת במאגר ניסיוני בריכוז הניסוי המתאים. הרכיבו את המיקרופיפטה ההזרקה בתוך מיקרומניפולטור, והכניסו את המיקרופיפטה דרך הצד השני של תא הניסוי. בתום הדגירה, הוציאו את תמיסת הבטא-קזאין מהתא, ושטפו את החדר מספר פעמים עם מאגר ניסיוני.

לאחר מכן, הוסף כמה מיקרוליטרים של תמיסת שלפוחית לתא, ואחריהם כמה מיקרוליטרים של חרוזים מצופים סטרפטווידין, לריכוז סופי של 0.1 כפול 10 לשיעור החרוזים השלילי של 3% לנפח או פחות. לאחר שהשלפוחיות והחרוזים התייצבו בתחתית החדר, אפשר למאגר הניסוי להתאדות למשך כ-15 דקות, ובשלב זה השלפוחיות אמורות להתנדנד באופן גלוי תחת מיקרוסקופ אור. כאשר השלפוחיות מתקליטונים כראוי, שאפו שלפוחיות בודדות לתוך המיקרופיפטה עד שאורכי הממברנות בתוך הפיפטה שווים או גדולים מרדיוס הפיפטה.

כאשר זוהתה לשון שאיפה בגודל מתאים, אטום את הקצוות הפתוחים של החדר בשמן מינרלי. כדי להגדיר את מיקום האפס של לחץ השאיפה, מקם את קצה פיפטת השאיפה ליד חרוז, והתאם את גובה מיכל המים כך שהחרוז לא יישאב פנימה ולא יתפוצץ על ידי הפיפטה. התאמת גובה המים היא קריטית כדי לשלוט במתח הממברנה של השלפוחית הנשאבת על ידי המיקרופיפטה.

שאפו שלפוחית, והזיזו את המיקרופיפטה למעלה ומחוץ לפוקוס מבלי לשבור את המיקרופיפטה. בעזרת פינצטה אופטית, לכוד חרוז במרחק של כ-20 מיקרומטר מתחתית החדר. החזר את השלפוחית למיקוד הרחק מהחרוז ומיושר עם המלכודת האופטית, והקלט את תנועת החרוז למשך דקה עד שתיים כדי למדוד את מיקום שיווי המשקל.

הפחיתו את הלחץ בתוך המיקרופיפטה ככל האפשר מבלי לאבד את השלפוחית כדי להפחית את מתח הממברנה, והביאו בזהירות את השלפוחית במגע עם החרוז למשך כשנייה כדי לבסס את קשרי הסטרפטווידין-ביוטין. לאחר מכן, בעזרת מפעיל פייזו, משוך בעדינות את השלפוחית לאחור כדי ליצור ננו-צינור. הגדל את לחץ השאיפה כדי ליצור מחדש את לשון השאיפה וליישר את הצינור בתוך ציר פיפטת השאיפה.

הביאו את הצינור והשלפוחית לפוקוס מלא, והקליטו את תנועת החרוז במהירות רכישה של 30 הרץ ואת גובה מיכל המים ביחס למצב האפס למשך מספר דקות במיקרוסקופ שדה בהיר. לאחר קבלת כל התמונות, רשום שוב את תנועת החרוז בלחצי שאיפה ומתחים שונים של הממברנה. כדי להזריק חלבונים או מולקולות מעניינות, הביאו את המיקרופיפטה להזרקה ליד הננו-צינורית, דאגו שהחרוז במלכודת האופטית לא יופרע, והזריקו בעדינות את החלבונים בלחץ של פסקל אחד עד שניים.

לאחר שקשירת החלבון התייצבה, חזור על המדידות ההדרגתיות בנוכחות החלבונים שנוספו, כפי שהודגם עבור הממברנה החשופה. מדידות כוח ורדיוס על ננו-צינורות הנמשכים משלפוחיות DOPC של 100% הן עצמאיות, שכן הכוח נמדד מתזוזה של החרוז במלכודת האופטית והרדיוס מעוצמת הקרינה, מה שמספק שתי דרכים לחישוב קשיחות כיפוף הממברנה. ההעשרה היחסית של חלבוני BAR או תעלת אשלגן על צינורות הממברנה מעל השלפוחיות הבסיסיות מצביעה על כך שהחלבונים נוטים יותר להיקשר לממברנות מעוקלות.

ואכן, קשירה של חלבון N-BAR אנדופילין A2 לממברנה מפחיתה בהדרגה את כוח הצינור לאפס, מה שמעיד על היווצרות פיגום תלת מימדי השומר על יציבות הצינור. בעקבות הליך זה, ניתן לשלב טכניקות אחרות כדי לענות על שאלות נוספות, למשל, מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה לאיתור ארגון חלבון על צינורות ממברנה או מעקב אחר חלקיקים בודדים למדידת ניידות חלבון.