Name: פרופילינג נגד Neu5Gc IgG ב Sera האדם עם Assay Microarray Sialoglycan (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: למדו פרופילינג נגד נוגדני IgG ל-Neu5Gc בסרום אנושי באמצעות מערך סיאלוגליקנים. שיטה זו מאפשרת ניתוח תפקודי גליקואימונולוגיה במחלות כמו סרטן ודלקת כרונית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקם על ידי קרן מחקר מחקר ופיתוח של הקרן למחקר הסרטן בישראל, מענק מהקרן הלאומית לננוטכנולוגיה וקרן הצדקה של הלמסלי עבור תחום מוקד על ננו-רפואה לתרנוסטים מותאמים אישית (VP-K) מכוני בריאות מענק R01GM076360 (ל- XC).

<ol><li>Padler-Karavani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aiming+at+the+sweet+side+of+cancer%3A+Aberrant+glycosylation+as+possible+target+for+personalized-medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Aiming at the sweet side of cancer: Aberrant glycosylation as possible target for personalized-medicine.</a> Cancer Lett. 352 (1), 102-112 (2014).</li>
<li>Amon, R., Reuven, E. M., Leviatan Ben-Arye,, Padler-Karavani, S., V, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycans+in+immune+recognition+and+response%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Res%22%5BJournal%5D)">Glycans in immune recognition and response.</a> Carbohydr Res. 389, 115-122 (2014).</li>
<li>Häuselmann, I., Borsig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+tumor-cell+glycosylation+promotes+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Altered tumor-cell glycosylation promotes metastasis.</a> Front Oncol. 4, (2014).</li>
<li>Tangvoranuntakul, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+uptake+and+incorporation+of+an+immunogenic+nonhuman+dietary+sialic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100 (21), 12045-12050 (2003).</li>
<li>Bardor, M., Nguyen, D. H., Diaz, S., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+uptake+and+incorporation+of+the+non-human+sialic+acid+N-glycolylneuraminic+acid+into+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mechanism of uptake and incorporation of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid into human cells.</a> J Biol Chem. 280 (6), 4228-4237 (2005).</li>
<li>Padler-Karavani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+in+specificity%2C+abundance%2C+and+composition+of+anti-Neu5Gc+antibodies+in+normal+humans%3A+potential+implications+for+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Diversity in specificity, abundance, and composition of anti-Neu5Gc antibodies in normal humans: potential implications for disease.</a> Glycobiology. 18 (10), 818-830 (2008).</li>
<li>Padler-Karavani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+xeno-autoantibodies+against+a+non-human+sialic+acid+serve+as+novel+serum+biomarkers+and+immunotherapeutics+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Human xeno-autoantibodies against a non-human sialic acid serve as novel serum biomarkers and immunotherapeutics in cancer.</a> Cancer Res. 71 (9), 3352-3363 (2011).</li>
<li>Cao, H., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+consideration+on+sialic+acid+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">General consideration on sialic acid chemistry.</a> Methods Mol Biol. 808, 31-56 (2012).</li>
<li>Deng, L., Chen, X., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+sialic+Acid+diversity+and+biology+using+sialoglycan+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Exploration of sialic Acid diversity and biology using sialoglycan microarrays.</a> Biopolymers. 99 (10), 650-665 (2013).</li>
<li>Liang, C. H., Hsu, C. H., Wu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sialoside+Arrays%3A+New+Synthetic+Strategies+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Top+Curr+Chem%22%5BJournal%5D)">Sialoside Arrays: New Synthetic Strategies and Applications.</a> Top Curr Chem. 367, 125-149 (2015).</li>
<li>Song, X., Heimburg-Molinaro, J., Smith, D. F., Cummings, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycan+microarrays+of+fluorescently-tagged+natural+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Glycan microarrays of fluorescently-tagged natural glycans.</a> Glycoconj J. 32 (7), 465-473 (2015).</li>
<li>Muthana, S. M., Gildersleeve, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycan+microarrays%3A+powerful+tools+for+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biomark%22%5BJournal%5D)">Glycan microarrays: powerful tools for biomarker discovery.</a> Cancer Biomark. 14 (1), 29-41 (2014).</li>
<li>Rillahan, C. D., Paulson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycan+microarrays+for+decoding+the+glycome%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Glycan microarrays for decoding the glycome.</a> Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).</li>
