קונאפוקלית הדמיה של Neuropeptide Y-pHluorin: טכניקה להמחיש אינסולין אקסוציטוזה גרגר ב איונים מאתר ואנושי ללא פגע
13 בספטמבר 2017
אנו מתארים פרוטוקול עבור ויזואליזציה של אינסולין אקסוציטוזה ב איים שלמים באמצעות pHluorin, חלבון פלואורסצנטי ירוק pH-רגיש. איים מבודדים נגועים עם אדנו קידוד pHluorin מצמידים את שלפוחית מטען neuropeptide Y. דבר זה מאפשר הזיהוי של אינסולין גרגר פיוז'ן אירועים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית.
המטרה הכללית של בדיקה זו היא להמחיש את האקסוציטוזה של גרנולות אינסולין בזמן אמת באיי לבלול שלמים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו תענה על שאלות מרכזיות בתחום הסוכרת. לדוגמה, מה מווסת את האקסוציטוזה של אינסולין?
זהו שלב קריטי מכיוון שהיתוך גרנולות הוא האירוע החשוב ביותר בחייה של תא בטא. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש באיים של לבלב שלמים, ובכך ניתן לצפות באירועי היתוך בתאים בתוך סביבתם הטבעית. מדינה מחמוטובה, סטודנטית לדוקטורט מהמעבדה שלנו, תדגים את הטכניקה.
בתחילה, עם הגעתם של האיים הלבלביים, העבירו אותם לפרועות פלקון בנפח 50 מיליליטר וסבבו את תרחיף האיים ב-1,000 סל"ד למשך חמש דקות. האיים יצטברו בתחתית הפרועת; העבירו את האיים ב-2 מיליליטר של מצע תרבית CMRL לצלוחיות פטרי בנפח 35 מילימטר שאינן מטופלות לתרבית רקמות, והדגרי them ב-37 °C וב-5% carbon dioxide למשך 24 שעות לפני הזיהום הוויראלי. לאחר בידודם, השעיקו מחדש כמות מקורבת של מקבילי איים לבלביים של עכבר ב-2 מיליליטר של מצע תרבית CMRL והעבירו אותם לצלוחיות פטרי בנפח 35 מילימטר שאינן מטופלות לתרבית רקמות.
דגרו את הרקמה בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide למשך 24 שעות לפני ההדבקה הוויראלית. כדי לבצע את ההדבקה הוויראלית, הוסיפו 5 עד 10 µL של נגיף מהמלאי לכל צלחת פטרי בקוטר 35 mm המכילה איים של לבלב אנושי או עכברי ב-2 mL של מצע גידול CMRL. לאחר גידול האיים למשך 24 שעות, שאבו את המצע והחליפו אותו ב-2 mL של מצע גידול CMRL ללא נגיף.
תרגלו את האיים למשך ארבעה עד שישה ימים, והחליפו את המצע מדי שלושה ימים. הכינו תמיסה חוץ-תאית על ידי שילוב הרכיבים המפורטים כאן, ולאחר מכן בצעו סטריליזציה של הבאפר באמצעות סינון. הכינו מצע גלוקוז בסיסי בריכוז סופי של 3 mM גלוקוז, על ידי הוספת 75 µL של תמיסת גלוקוז מלאי בריכוז 2 M ל-50 mL של תמיסה חוץ-תאית.
כדי להכין מצע היפרגליקמי בריכוז סופי של 16 millimolar גלוקוז, הוסיפו 400 µL של תמיסת אם של גלוקוז בריכוז 2 molar ל-50 mL של תמיסה חוץ-תאית. דללו גירויים נוספים ותמיסות חוץ-תאיות המכילות 3 millimolar גלוקוז. לפני תחילת הניסוי, טפלו מראש את לבישונים (cover slips) באמצעות 30 µL של תמיסת poly-d-lysine בריכוז 1 mg/mL והדגירו למשך שעה אחת.
לאחר מכן, השתמש במים כדי לשטוף היטב את לוחות הכיסוי. לפחות שעה אחת לפני הניסוי, העבר קבוצה של אילתים לצלחת פטרי של 35 מילימטר המכילה תמיסה חוץ-תאית עם 3 מילימול של גלוקוז. שמור את שאר האילתים בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO2.
