Name: אין ויוו זיהוי וניתוח של SUMOylation חלבון Rb בתאי אדם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: למד לזהות ולנתח SUMOylation של חלבון Rb בתאי אדם בשיטת in vivo. הפרוטוקול משתמש בתאי HEK293 ומספק בסיס לחקר חלבוני SUMO נוספים בתאים תרבתיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מן המדע, הטכנולוגיה עמלה של שנגחאי (מענק מס 14411961800) הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (מענק מס 81300805).

1-זיהוי של אנדוגני Rb SUMOylation בשלב G1 מוקדם <ol><li>תא סינכרון תרבות, מחזור התא.
	<ol><li>HEK293 לשמור על תאים מדיום הגידול המכיל Dulbecco &#39; s השתנה נשר בינוני (DMEM) בתוספת 1% עט-דלקת ו-10% עוברית שור סרום (FBS)-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO 2 בתוך אינקובטור.</li>
		<li>לסנכרן את התאים HEK293 בשלב G0.
		<ol><li>ספירת התאים HEK293 משתמש של hemocytometer וזרע ~1.5 x 10 7 תאים 15 ס מ צלחת עם 25 מ ל מדיום הגידול עבור 24 שעות לפני הטיפול. כשמגיעים זרימה של 70% - 80%, לשאוב את המדיום ואת שטיפת התאים פעמיים עם 5 מ"ל prewarmed באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS).</li>
			<li>להוסיף 25 מ ל DMEM המכיל 1% פניצילין-סטרפטומיצין דגירה התאים ב 37 ° C עבור ה 72 לשטוף את התאים מהצלחת באמצעות 3 מ"ל PBS קר כקרח. להעביר את התאים לתוך צינור 5 מ ל.</li>
			<li>נושא חלק קטן של תאים ניתוח מחזור התא על ידי cytometry זרימה (שלב 1.2); איסוף רוב התאים הנותרים על ידי צנטריפוגה-200 g x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן לאחסן אותם במקפיא טמפרטורה האולטרה-נמוך עד ניתוח של Rb SUMOylation.</li>
		</ol></li> <li>כדי להשיג שלב G1 תאים, בסופו של תהליך הסינכרון G0, להסיר את DMEM ולהוסיף מדיום הגידול חוזרים רעננים, ובכך מאפשר את התאים HEK293 להזין מחדש את מחזור התא. לאחר מכן, לאסוף את התאים ב G1 לויזה (G1 מוקדם: 30 דקות; G1: 2 h) עבור מחזור התא ניתוח וסומו נוספת assay.</li>
		<li>לסנכרן את התאים HEK293 בשלב S בשיטת כפול-תימידין בלוק.
		תאים <ol><li>לתאים לגדול HEK293 confluency של 50%, לשטוף עם prewarmed PBS. לאחר מכן להוסיף את מדיום הגידול בתוספת 2.5 מ"מ תימידין עבור 18 h (רחוב הראשונים).</li>
			<li>להסיר את המדיום המכיל תימידין, ולאחר מכן לשטוף את התאים פעמיים עם prewarmed PBS. הוסף את מדיום הגידול טריים עבור 14 h לשחרר את התאים.</li>
			<li>למחוק את המדיום עם פיפטה ולהוסיף מדיום הגידול בתוספת 2.5 מ"מ תימידין עבור עוד 18 h (בלוק השני) לפני ביצוע ניתוח של מחזור התא, Rb SUMOylation.</li>
		</ol></li> <li>הסינכרון עבור ה G2/M, צלחת ~1.5 × 10 7 HEK293 לתאים מאכל 15 ס מ עם 25 מ ל מדיום הגידול במשך 24 שעות ביממה. לאחר מכן להוסיף nocodazole המדיום עד ריכוז סופי של 400 ננוגרם למ"ל, מתקבל. לבסוף, דגירה את התאים עבור 16 h לפני ביצוע הניתוח של מחזור התא, Rb SUMOylation.</li>
	</ol></li> <li>ניתוח מחזור התא על ידי cytometry זרימה.