<li>Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F., Cummings, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+analysis+of+glycan+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Preparation and analysis of glycan microarrays.</a> Curr Protoc Protein Sci. 12 (10), (2011).</li>
<li>Park, S., Gildersleeve, J. C., Blixt, O., Shin, I. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2013/cs/c2cs35401b#!divAbstract">Carbohydrate microarrays.</a> Chem Soc Rev. 42 (10), 4310-4326 (2013).</li>
<li>Struwe, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+minimum+information+required+for+a+glycomics+experiment+%28MIRAGE%29+project%3A+sample+preparation+guidelines+for+reliable+reporting+of+glycomics+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: sample preparation guidelines for reliable reporting of glycomics datasets.</a> Glycobiology. 26 (9), 907-910 (2016).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+minimum+information+required+for+a+glycomics+experiment+%28MIRAGE%29+project%3A+improving+the+standards+for+reporting+glycan+microarray-based+data%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: improving the standards for reporting glycan microarray-based data.</a> Glycobiology. , (2016).</li>
<li>Hara, S., Yamaguchi, M., Takemori, Y., Furuhata, K., Ogura, H., Nakamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+mono-O-acetylated+N-acetylneuraminic+acids+in+human+and+rat+sera+by+fluorometric+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determination of mono-O-acetylated N-acetylneuraminic acids in human and rat sera by fluorometric high-performance liquid chromatography.</a> Anal Biochem. 179 (1), 162-166 (1989).</li>
<li>Padler-Karavani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-comparison+of+protein+recognition+of+sialic+acid+diversity+on+two+novel+sialoglycan+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cross-comparison of protein recognition of sialic acid diversity on two novel sialoglycan microarrays.</a> J Biol Chem. 287 (27), 22593-22608 (2012).</li>
<li>Padler-Karavani, V., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+impact+of+the+non-human+sialic+acid+N-glycolylneuraminic+acid+on+transplant+rejection+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Xenotransplantation%22%5BJournal%5D)">Potential impact of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid on transplant rejection risk.</a> Xenotransplantation. 18 (1), 1-5 (2011).</li>
<li>Samraj, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+red+meat-derived+glycan+promotes+inflammation+and+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A red meat-derived glycan promotes inflammation and cancer progression.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (2), 542-547 (2015).</li>
<li>Pearce, O. M., Läubli, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sialic+acids+in+cancer+biology+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Sialic acids in cancer biology and immunity.</a> Glycobiology. 26 (2), 111-128 (2016).</li>
<li>Alisson-Silva, F., Kawanishi, K., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+risk+of+diseases+associated+with+red+meat+intake%3A+Analysis+of+current+theories+and+proposed+role+for+metabolic+incorporation+of+a+non-human+sialic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">Human risk of diseases associated with red meat intake: Analysis of current theories and proposed role for metabolic incorporation of a non-human sialic acid.</a> Mol Aspects Med. 51, 16-30 (2016).</li>
<li>Pearce, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverse+hormesis+of+cancer+growth+mediated+by+narrow+ranges+of+tumor-directed+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Inverse hormesis of cancer growth mediated by narrow ranges of tumor-directed antibodies.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 111 (16), 5998-6003 (2014).</li>
<li>Pham, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+novel+human-specific+xeno-auto-antibody+response+against+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Evidence for a novel human-specific xeno-auto-antibody response against vascular endothelium.</a> Blood. 114 (25), 5225-5235 (2009).</li>
<li>Reuven, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+immunogenic+Neu5Gc+in+bioprosthetic+heart+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Xenotransplantation%22%5BJournal%5D)">Characterization of immunogenic Neu5Gc in bioprosthetic heart valves.</a> Xenotransplantation. 23 (5), 381-392 (2016).</li>
<li>Ghaderi, D., Taylor, R. E., Padler-Karavani, V., Diaz, S., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+the+presence+of+N-glycolylneuraminic+acid+in+recombinant+therapeutic+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Implications of the presence of N-glycolylneuraminic acid in recombinant therapeutic glycoproteins.</a> Nat Biotechnol. 28 (8), 863-867 (2010).</li>
</ol>