30 דקות לפני תחילת הניסוי, הצמידו את כיסוי הזכוכית (cover slip) לתא הדמיה באמצעות גריס סיליקון לאיטום. לאחר מכן, קבעו את תא ההדמיה לפלטפורמת ההדמיה. בשלב הבא, העבירו בעזרת פפט 20 עד 30 אייलेट्स (islets) לאזור המטופל ב-poly-d-lysine שעל כיסוי הזכוכית, והמתינו 20 דקות עד שהאייलेट्स ייצמדו לפני השטח.
שלב זה הוא קריטי להצלחת הניסוי; אנו אוספים כ-20 עד 30 איילטים (islets) בפחות מ-10 µL של בופר וממתינים 20 דקות. חשוב למנוע מהכיסוי (cover slip) להתייבש לחלוטין, כדי למנוע נזק לאיילטים. בזמן שהאיילטים נצמדים לכיסוי, הכינו את מערכת הפרפוזיה על ידי שטיפה יסודית במים.
לאחר מכן, הוסיפו כל תמיסה לערוץ שונה, בהתאם לטבלה זו. הסירו את כל בועות האוויר מהמערכת על ידי פתיחה של כל ערוץ בנפרד והזרמת התמיסה למשך מספר דקות. ודאו שהזרימה עקבית ושאין דליפות מהצינוריות.
בשלב הבא, חברו את מחמם התמיסה התור בקו (single inline solution heater) לצינור יציאת הפרפוזיה והגדירו את טמפרטורת הבאפר הזורם החוצה ל-37 degree celsius. לאחר מכן, הכינו את משאבת השאיבה. חברו את הצינורות, הפעילו את המשאבה וודאו שהנוזל נשאב.
הניחו את פלטפורמת ההדמיה עם האיים על בניס המיקרוסקופ וחברו אותה למערכת הפרפוזיה ולמשאבת השאיבה. לאחר מכן, מלאו בעדינות את תא ההדמיה בתמיסה חוץ-תאית המכילה 3 mM גלוקוז. לצורך ביצוע הדמיה קונפוקלית, אתרו את האיים בשדה הראייה של המיקרוסקופ באמצעות הגדלה נמוכה.
לאחר המיקוד באי-צריים (islets), עברו לעדשות בעקידה גבוהה יותר. פתחו את תוכנת הרכישה והפעילו את מצב הסריקה המובנה. בחרו ב-xyzt imaging, ולאחר מכן, כדי להגדיר את הגדרות הרכישה, הדליקו את לייזר הארגון וכוון אותו ל-30%, ולאחר מכן את קו הלייזר של 488 ננומטר, תוך כוונון עוצמת הלייזר לכ-50% עבור עירור של pHluorin.
אספו פליטה באורך גל של 505 עד 555 ננומטרים, תוך שימוש בספקטרום הפליטה של EGFP כמדריך. בחרו רזולוציה של 512 על 512 פיקסלים. התחילו את ההדמיה על ידי לחיצה על כפתור ה-live והתאימו את רמות ההגבר (gain).
קבעו את נקודת ההתחלה והסיום של ה-z stack על ידי מיקוד בראש האי (islet) ובחירה ב-begin, ולאחר מכן מעבר למישור האחרון שניתן למקד בו ובחירה ב-n. בחרו גודל z stack של five micrometers. קבעו את מרווח הזמן לרכישת כל z stack לכ-1.5 עד 2 שניות, ובחרו באפשרות acquire until stopped לצילום רציף.
לאחר מכן, לחצו על כפתור ההפעלה (start) כדי להתחיל את ההדמיה. עיינו בפרוטוקול הכתוב לגבי פרוטוקולי הגירוי להשראת אקסוציטוזה של גרנואלות. באמצעות הסורק המובנה, תצלח תמונות קונפוקליות של האי כהקלטות timelapse בתוך פחות משתי שניות.
