אין ויוו זיהוי וניתוח של SUMOylation חלבון Rb בתאי אדם

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לזהות חלבוני רטינובלסטומה SUMOylation בתנאים אנדוגניים ואקסוגניים בתאים אנושיים. חלבונים קטנים הקשורים ליוביקוויטין, או SUMO, מצומדים לשאריות הליזין של חלבוני המטרה כדי לווסת תהליכים תאיים שונים. בדרך כלל, זה מאתגר יותר להתחיל חלבון SUMOylation בתאים בגלל המורכבות של SUMOylation in vivo.

ניסוי זה מזהה את ה-SUMOylation של חלבוני Rb אנדוגניים ואקסוגניים כאחד. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי SUMOylation של חלבוני Rb, היא מתאימה גם לזיהוי של חלבוני מטרה רבים אחרים של SUMO בתאים. כדי להתחיל, הוסיפו 25 מיליליטר של DMEM המכילים אחוז אחד של פטרפטומיצין פניצילין, ודגרו על תאי HEK293 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות.

שוטפים את התאים מהצלחת באמצעות שלושה מיליליטר PBS קר כקרח. לאחר מכן העבירו את התאים לצינור חדש של חמישה מיליליטר. כדי להשיג תאים בשלב G1 בסוף תהליך הסנכרון G0, הסר את ה-DMEM והוסף בחזרה מצע גידול טרי, ובכך לאפשר לתאי HEK293 להיכנס מחדש למחזור התא.

לאחר מכן אסוף את התאים בשלבי G1 שונים לניתוח מחזור התא ובדיקת SUMO נוספת. כדי לסנכרן את תאי HEK293 בשלב S, השתמש בשיטת חסימת התימידין הכפולה. ראשית, גדל את תאי HEK293 למפגש של 50%ואז שטוף את התאים עם PBS מחומם מראש.

הוסף מדיום גידול בתוספת 2.5 מילי-מולרי תימידין למשך 18 שעות כבלוק הראשון. הסר את המדיום המכיל תימידין ושטוף את התאים פעמיים עם PBS מחומם מראש. הוסף מדיום גידול טרי למשך 14 שעות כדי לשחרר את התאים מהבלוק.

לאחר שחרור התאים מהבלוק הראשון, השליכו את המדיום בעזרת פיפטה. לאחר מכן הוסף מדיום גידול בתוספת 2.5 מילי-מולרי תימידין למשך 18 שעות נוספות כבלוק השני לפני ביצוע ניתוח של מחזור התא ו-Rb SUMOylation. לסנכרון פאזה G2, או M, צלחת כ-15 מיליון תאי HEK293 על צלחת של 15 סנטימטר עם 25 מיליליטר של מצע גידול, וגידול במשך 24 שעות.

לאחר מכן מוסיפים ניקוטיזול למדיום עד לקבלת ריכוז סופי של 400 ננוגרם למיליליטר. לבסוף, דגרו על התאים למשך 16 שעות לפני ביצוע ניתוח מחזור התא על ידי זרימה ציטומטרית כמתואר בפרוטוקול הטקסט. ליז את תאי HEK293 המסונכרנים על ידי השעיה מחדש בעדינות במיליליטר אחד של בדיקת רדיו-אימונו-משקעים קרים כקרח, או RIPA, מאגר ליזה המכיל מעכב איזופפטידאז שנוסף לאחרונה כדי לחסום פרוטאזות SUMO ולייצב את צימודי SUMO.

הומוגניזציה נוספת של התאים על הקרח על ידי העברתם דרך מחט בגודל 21 המחוברת למזרק של שני מיליליטר 10 פעמים. לאחר מכן דגרו את התאים על הקרח למשך חמש דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה התא ליזה ב -18000 פעמים G למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר הצנטריפוגה, העבירו את הסופרנטנטים לצינורות מיקרו-צנטריפוגות חדשים של 1.5 מיליליטר. לסופרנטנטים, הוסף מיקרוגרם אחד של אימונוגלובולין G של עכבר לא ספציפי מאותו מין ואיזוטיפ כמו נוגדן ה-Rb החד-שבטי. כמו כן, הוסיפו 20 מיקרוליטר של 50 אחוז חלבון AG sepiroslurry, ואז דגרו את התערובת למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס בסיבוב עדין.