למחברים אין מה לגלות.

מוצלח glycan ייצור microarray דורש תכנון זהיר כולל מספר שלבים חשובים בפרוטוקול. אלה כוללים: (1) תכנון פריסות הבלוק והצלחות המגדירים את כל הפרמטרים הבאים ( לדוגמה, מרחקים, ריווח, כמות הדגימות והדפסה); (2) לנקות את הסיכות ולהבטיח שלמות הדק, שהיא קריטית לשליטה בהומוגניות ספוטית; (3) שמירה על לחות גבוהה במהלך ההדפסה, קריטי כדי למנוע אידוי מדגם במהלך הדפסה ארוכה, אשר עלול לפגוע בהומוגניות ספוט; (4) בחירת יישור נכון פרמטרים ניתוח, אשר יכול להשפיע על התוצאות ( למשל, שיט...

סיאס הם סוכרים חומציים המכסים שרשראות גליקניות על גליקופרוטאינים של תאי תאים וגליקוליפידים בחוליות. ביטוי Sia הוא שונה בתאי סרטן 1 וקושרת עם התקדמות ו / או גרורות 2 , 3 . שני של צורות סיה הגדולות היונקים הם Neu5Ac ואת טופס hydroxylated שלה, Neu5Gc 2 . בני אדם לא יכולים לסנתז Neu5Gc עקב אי פעילות מסוימת של הגן קידוד האנזים CMAH. זה סיא הלא אנושי מטבולית משלבת לתוך תאים אנושיים כמו &quot;עצמי&quot;, שמקורה מזון תזונתיים Neu5Gc עשירים ( למשל, בשר אדום) 4 , 5 . Neu5Gc נמצא ברמות נמוכות על משטחי התא של אפיתל אנושי ואנדוטליה, אך הוא נצבר במיוחד בקרצינומה. Neu5Gc מזוהה זרים על ידי מערכת החיסון האנושית הומור 2 , 6 .המורכבות האנטיגנית של Neu5Gc-glycans עשויה להתעורר ברמות רבות, כולל שינוי Neu5Gc, הצמדה, גליקנים בסיסיים ו פיגומים, ואת הצפיפות שלהם, כל לידי ביטוי על ידי המורכבות של נוגדנים נוגדן Neu5Gc בבני אדם 6 . חלק מנוגדנים אלה משמשים ביומרקרים קרצינומה פוטנציאל immunotherapeutics 7 . הופעתו של chemoenzymatic סינתזה של sialoglycans שונים 8 סללה את הדרך לניתוח מעמיק יותר של נוגדנים כאלה, בהנחיית השימוש בטכנולוגיה microiray glycan 9 , 10 . לכן, עם ההכנה להקל על מניפולציה של ספריות גדולות של פחמימות טבעיות וסינתטיות, microlyrays glycan הפכו טכנולוגיה תפוקה גבוהה עוצמה לחקר האינטראקציות של פחמימות עם מספר עצום של biomolecules 10 , 11 , </sup&gt; 12 , 13 . בתבנית מערך, כמות מינימלית של חומרים משמשים, ואת זה להציג multivalent של glycans רלוונטי מבחינה ביולוגית מאפשר חקירה של אלפי אינטראקציות מחייבות בניסוי אחד. חשוב לציין, טכנולוגיה זו יכולה להיות מיושמת גם גילוי ביולוגי ו לניטור תגובות החיסון בדגימות שונות 7 , 12 . מוצלח glycan ייצור microarray מחייב את השיקול של שלושה היבטים חשובים: סוג הרובוט מדפסת, כימיה glycan הצמידה, אופטיקה זיהוי. לגבי שיקול כלי ההדפסה, שתי טכניקות זמינות: מדפסות מגע ומגע. בדפוס מגע, 1-48 סיכות פלדה הם טבל לתוך צלחת מקור רב גם המכיל פתרון glycan והם הבחינו על שקופיות זכוכית פונקציונלי ידי מגע ישיר משטח שקופיות זכוכית. כמות הפתרון דה<html> הכבד לשקופית הוא פונקציה של משך זמן מתמשכת על משטח השקופית. בדרך כלל, הדגימות הם הראשונים מראש מנומר על בלוק זכוכית (כדי להגיע כתמים הומוגנית) לפני שהם מודפסים על משטח השקופית. במדפסות ללא מגע ( לדוגמה, מדפסת piezo אלקטרוני), גליקים מודפסים מן נימי זכוכית באמצעות אותות חשמליים מבוקרת. האות החשמלי יכול להיות מכויל היטב כדי להשיג הדפסה מדויקת יותר ביחס להדפסה של איש קשר. גודל ומורפולוגיה של כתמים הם גם יחסית הומוגנית יותר. יתרון נוסף הוא מיחזור המדגם חזרה לצלחת המקור לאחר ההדפסה. עם זאת, החיסרון העיקרי של מדפסות piezo-Electronic הוא הגבלת קצה ההדפסה (4 או 8), וכתוצאה מכך משך הדפסה ארוך מאוד, המחייב תשומת לב מיוחדת ליציבות שקופיות, טמפרטורה, לחות והתאדות מדגם. מדפסת הזרקת הדיו שאינה מזדקקת דורשת כמות גדולה יותר של מדפסות 14 . S = &quot;jove_content&quot;&gt; בניגוד לאפשרויות הזמינות המוגבלות לשיטות הדפסה, כימיה גליקן הצמידה היא שיקול מורכב יותר, עם אפשרויות רבות לבחירה. כימיה immobilization נבחר חייב בחשבון הן את הקבוצות הפעילות על glycans ואת תגובת משטח שקופיות. את glycans להיות משותקת על משטח מסוים microarray, או synthtically synthesized או מבודד באופן טבעי, כל דורשים קבוצה תגובתי זהה. בנוסף, glycans צריך להיות טהור הומוגנית. מצד שני, משטח immobilization ואת הכימיה צריכה לספק reproducibility וצפיפות מצורף אמין. שיטות רבות immobilization פותחו עם קוולנטיים או לא קוולנטי (קליטה פיזית) 10 , 11 , 12 , 13 . לקבלת מידע מפורט על מודפס טכנולוגיית microarray glycan עבור uninitiateD, עיין אלה ביקורות מצוינות 13 , 15 . חשוב לציין, המידע המינימלי האחרון הנדרש עבור ניסוי Glycomics (MIRAGE) יוזמה מתאר הנחיות להכנת המדגם 16 ולדיווח נתונים מניתוח microarray glycan 17 כדי לשפר את הסטנדרטים בתחום זה גדל. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור ייצור של microarrays sialoglycan באמצעות קשר ספציפי nano מדפסת בפורמט 16-היטב. כל אחד glycans יש אמין הראשי כי לתווך קוולנטי שלהם קישור אפוקסי-מופעל שקופיות זכוכית. כמו כן, אנו מתארים את הפיתוח והניתוח של שקף אחד באמצעות דגימות שונות של סרה אנושית, נוגדנים, וסטטינים של צמחים מחברים. מבחני microarray Sialoglycan לערב כמה צעדים עיקריים הכוללים ייצור מערך, עיבוד, פיתוח וניתוח. מערך מערך דורש תכנון arRay פריסה, הכנת glycans ואת צלחת המקור, תכנות nano מדפסת, והדפסת שקופיות. לאחר מכן, השקפים מעובדים, מפותחים, ונותחו ( איור 1 ).

