פרופילינג נגד Neu5Gc IgG ב Sera האדם עם Assay Microarray Sialoglycan
13 ביולי 2017
Assay microarray sialoglycan ניתן להשתמש כדי להעריך נוגדנים נוגדי Neu5Gc ב sera האדם, מה שהופך אותו assay אבחון תפוקה גבוהה פוטנציאל לסרטן ומחלות כרוניות אחרות מתווך דלקת כרונית.
המטרה הכוללת של בדיקת המיקרו-מערך של סיאלוגליקן היא להעריך את Anti-Neu5Gc IgG בסרום אנושי באופן בעל תפוקה גבוהה כנגד אוסף מגוון של סיאלוגליקנים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הגליקואימונולוגיה, כגון כיצד נוגדנים Anti-Neu5Gc מעורבים במחלות אנושיות שונות כולל סרטן, מחלות לב והשתלת זרים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת פרופיל תפוקה גבוהה של נוגדנים Anti-Neu5Gc כנגד מספר עצום של אנטיגנים סיאלוגליקניים.
תדגים את ההליך שרון יהודה, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי. תכנון קפדני ומפורט של ייצור ופריסת המערך חשוב כדי להבטיח הצלחה. תהליך זה מפורט בפרוטוקול הטקסט ובמידע המשלים.
יש לדלל כל גליקן ל-100 מיקרומולר בנפח כולל של 100 מיקרוליטר של מאגר הדפסת גליקן בצינורות מיקרו-צנטריפוגה. לאחר מכן, הכינו אמין ראשוני המכיל צבע פלורסנט למיליגרם אחד למילימטר עם מאגר סמן. לאחר מכן, יש לדלל למיקרוגרם אחד למיליליטר בנפח כולל של מיליליטר אחד.
הכן דילול עקומה סטנדרטית של IgG אנושי כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מניחים את צלחת הבאר 384 על קרח. באמצעות מולטי-פיפטה אלקטרונית, ציטט שבעה מיקרוליטרים מכל גליקן, סמן ועקומת כוכב IgG בהתאם לפריסת הלוח שנמצאת בפרוטוקול הטקסט.
מכסים את הצלחת בפרפילם ומסתובבים במשך שתי דקות בחום של 250 פעמים גרם ו -12 מעלות צלזיוס. ההדפסה חייבת להתבצע באזור נטול אבק עם לחות של 60 עד 70%כאן, כל השלבים מתבצעים בחדר נקי עם כפפות ובגדים מתאימים להגנה. הפעל את מכונת מדפסת הננו ומכשיר האדים.
לאחר תכנות מכונת ההדפסה כמתואר בפרוטוקול הטקסט, מקם את לוחית הבאר 384 עם דגימות מצויטות במיקומה על סיפון המערך והסר את מכסה הפרפילם. בשלב זה, התחל להדפיס. מספר את השקופיות בעזרת עט סימון עמיד בפני ממס אלכוהול, ואחסן אותן בקופסה אטומה בוואקום בחושך.
כדי לעבד את המערכים, הסר תחילה שקופית מהקופסה האטומה בוואקום והנח אותה במכסה מנוע כימי למשך חמש דקות, מערך כלפי מעלה, כדי לאדות את עודפי הנוזל. לאחר מכן, הרטיבו את השקופית על ידי הנחתה בצינור מכתים מלא במים נטולי יונים. מכסים את הצינור בנייר כסף ודוגרים במשך חמש דקות בניעור איטי ועדין בטמפרטורת החדר.
כדי לחסום את קבוצות האפוקסי התגובתיות בשקופית, טבלו את השקופית בצינור הצביעה של 50 מיליליטר המלא בתמיסת חסימת אתנולאמין מחוממת מראש. מכסים את הצינור בנייר כסף ודוגרים למשך 30 דקות בניעור איטי ועדין בטמפרטורת החדר. השליכו את תמיסת חסימת האתנולאמין לתוך מיכל האשפה הביולוגי המתאים.
לאחר מכן, הנח את השקופית בצינור צביעה חדש ונקי מלא במים נטולי יונים של 50 מעלות צלזיוס. מכסים את הצינור בנייר כסף ודוגרים למשך 10 דקות בניעור איטי ועדין בטמפרטורת החדר. השליכו את המים והעבירו את השקופיות למחזיק כתמים מזכוכית.
הנח את המכשיר לתוך מחזיק צלחת מתנדנד וצנטריפוגה את המגלשה יבשה. לאחר מכן, הנח את השקופית על מחיצה של 16 בארות. לאחר הרטבת הבארות מראש, השתמש ברב פיפטה כדי להוציא 200 מיקרוליטר PBST לבארות המגלשה.
לאחר מכן, הניחו אותם בתא מכוסה ולח ונערו במשך חמש דקות. הסר את ה-PBST על ידי החלקה והקשה עדינה על מגבת נייר נקייה. לאחר מכן, הכניסו 200 מיקרוליטר של מאגר חוסם PBS-Ovalbumine לכל באר.