בנוסף, ניתן לשלב טכניקה זו עם צבעים לדימות פונקציונלי, כגון צבעים לפוטנציאל ממברנה או לסידן חופשי ציטוזולי. כדי לקבוע אם NP Y-pHluorin הוא אכן כלי מתאים לניטור דינמיקת גרנולות אינסולין, בוצעו צביעות אימונוהיסטוכימיות לאיילטים מזוהמים באמצעות נוגדנים נגד GFP עבור NP Y-pHluorin ונגד הורמוני האיילט אינסולין, סומטוסטטין או גלוקגון. רוב התאים שביטאו NP Y-pHluorin היו תאי בטא, שכן הם ביטאו גם אינסולין.
רק מספר מצומצם של תאי אלפא חיוביים לגלוקגון או תאי דלתא חיוביים לסומטוסטטין סומנו ב-GFP. באופן משמעותי, בתאים נגועים, ה-NP Y fusion נמצא במיקום משותף (co-localized) עם אינסולין. דמות זו מדגימה כי pHluorin הוא חיישן pH יעיל.
מכיוון שהעלאת ה-pH הבין-תאי באמצעות 50 millimolar ammonium chloride הובילה לעלייה של מעל 500% בפלואורסצנציה הבין-תאית, ומכיוון שה-pH בתוך הגרנולה עולה בעת מיזוג עם ממבנה התא בפתיחת נקבוביות המיזוג, גרנולות המכילות NP Y-pHluorin הופכות לנראות בתנאים המעוררים אקסוציטוזה של אינסולין, כגון דה-פולריזציה של הממברנה באמצעות potassium chloride. באמצעות דימוי timelapse קונפוקאלי של איים המבטאים NP Y-pHluorin, ניתן להדמות אירועי הפרשה בודדים בתאי בטא בתוך איים שלמים.
אלו מתרחשים בתגובה לדפולריזציה ישירה של ממברנה באמצעות פוטסיום כלוריד או מספר גירויים פיזיולוגיים אחרים. בריכוז גלוקוז חוץ-תאי בסיסי, נצפה מעט פעילות הפריתית. עם זאת, היתוך גרנולות עם ממברנת הפלזמה מופעל בתגובה לגירוי באמצעות גלוקוז בריכוז גבוה.
בעקבות פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון אימונוהיסטוכימיה, כדי לענות על שאלות נוספות, למשל, מדוע התמזגות גרנואלים מתרחשת באזורים ספציפיים בתא. לאחר פיתוחה, שימשה טכניקה זו לבחינת הדפוס הזמני של הפרשת גרנולות אינסולין באוכלוסיות של תאי בטא, באיי לבלב אנושיים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול להדמיה של אקסוציטוזה של גרנולות אינסולין באיים לבלב שלמים באמצעות pHluorin, חלבון פלואורסצנטי ירוק הרגיש ל-pH. שיטה זו מאפשרת תצפית בזמן אמת על אקסוציטוזת אינסולין, ומספקת תובנות לגבי הבקרה של תהליך קריטי זה במחקרי סוכרת.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- מחקר סוכרת
רקע
- אקסוציטוזה של אינסולין היא אירוע מפתח בתפקודם של תאי בטא בלבלב.
- הבנת הבקרה על תהליך זה חיונית למחקר על סוכרת.
- שיטות מסורתיות עשויות שלא לאפשר תצפית בסביבה הטבעית של האיים (islets).
- pHluorin מספק גישה חדשנית להדמיה של אירועים אלו בזמן אמת.
מטרת המחקר
- להדמיות של אקסוציטוזה של גרנולות אינסולין בזמן אמת.
- לחקירת מנגנוני הבקרה של הפרשת אינסולין.
- שימוש באיים של לבלב (islets) שלמים לקבלת תצפיות מדויקות יותר.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הדבקה של איים מבודדים באדנווירוס המקודד ל-pHluorin.
- שרשור של pHluorin לניורופפטיד Y, המהווה מטען של הוסיקולות.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית לזיהוי אירועי היתוך של גרנולות אינסולין.
- דימוי בזמן אמת של אקסוציטוזה באיים לבלב שלמים.
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של אירועי אקסוציטוזה של גרנולות אינסולין.
- הדגמה של הטכניקה על ידי סטודנט לדוקטורט במעבדה.