<table><tbody><tr><td>אמין ראשוני המכיל סיאלוגליקנים</td><td>Glycohub, Inc., דייוויס, קליפורניה, ארה"ב (http://www.glycohub.com/services)</td><td>צור קשר info@glycohubusa.com לבקשות תרכובות</td><td>גליקנים מודפסים</td></tr><tr><td>מונוסודיום פוספט מונוהידראט</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td>רכיב חיץ הדפסה</td></tr><tr><td>דיסודיום פוספט הפטהידראט</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td>רכיב חיץ הדפסה</td></tr><tr><td>פוספט מאגר מי מלח</td><td>Hy-Labs</td><td>BP-507/500D</td><td>מאגר הדפסה/דגירה/כביסה</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>מגיב חסימת שקופיות</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא</td><td>G-7893</td><td>רכיב מאגר הדפסה</td></tr><tr><td>אתנולמין</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>0700/08</td><td>מגיב חסימת שקופיות</td></tr><tr><td>Ovalbumin (דרגה V)</td><td>Sigma</td><td>A5503</td><td>חלבון חוסם שקופיות</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P7949</td><td>חומר ניקוי כביסה שקופיות</td></tr><tr><td>Alexa 555-Hydrazide</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td></td><td>A20501MP סמן על מערך</td></tr><tr><td>ChromPure Human IgG, מולקולה שלמה</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>009-000-003</td><td>רכיב הדפסה</td></tr><tr><td>Biotinylated- SNA</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1305</td><td>לקטין צמחי &ndash; מחייב Sia-alpha2&ndash; 6-linked</td></tr><tr><td>Biotinylated-MALII</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1265</td><td>לקטין צמחי &ndash; מחייב Sia-alpha2&ndash; 3-linked</td></tr><tr><td>עוף-אנטי Neu5Gc IgY</td><td>BioLegend</td><td>146903</td><td>זיהוי ראשוני</td></tr><tr><td>Cy3-Streptavidin</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>016-160-0848</td><td>קשירת ביוטין</td></tr><tr><td>Cy3-anti Human IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>109-165-088</td><td>זיהוי משני כנגד IgG</td></tr><tr><td>אנושי Cy3-anti עוף IgY</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>703-165-155</td><td>משני גילוי נגד עוף IgY</td></tr><tr><td>דגימות סרום אנושי</td> בנק <td>הדם</td><td></td> הישראלי <td>גילוי ראשוני</td></tr><tr><td>חנקן דחוס (דרגה 5)</td><td></td><td></td> <td>כלי אבק/ייבוש כללי</td></tr><tr><td>שקופיות מצופות אפוקסי</td><td>קורנינג</td><td>40044</td><td>שקופיות</td></tr><tr><td>שקופיות מצופות אפוקסי</td><td>פוליאן</td><td>2D 104-00-221</td><td>שקופיות. בסוג זה של מגלשות המשטח הידרופובי יותר (בהשוואה לשקופיות ליבה) ולכן יהיה צורך להשלים את מאגר ההדפסה של הגליקנים עם 0.005% Tween-20 כדי להשיג 100 ומיקרו; כתמים בגודל מ'.</td></tr><tr><td>צלחת מיקרוטיטר 384 באר</td><td>Genetix</td><td>2070</td><td>צלחת הדפסה</td></tr><tr><td>VWR סמן מעבדה</td><td>VWR</td><td>52877-310</td><td>תיוג שקופיות</td></tr><tr><td>מערך</td><td>צינור מכתיםIt</td><td>MST</td><td>כלי פיתוח שקופיות</td></tr> אמבט <tr><td>מכתים</td><td>VWR</td><td>25608-904</td><td>כלי לפיתוח שקופיות</td></tr><tr><td>שקופיות מחזיקי זכוכית</td><td>VWR</td><td>631-9321</td><td>כלי</td></tr> <tr><td>לפיתוח שקופיותGenePix סורק</td><td>מכשירים מולקולריים</td><td>4000B</td><td>סורק שקופיות</td></tr><tr><td>LM-60 ננו-מדפסת</td><td>ArrayIt</td><td>LM-60</td><td>מערך סיכות מדפסת</td></tr><tr><td></td><td>ArrayIt</td><td>946MP3</td><td>סיכות הדפסה</td></tr><tr><td>מודול ProPlate Grace</td><td>Bio-Labs</td><td>P37004</td><td>מודול פיתוח שקופיות</td></tr><tr><td>מים מזוקקים</td><td>2321020500 ביו-מעבדה</td><td></td><td>נדרש עבור מערך ומכשיר אדים</td></tr><tr><td>Multi Pippete אלקטרוני, 8 ערוצים, טווח עוצמת קול 2-125 &mu; L</td><td>תרמו-פישר סיינטיפיק (מטריקס)</td> <td>MA-2131 Impact2 אקולייזר 384</td><td>רב פיפט לפיזור דגימה לצלחת של 384 בארות</td></tr></tbody></table>