מניחים את המגלשות בתא לח ומדגרים למשך שעה בטמפרטורת החדר בניעור עדין. לאחר מכן, הכן את הזיהוי הראשוני, מדולל במאגר חסימת PBS-OVA כמתואר בפרוטוקול הטקסט. החלק את המאגר החוסם PBS-OVA מהמגלשה והוסף 200 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני לכל באר.
דגרו את המגלשות בתא לח למשך שעתיים. לאחר מכן, החלק את הזיהוי הראשי מהמגלשה ושטוף שלוש פעמים עם PBST. דגרו את המגלשה ב-PBST למשך חמש דקות בתא לח לפני שטיפה אחרונה עם PBST.
לאחר מכן, שטפו פעם אחת עם PBS. לאחר מכן, הכן את הנוגדן המשני ב-PBS כמתואר בפרוטוקול הטקסט. החלק את ה-PBS מהשקף והוסף 200 מיקרוליטר של נוגדן משני.
החלק את הנוגדן המשני מהשקף ושטוף ארבע פעמים עם PBST כמו קודם. הסר בזהירות את המסגרת, ואז הנח את השקופיות לתוך צינור צביעת שקופיות של 50 מיליליטר מלא ב- PBS ונער במשך חמש דקות. לאחר מכן, מלאו שתי אמבטיות מכתים שקופיות במים דה-יונים.
הנח את המגלשה לתוך מחזיק המגלשה וטבל את המגלשה באמבטיה הראשונה. טבלו במהירות את השקופית עשר פעמים. לאחר מכן, העבירו את השקופית לאמבטיה השנייה וטבלו עשר פעמים נוספות.
לאחר הטבילה, דגרו את המגלשה למשך עשר דקות בטמפרטורת החדר עם ניעור. לאחר הדגירה, השליכו את המים והעבירו את המגלשה למחזיק מכתים מזכוכית. הנח את מחזיק מכתמי הזכוכית במחזיק צלחת מתנדנד וצנטריפוגה את המגלשה יבשה.
פתח את דלת הסורק והנח את המגלשה בפנים, המערך פונה כלפי מטה. בשלב זה, התחל את הסריקה. שמור את השקופיות הסרוקות כקובץ TIFF.
כדי להכין שקופית לניתוח, בחר טען רשימת מערכים"והעלה את קובץ ה-GAL המתאים הממפה את המערכים בכל בלוק בשקופית. השקופיות פותחו עם 16 חלקי זיהוי ראשוניים שונים, אחד בכל בלוק. הצמח לקטין SNA קושר חומצה סיאלית מקושרת a2-6.
ואילו הצמח לקטין MALII קושר חומצה סיאלית מקושרת a2-3. Polyclonal Anti-Neu5Gc IgY קושר סיאלוגליקנים המכילים Neu5Gc אך אינו קושר סיאלוגליקנים המכילים Neu5Ac. כדי לאפיין את Anti-Neu5Gc IgG, נותחו 12 סרות מתורמים אנושיים בריאים על המיקרו-מערך הסיאלוגליקן המודפס ופותחו באמצעות IgG אנטי-אנושי עם תווית פלואורסצנטית בנורמליזציה לננוגרם למיקרוליטר.
כל הסרומים האנושיים שנבדקו הכילו רמות שונות של Anti-Neu5Gc IgG כמעט ללא זיהוי של הזוגות התואמים של סיאלוגליקנים המכילים Neu5Ac. יתר על כן, דפוסי זיהוי IgG נגד Neu5Gc מגוונים מאוד בין 12 הסרות השונות הללו, הן ברמת העוצמה והן בגיוון. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור פרופיל נוגדנים נגד Neu5Gc בדגימות אנושיות שונות בצורה בעלת תפוקה גבוהה, באמצעות מערכת מיקרו-מערך גליקן.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
בדיקת מערך מיקרו-מערכים של סיאלוגליקנים (sialoglycan microarray) מעריכה את רמות Anti-Neu5Gc IgG בסרומים אנושיים, ובכך מאפשרת ניתוח בסביבות של תפוקה גבוהה מול סיאלוגליקנים שונים. שיטה זו היא משמעותית להבנת תפקידם של נוגדני Anti-Neu5Gc במחלות כגון סרטן ודלקת כרונית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- גליקו-אימונולוגיה
- דלקת כרונית
- דיאגנוסטיקה של סרטן
רקע
- נוגדנים נגד Neu5Gc מעורבים במספר מחלות באדם.
- הבנת תפקידם יכולה לסייע בפיתוח כלים אבחנאיים.
- הבדיקה מאפשרת ביצוע פרופיל מול אוסף מגוון של סיאלוגליקנים.
- שיטות עם תפוקה גבוהה חיוניות למחקרים רחבי היקף.
מטרת המחקר
- להערכת נוגדני Anti-Neu5Gc בסרומים אנושיים.