צנטריפוגה את הדגימות בשלושת אלפים פעמים גרם למשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס. אסוף בזהירות את הסופרנטנטים מבלי להפריע לחרוזים והעביר אותם לצינורות מיקרו צנטריפוגות חדשים של נקודה וחמישה מיליליטר. לכל אחת מהדגימות, הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של נוגדן ראשוני rb ו-40 מיקרוליטר של 50 אחוז חלבון ag sephyroslurry ואז דגרו את הדגימות למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב עדין.

לאחר הצנטריפוגה יש לשטוף את החרוזים עם מיליליטר אחד של מאגר הריפה. מערבבים היטב את הצינורות על ידי סיבוב בארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן אוספים את החרוזים על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה כמו קודם וזורקים את הסופרנטנטים.

לאחר ביצוע הכביסה ארבע פעמים, השעו מחדש את החרוזים ב-30 מיקרוליטר של אחד x נתרן דודקלסולפט פוליאקרילימיד ג'ל אלקטרופורזה וערבבו היטב. דגרו את הצינורות בחום של 100 מעלות צלזיוס בגוש חום למשך 10 דקות. צנטריפוגה את הדגימות ב -12 אלף פעמים גרם למשך דקה אחת כדי לגלול את החרוזים.

לבסוף, אספו בזהירות את הסופרנטנטים מבלי להפריע לחרוזים והעבירו אותם לנקודה אחת של צינורות מיקרו-צנטריפוגה של חמישה מיליליטר. בצע טרנספקציה של תרבית תאים וליזיס תאים של תאי HEK293 כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן שטפו 25 מיקרוליטר של חרוזי אגורוס של חומצה ניקרולוטריאצטית של 50 אחוז ניקל עם מאגר ריפה בצינור מיקרו צנטריפוגה של נקודה אחת של חמישה מיליליטר לכל דגימה.

אוספים את החרוזים על ידי צנטריפוגה בשלושת אלפים פעמים גרם למשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס. הוסף אמיטוזול טוחנת אחת לכל דגימה כדי לקבל ריכוז סופי של 10 מילימולר. לאחר מכן הוסף כל דגימה לצינור המכיל את חרוזי האגוס המוכנים.

דגרו על החרוזים והליזטים במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס בסיבוב עדין. לאחר מכן סובבו את החרוזים בשלושת אלפים פעמים גרם למשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה, הסר בזהירות את הסופרנטנטים על ידי צינור.

כדי למנוע אובדן חרוזים, אין לשאוב את החרוזים יבשים. לאחר מכן, שטפו את החרוזים עם מיליליטר אחד של מאגר כביסה המכיל 20 מיליטוזול מולרי. מערבבים היטב את הצינורות על ידי סיבוב בארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפני איסוף החרוזים על ידי סיבוב.

לאחר הכביסה האחרונה, הוסף 30 מיקרוליטר של המאגר האלאוסי המכיל 250 מילי-מולרי אמיטוזול לכל דגימה והחליק לערבב. לאחר מכן דגרו את הדגימות למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לסלק את החלבונים. מערבבים כל דגימה עם מאגר טעינת דפים של שישה x SDS.

לאחר מכן דגרו את הצינורות בחום של 100 מעלות צלזיוס בגוש חום למשך 10 דקות. לאחר צנטריפוגה, טען את הדגימות החיסוניות או הנפתחות על ג'ל עמוד SDS בשיפוע של ארבעה אחוזים עד 20 אחוזים. מוליך אלקטרופורזה ב -120 וולט למשך 90 דקות כדי להפריד את החלבונים.

לאחר סנכרון מחזור התא והמשקעים החיסוניים של מיני ה-rb האנדוגניים, נוכחות אות ה-SUMO זוהתה באופן ספציפי על ידי נוגדן אנטי-SUMO One בשלב G1 המוקדם. תוצאות מייצגות מראות את ה-SUMOylation הכפוי של חלבון ה-rb על ידי מיזוג ישיר של האנזים SUMO E2 UBC9 למסוף C שלו. שימו לב לחלבון ה-RB הנודד האיטי ביותר של SUMOylated.

על ידי שימוש במוטציה חסרת SUMO של rb, K720R, הנוכחות של rb SUMOylation בתאים, מאושרת עוד יותר. אז בהליך זה, ניתן לנתח חלבוני מטרה רבים אחרים של SUMO בתאים מתורבתים. ברוב המקרים רק חלק קטן מאוד מהמצע הוא SUMOylated, ולכן בעת ניסיון הליך זה חשוב לייעל את יעילות המשקעים החיסוניים.