פרופילינג נגד neu5gc igg ב sera האדם עם assay microarray sialoglycan

Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera with a Sialoglycan Microarray Assay 

תאים מכוסים בגלימה של שרשרות פחמימות (גלייקנים) שמשתנות בדרך כלל בסרטן וכוללות וריאציות של ביטוי חומצי סיאלי (Sia). אלה הם סוכרים חומצי כי יש 9-פחמן עמוד השדרה וכי מכסה חוליות glycans על משטחי התא. שני של צורות סיה הגדולות היונקים הם N- Acetylneuraminic חומצה (Neu5Ac) ואת טופס hydroxylated שלה, N- glycolylneuraminic חומצה (Neu5Gc). בני אדם לא יכולים לייצר אנדוגניים Neu5Gc עקב השבתה של הגן קידוד cytidine 5&#39;monophosphate-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) hydroxylase (CMAH). זר Neu5Gc נרכש על ידי תאים אנושיים באמצעות הצריכה התזונתיים של בשר אדום ומוצרי חלב ולאחר מכן מופיע על glycans מגוונים על פני התא, צובר בעיקר על קרצינומה. כתוצאה מכך, בני אדם מפזרים נוגדנים נגד Neu5Gc שמשחקים תפקידים מגוונים בסרטן ומחלות דלקתיות כרוניות אחרות, אשר הופכים לתהליכים אבחנתיים וטיפוליים פוטנציאלייםתקציבים. כאן, אנו מתארים תפוקה גבוהה sialoglycan assay microarray להעריך נוגדנים אלה נגד Neu5Gc בסרה האדם. Neu5Gc המכילים glycans ואת זוגות מתאימים שלהם של פקדים (Neu5Ac המכילים glycans), כל אחד עם אמין העיקרי הליבה, הם מקושרים קוולנטית כדי אפוקסי מצופה זכוכית שקופיות. אנו מדגימים את הדפסת 56 שקופיות בפורמט 16-היטב באמצעות מדפסת nano ספציפית מסוגל לייצר עד 896 מערכים לכל הדפסה. כל שקופית ניתן להשתמש כדי המסך 16 שונים דגימות sera האדם להערכת אנטי Neu5Gc נוגדנים, ספציפיות וגיוון. הפרוטוקול מתאר את המורכבות של כלי זה חזק ומספק הנחיה בסיסית עבור אלה שמטרתם לחקור את התגובה Neu5Gc פחמימות תזונתיים אנטיגן בדגימות קליניות מגוונות בפורמט מערך.

מערך הדפסה, פיתוח וניתוח: הדפסת microarray sialoglycan עם דגימות glycan מרובים האדם IgG STD עקומות ב 16 בלוקים שונים דורש כיול יסודי על מנת להבטיח כי כל הדגימות מודפסים כמו אחיד ככל האפשר בכל 16 בלוקים לכל שקופית לכל שקופיות באותה הדפסה לרוץ. לכן, ניסויים כיול מרובים נדרשים לפני הפרמטרים הדפסה ספציפיים נקבעים, כולל הרכב חיץ עבור כל סוג של מדגם, סוג שק...