- לבחינת מעורבותם במחלות שונות.
- לביסוס בדיקה אבחנתית בעלת תפוקה גבוהה (high-throughput).
שיטות שבהן נעשה שימוש
- בדיקת מיקרו-מערך (microarray) של סיאלוגליקנים
- פרופיל בייצור תפוקה גבוהה (High-throughput profiling)
- ייצור מערך ותכנון פריסה
- פרוטוקול מפורט ומידע משלים סופקו
תוצאות עיקריות
- הערכה מוצלחת של Anti-Neu5Gc IgG בסרומי אדם.
- הדגמה של יעילות הבדיקה באפיון נוגדנים.
- תובנות לגבי הקשר בין נוגדנים למחלות.
- פוטנציאל לשימוש באבחון סרטן ובמחקרים על דלקת כרונית.
מסקנות
- בדיקת מערך המיקרו-מערכים של סיאלוגליקנים היא כלי אבחנתי מבטיח.
- היא משפרת את ההבנה של הגליקו-אימונולוגיה בהקשרי מחלה.
- יישומים עתידיים עשויים לשפר את אבחון המטופלים ואת אסטרטגיות הטיפול.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיפוי של anti-Neu5Gc IgG בסרומים אנושיים מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית של מטרות גליקו-אימונולוגיות בסרטן ובדלקות כרוניות. בדיקת מערך מיקרו-סילוגליקן (sialoglycan microarray) בתוספת סריקה רב-ערוצית מספקת נתונים כמותיים וניתנים לשחזור התומכים בתהליכי תיקוף מטרות ופיתוח בדיקות. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בקישור בין חשיפה לאנטיגנים תזונתיים לבין תגובות חיסוניות הרלוונטיות למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות לגבי תפקידי נוגדנים נגד Neu5Gc בסרטן ובדלקת.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף של מטרות תפקודיות באמצעות מדידת סגוליות הנוגדנים כלפי גליקנים המכילים Neu5Gc.
- ערך מדעי: תומך בביטחון חיזוי באמצעות פרופיל סרום מגוון של תורמים בריאים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנה של מערכות ביולוגיות מותקפות עבור תהליכי עבודה המשכיים באמצעות סיאלוגליקנים (sialoglycans) מקושרים קוולנטית על שקופיות מצופות אפוקסי.
- ערך תפעולי: מענה לסטנדרטיזציה של הבדיקה ולשחזוריות באמצעות הדפסה מבוקרת של 56 שקופיות בפורמט של 16 בארות.
- ערך מדעי: מאפשר הערכה אמינה של תרכובות על ידי סריקת 16 סוגי סרומים אנושיים שונים לכל שקופית לבדיקת עוצמת ומגוון הנוגדנים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: דן ברלוונטיות למחלה על ידי קישור נוגדנים נגד Neu5Gc לקרצינומות ומחלות המתווכות על ידי דלקת כרונית.
- ערך תפעולי: מתאר רצף מהגילוי דרך תיקוף פרה-קליני תוך שימוש בדגימות סרום אנושי.
- ערך מדעי: מתמקד בערך של הפחתת סיכונים חיזויית על ידי זיהוי דפוסי זיהוי מגוונים בין סרומים.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה תומכת בביולוגיה של גילוי באמצעות בדיקת היפותזות והבהרת מסלולים בגליקו-אימונולוגיה.
- ביולוגיה של גילוי: מסביר כיצד השיטה תומכת בבדיקת היפותזות, הבהרת מסלולים או הפחתת סיכונים ביולוגיים.
- סריקה: מתאר את מוכנות הבדיקה, השחזוריות או פלטים כמותיים כאשר המאמר תומך בכך.
- אנליטיקה: מדגיש מדידות, קריאות או פלטים סטטיסטיים המסייעים לצוותים להשוות בין תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשר את השיטה לרציפות פרה-קלינית או להתאמה של סמנים ביולוגיים רק כאשר המקור תומך בכך.
- שימוש חוזר ארגוני: מציג את השיטה כיכולת הניתנת לשימוש חוזר ולא כטכניקה לשימוש חד-פעמי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון בחיזוי, תיקוף מטרה, וצמצום עמימות מכניסטית.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go), יעילות הון וצמצום סיכונים ביולוגיים בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף והחלטות קידום מותאמות לסיכון.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות מדעית בגליקו-אימונולוגיה ובעבודה עם מיקרו-מערכים (microarrays).
- צורך בתשתיות אנליטיות ובמכשור, כולל מדפסת ננו (nano-printer) וסורק.
- דרישות לסטנדרטיזציה בין צוותים עבור ייצור ופריסה של המערך.
- שיקולי התאמה בין מערכות מודלים, כגון דגימות שונות של סראם אנושי.
- מגבלות מעשיות הנובעות מהחומרים המקוריים, כולל הצורך בסביבה נקייה מאבק ובשליטה בלחות.