- תובנות לגבי הדינמיקה של הפרשת אינסולין בסביבה טבעית.
- פוטנציאל למתן מענה לשאלות מפתח במחקר על סוכרת.
מסקנות
- טכניקת ה-pHluorin מאפשרת ויזואליזציה בזמן אמת של אקסוציטוזה של אינסולין.
- שיטה זו משפרת את ההבנה של ויסות הפרשת האינסולין.
- שימוש באיי לנגריץ (islets) שלמים מספק הקשר רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית לצורך המחקר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הדמיה של אקסוציטוזה של גרנולות אינסולין באיים של לבלב שלמים מספקת מודל רלוונטי פיזיולוגית להערכת תפקוד תאי בטא במחקר על סוכרת. טכניקה זו מאפשרת ניטור בזמן אמת של דינמיקה הפרשית, ובכך תומכת בתיקוף של מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים בפיתוח טיפולי. התאימות לאיים אנושיים ועכבריים משפרת את הרצף התרגומי עבור הערכה פרה-קלינית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של מנגנוני אקסוציטוזה בארכיטקטורה טבעית של איים לבלביים.
- ערך תפעולי: תומך בהערכה תפקודית של מודולטורים גנטיים או פרמקולוגיים של הפרשת אינסולין.
- ערך ניבוי: מסייע בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי קישור בין מטרות מולקולריות לאירועי היתוך של גרנולות.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מוכנות הבדיקה: מייצרת קריאות פלואורסצנציה כמותיות ורזולוציית זמן של אירועי אקסוציטוזה.
- שחזוריות: תנאי פרפוזיה ודימות סטנדרטיים מאפשרים אפיין עקבי של תגובה לגירוי.
- יכולת הרחבה: תואם לבדיקה של מספר גירויים בניסויים בודדים לצורך סריקת תרכובות יעילה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: ממדל באופן ישיר הפרות בהפרשת אינסולין בפנוטיפים סוכרתיים.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין ממצאי גילוי לתיקוף פרה-קליני באמצעות איים של תאי בטא אנושיים.
- החלטות מותאמות סיכון: מספק מדדים תפקודיים לצורך תיעדוף מועמדים על בסיס כשירות הפרשתית.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי הגילוי על ידי כך שהיא מאפשרת תיקוף פונקציונלי של מטרות המשפיעות על אקסוציטוזה של אינסולין לפני אופטימיזציה של המולקולה המובילה (lead optimization).
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות של מסלולים המווסתים היתוך גרנולות בתאי בטא שלמים.
- סריקה: מספק מדדי אקסוציטוזה כמותיים להערכת השפעות של תרכובות על דינמיקת ההפרשה.
- אנליטיקה: מספק נתוני פלואורסצנציה מרחביים-זמניים להשוואה בין תנאי גירוי לבין יעילות של מעכבים.
- מחקר תרגומי: משתמש באיים של תאי בטא אנושיים כדי להגביר את הביטחון החזוי בהתקדמות פרה-קלינית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר למחקרי גירוי כרוני והערכה תפקודית לאורכית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי באמצעות תצפית על אקזוציטוזה בהקשר תאי טבעי.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזוריות באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של טרנסדוקציה ויראלית ודימוי.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקת התהליך (go/no-go) על ידי קישור בין מודולציית המטרה לתוצאות הפרשה תפקודיות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מועמדים מותאם סיכון בהתבסס על קיבולת ההפרשה של תאי בטא.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטרנסדוקציה ויראלית, מיקרוסקופיה קונפוקאלית וטיפול באיי לבלבל.
- תלוי בגישה למערכות מיקרוסקופ קונפוקאלי עם סריקת לייזר אנכית ויכולת סריקה רזוננטית.
- מחייב הקמה של מערכת פרפוזיה למתן גירויים מבוקר במהלך הדמיון.
- כולל אופטימיזציה בין מינים שונים (עכבר/אדם) והתמודדות עם שונות באיכות האיי לבלבל.
- מוגבל על ידי סיכוני פוטוטוקסיות במהלך רכישת תמונות Time-lapse ממושכת.