Assay microarray sialoglycan ניתן להשתמש כדי להעריך נוגדנים נוגדי Neu5Gc ב sera האדם, מה שהופך אותו assay אבחון תפוקה גבוהה פוטנציאל לסרטן ומחלות כרוניות אחרות מתווך דלקת כרונית.

פרופילינג נגד Neu5Gc IgG ב Sera האדם עם Assay Microarray Sialoglycan

Cells are covered with a cloak of carbohydrate chains (glycans) that is commonly altered in cancer and that includes variations in sialic acid (Sia) ...

המטרה הכוללת של בדיקת המיקרו-מערך של סיאלוגליקן היא להעריך את Anti-Neu5Gc IgG בסרום אנושי באופן בעל תפוקה גבוהה כנגד אוסף מגוון של סיאלוגליקנים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הגליקואימונולוגיה, כגון כיצד נוגדנים Anti-Neu5Gc מעורבים במחלות אנושיות שונות כולל סרטן, מחלות לב והשתלת זרים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת פרופיל תפוקה גבוהה של נוגדנים Anti-Neu5Gc כנגד מספר עצום של אנטיגנים סיאלוגליקניים.תדגים את ההליך שרון יהודה, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי. תכנון קפדני ומפורט של ייצור ופריסת המערך חשוב כדי להבטיח הצלחה. תהליך זה מפורט בפרוטוקול הטקסט ובמידע המשלים.יש לדלל כל גליקן ל-100 מיקרומולר בנפח כולל של 100 מיקרוליטר של מאגר הדפסת גליקן בצינורות מיקרו-צנטריפוגה. לאחר מכן, הכינו אמין ראשוני המכיל צבע פלורסנט למיליגרם אחד למילימטר עם מאגר סמן. לאחר מכן, יש לדלל למיקרוגרם אחד למיליליטר בנפח כולל של מיליליטר אחד.הכן דילול עקומה סטנדרטית של IgG אנושי כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מניחים את צלחת הבאר 384 על קרח. באמצעות מולטי-פיפטה אלקטרונית, ציטט שבעה מיקרוליטרים מכל גליקן, סמן ועקומת כוכב IgG בהתאם לפריסת הלוח שנמצאת בפרוטוקול הטקסט.מכסים את הצלחת בפרפילם ומסתובבים במשך שתי דקות בחום של 250 פעמים גרם ו -12 מעלות צלזיוס. ההדפסה חייבת להתבצע באזור נטול אבק עם לחות של 60 עד 70%כאן, כל השלבים מתבצעים בחדר נקי עם כפפות ובגדים מתאימים להגנה. הפעל את מכונת מדפסת הננו ומכשיר האדים.לאחר תכנות מכונת ההדפסה כמתואר בפרוטוקול הטקסט, מקם את לוחית הבאר 384 עם דגימות מצויטות במיקומה על סיפון המערך והסר את מכסה הפרפילם. בשלב זה, התחל להדפיס. מספר את השקופיות בעזרת עט סימון עמיד בפני ממס אלכוהול, ואחסן אותן בקופסה אטומה בוואקום בחושך.כדי לעבד את המערכים, הסר תחילה שקופית מהקופסה האטומה בוואקום והנח אותה במכסה מנוע כימי למשך חמש דקות, מערך כלפי מעלה, כדי לאדות את עודפי הנוזל. לאחר מכן, הרטיבו את השקופית על ידי הנחתה בצינור מכתים מלא במים נטולי יונים. מכסים את הצינור בנייר כסף ודוגרים במשך חמש דקות בניעור איטי ועדין בטמפרטורת החדר.כדי לחסום את קבוצות האפוקסי התגובתיות בשקופית, טבלו את השקופית בצינור הצביעה של 50 מיליליטר המלא בתמיסת חסימת אתנולאמין מחוממת מראש. מכסים את הצינור בנייר כסף ודוגרים למשך 30 דקות בניעור איטי ועדין בטמפרטורת החדר. השליכו את תמיסת חסימת האתנולאמין לתוך מיכל האשפה הביולוגי המתאים.לאחר מכן, הנח את השקופית בצינור צביעה חדש ונקי מלא במים נטולי יונים של 50 מעלות צלזיוס. מכסים את הצינור בנייר כסף ודוגרים למשך 10 דקות בניעור איטי ועדין בטמפרטורת החדר. השליכו את המים והעבירו את השקופיות למחזיק כתמים מזכוכית.הנח את המכשיר לתוך מחזיק צלחת מתנדנד וצנטריפוגה את המגלשה יבשה. לאחר מכן, הנח את השקופית על מחיצה של 16 בארות. לאחר הרטבת הבארות מראש, השתמש ברב פיפטה כדי להוציא 200 מיקרוליטר PBST לבארות המגלשה.לאחר מכן, הניחו אותם בתא מכוסה ולח ונערו במשך חמש דקות. הסר את ה-PBST על ידי החלקה והקשה עדינה על מגבת נייר נקייה. לאחר מכן, הכניסו 200 מיקרוליטר של מאגר חוסם PBS-Ovalbumine לכל באר.מניחים את המגלשות בתא לח ומדגרים למשך שעה בטמפרטורת החדר בניעור עדין. לאחר מכן, הכן את הזיהוי הראשוני, מדולל במאגר חסימת PBS-OVA כמתואר בפרוטוקול הטקסט. החלק את המאגר החוסם PBS-OVA מהמגלשה והוסף 200 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני לכל באר.דגרו את המגלשות בתא לח למשך שעתיים. לאחר מכן, החלק את הזיהוי הראשי מהמגלשה ושטוף שלוש פעמים עם PBST. דגרו את המגלשה ב-PBST למשך חמש דקות בתא לח לפני שטיפה אחרונה עם PBST.לאחר מכן, שטפו פעם אחת עם PBS. לאחר מכן, הכן את הנוגדן המשני ב-PBS כמתואר בפרוטוקול הטקסט. החלק את ה-PBS מהשקף והוסף 200 מיקרוליטר של נוגדן משני.החלק את הנוגדן המשני מהשקף ושטוף ארבע פעמים עם PBST כמו קודם. הסר בזהירות את המסגרת, ואז הנח את השקופיות לתוך צינור צביעת שקופיות של 50 מיליליטר מלא ב- PBS ונער במשך חמש דקות. לאחר מכן, מלאו שתי אמבטיות מכתים שקופיות במים דה-יונים.הנח את המגלשה לתוך מחזיק המגלשה וטבל את המגלשה באמבטיה הראשונה. טבלו במהירות את השקופית עשר פעמים. לאחר מכן, העבירו את השקופית לאמבטיה השנייה וטבלו עשר פעמים נוספות.לאחר הטבילה, דגרו את המגלשה למשך עשר דקות בטמפרטורת החדר עם ניעור. לאחר הדגירה, השליכו את המים והעבירו את המגלשה למחזיק מכתים מזכוכית. הנח את מחזיק מכתמי הזכוכית במחזיק צלחת מתנדנד וצנטריפוגה את המגלשה יבשה.פתח את דלת הסורק והנח את המגלשה בפנים, המערך פונה כלפי מטה. בשלב זה, התחל את הסריקה. שמור את השקופיות הסרוקות כקובץ TIFF.כדי להכין שקופית לניתוח, בחר טען רשימת מערכים"והעלה את קובץ ה-GAL המתאים הממפה את המערכים בכל בלוק בשקופית. השקופיות פותחו עם 16 חלקי זיהוי ראשוניים שונים, אחד בכל בלוק. הצמח לקטין SNA קושר חומצה סיאלית מקושרת a2-6.ואילו הצמח לקטין MALII קושר חומצה סיאלית מקושרת a2-3. Polyclonal Anti-Neu5Gc IgY קושר סיאלוגליקנים המכילים Neu5Gc אך אינו קושר סיאלוגליקנים המכילים Neu5Ac. כדי לאפיין את Anti-Neu5Gc IgG, נותחו 12 סרות מתורמים אנושיים בריאים על המיקרו-מערך הסיאלוגליקן המודפס ופותחו באמצעות IgG אנטי-אנושי עם תווית פלואורסצנטית בנורמליזציה לננוגרם למיקרוליטר.כל הסרומים האנושיים שנבדקו הכילו רמות שונות של Anti-Neu5Gc IgG כמעט ללא זיהוי של הזוגות התואמים של סיאלוגליקנים המכילים Neu5Ac. יתר על כן, דפוסי זיהוי IgG נגד Neu5Gc מגוונים מאוד בין 12 הסרות השונות הללו, הן ברמת העוצמה והן בגיוון. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור פרופיל נוגדנים נגד Neu5Gc בדגימות אנושיות שונות בצורה בעלת תפוקה גבוהה, באמצעות מערכת מיקרו-מערך גליקן.

profiling-anti-neu5gc-igg-human-sera-with-sialoglycan-microarray

Research

JoVE Journal

Behavior

התנהגות

במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול משופר עבור microarray תפוקה גבוהה מרובב נוגדנים עם שיטת הזיהוי lectin כי ניתן להשתמש פרופיל glycosylation של חלבונים מסוימים. פרוטוקול זה כולל ריאגנטים אמינים חדשים מפחית באופן משמעותי את הזמן, עלויות, ציוד מעבדה דרישות לעומת בהליך הקודם.

נוגדן microarray כימי חסומים פרופיל תפוקה גבוהה מרובב של Glycosylation חלבון מסוים בדגימות מורכבות

סרטון זה מדגים טכנולוגיית מערך גליקן מודפס לניתוח נוגדנים אנטי-גליקניים במחזור בסרום עכברים. הנוגדנים בסרום אינטראקציה עם גליקנים ספציפיים על השבב, אשר אושר על ידי immunostaining ואחריו סריקה פלואורסצנטית.

איתור נוגדנים אנטי-גליקניים במחזור הדם עם מערך גליקן מודפס

באמצעות אסטרטגיית מיקרו-מערך גליקן מודפסת, מבחן צלחת קונבנציונאלי של 96 בארות ממוזער לניתוח של נגיף ההמגלוטינין של נגיף השפעת A והספציפיות לקולטנים המכילים חומצה סיאלית.

Assay Microarray מיניאטורי glycan להערכת הלהיטות וספציפיות של Hemagglutinins וירוס שפעת A

אנו מתארים כאן שיטה ליצירת מיקרו-מערכי אנטיגן הניתנים להתאמה אישית שניתן להשתמש בהם לזיהוי בו-זמני של נוגדנים עצמיים IgG ו-IgM בסרום מבני אדם ועכברים. מערכים אלה מאפשרים זיהוי תפוקה גבוהה וכמותית של נוגדנים כנגד אנטיגנים או אפיטופים מעניינים.

דור שני צבעים Antigen Microarrays לאיתור סימולטני של IgG ו- IgM נוגדנים עצמיים

בגישה מודולרית הסינתזה של N- glycans עבור הקובץ המצורף הזכוכית מצופה אלומיניום אוקסיד שקופיות (שקופית ACG) וגם microarray glycan פותחה לשימוש פרופיל של HIV בהרחבה נטרול נוגדנים הוכח.

כימותרפיה-אנזימטי סינתזה של N- glycans עבור מערך פיתוח נוגדן HIV פרופיל

עבודה זו מציגה את הפוטנציאל של טכנולוגיית מערך (PGA) glycan המודפס על הניתוח של מחזורי נוגדנים אנטי-פחמימות בבעלי חיים קטנים.

מערך Glycan המודפס: טכניקה רגישה לניתוח של הרפרטואר של מחזורי נוגדנים אנטי-פחמימות בבעלי חיים קטנים

אנו מציגים פרוטוקול לשימוש מיקרוarray חלבון שנבנה על ידי הדפסת אנטיגנים שפעת על ניטרוצלולוזה מצופה שקופיות בו סרום בדיקה עבור נוגדנים מרובים isotypes נגד מעל 250 אנטיגנים מפני זנים וירוסים שונים, ובכך המאפשר מדידה של רוחב של נוגדנים סרום ברחבי תת וירוס.

שימוש של מיקרוarray אנטיגן שפעת כדי למדוד את היקף של נוגדנים סרום ברחבי תת וירוס

אימונוגלובולין G (IgG) N-גליקן מאופיין באמצעות כרומטוגרפיה של אינטראקציה הידרופילית. בנוסף, המבנה של IgG N-גליקן מופרד בבירור. המוצג כאן הוא מבוא לשיטה ניסיונית זו, כך שניתן להשתמש בה באופן נרחב בהגדרות מחקר.

אימונוגלובולין G N-גליקן ניתוח באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית במיוחד

דפוס הגליקוזילציה של הנוגדן קובע את ביצועיו הקליניים, ולכן נמשכים המאמצים התעשייתיים והאקדמיים לשלוט בגליקוזילציה. מאחר שקמפיינים טיפוסיים של גליקו-הנדסה הם עתירי זמן ועבודה, יצירת פרוטוקול מהיר לאפיון ההשפעה של גנים של גליקוסילציה באמצעות השתקה חולפת תתברר כיעילה.

גליקו-הנדסה מהירה של נוגדנים בתאי שחלת אוגר סיניים

פרופיל פולימר Microarray (MAPP) היא טכניקה בעלת תפוקה גבוהה לניתוח הרכב גליקנים בדגימות ביולוגיות.

פרופיל פולימר Microarray (MAPP) לניתוח גליקן בתפוקה גבוהה

למדו פרופילינג נגד נוגדני IgG ל-Neu5Gc בסרום אנושי באמצעות מערך סיאלוגליקנים. שיטה זו מאפשרת ניתוח תפקודי גליקואימונולוגיה במחלות כמו סרטן ודלקת כרונית.

פרופילינג נגד Neu5Gc IgG ב Sera האדם עם Assay Microarray Sialoglycan

גלה סרטונים נוספים