	<ol><li>מחדש להשעות את HEK293 מסונכרנות ב- PBS ולאחר מכן לתקן התליה תא באמצעות אתנול 70% קר כקרח עבור 2 h-4 מעלות צלזיוס. שים לב כי כדי למזער תא קיבוץ באשכולות, להוסיף התליה תא dropwise קר כקרח האתנול 100% בריכוז סופי של 70% אתנול תוך בעדינות vortexing.</li>
		<li>Centrifuge את התאים עבור 5 דקות ב 500 x g, ואז למחוק את תגובת שיקוע בקפידה-לשטוף את התאים פעמיים עם PBS. חזור על השלב צנטריפוגה.</li>
		50 המכיל <li>להוסיף 500 µL PBS µg/mL חומצת גרעין כתם propidium יודיד, 0.1% טריטון X-100 ו- 1 µg/mL RNase A לתאים ומערבבים היטב. דגירה התאים למשך 15 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>לאחסן את הדגימות ב 4 ° C עד ניתוח על ידי cytometry זרימה.</li>
	</ol></li> <li>Immunoprecipitation של חלבון Rb אנדוגני.
	Lysates תא <ol><li>להכין HEK293.
		<ol><li>Lyse התאים HEK293 מסונכרן על ידי בעדינות השעיית אותם מחדש ב 1 מ"ל של רדיו כקרח-immunoprecipitation assay (ריפה) פירוק מאגר (טבלה 1) המכיל טרי הוסיף 20 מ מ N-Ethylmaleimide, מעכב isopeptidase יכול לחסום סומו פרוטאזות ולייצב את הסומו conjugates.</li>
			<li>עוד homogenize את התאים על הקרח על ידי דאונס המגון, sonication או פשוט עובר עשר פעמים דרך מחט 21 G המחובר מזרק 2 מ"ל. לאחר מכן, דגירה התאים על קרח 5 דק 
			הערה: anionic דטרגנט נתרן dodecyl גופרתי (מרחביות) במאגר ריפה הוא קריטי עבור קביעת מאוחר יותר Rb-הסומו, כמו זה יכול לחסל את האות סומו לא ספציפי זה נגזרת מהאינטראקציה הלא-קוולנטיות בין חלבון Rb לבין השני סומו-מינים שאינם Rb.</li>
		</ol></li> <li>Centrifuge את lysates תא ב g x 18,000 למשך 30 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס להעביר supernatants את צינורות חדשים של מיקרו-צנטריפוגה 1.5 mL- 
		הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן. ניתן לאחסן את החלבונים ב-80 מעלות צלזיוס במשך לפחות 6 חודשים.</li>
		<li>להכין את השליטה כל מדגם קלט תספיג מאוחר יותר, לשמור חלק קטן תגובת שיקוע שתוארו לעיל שפופרת חדשה בעלת החנות ב-80 מעלות צלזיוס</li>
		<li>כדי supernatants הנ ל, להוסיף µg 1 של העכבר לא ספציפית אימונוגלובולין G (IgG) של מינים, isotype אותו כמו הנוגדן monoclonal Rb ו 20 µL של 50% חלבון A/G-sepharose slurry. לאחר מכן, תקופת דגירה של h 1 ב 4 ° C עם סיבוב עדין.</li>
		<li>Centrifuge הדגימות ב 3000 g x במשך 3 דקות ב-4 ° C. בזהירות לאסוף את supernatants מבלי להפריע את החרוזים, ומעבירים אותם אל צינורות מיקרו-צנטריפוגה 1.5 mL החדש. לכל אחד הדגימות, מוסיפים נוגדן ראשוני Rb µL 5 µL 40 50% חלבון slurry A/G-sepharose. לאחר מכן, דגירה בין לילה ב 4 ° C עם סיבוב עדין.</li>
		<li>לאסוף את החרוזים על ידי צנטריפוגה ב g x 3000 דקות 3-4 מעלות צלזיוס, הסר בזהירות את תגובת שיקוע על-ידי pipetting. שימו לב כי על מנת למנוע אובדן חרוז, לא תשאף היבשה חרוזים.</li>
		<li>לרחוץ את החרוזים ארבע פעמים עם 1 מ"ל של המאגר ריפה. כל הזמן, לערבב הצינורות על ידי סיבוב אותם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות לאסוף את החרוזים על ידי צנטריפוגה מהירות נמוכה ב x 3000 g למשך 3 דקות ב 4 ° C ולאחר מכן למחוק את supernatants.</li>
		<li>לאחר הסרת supernatants בכביסה הסופי, מחדש להשעות את החרוזים ב 30 µL 1 x נתרן dodecyl סולפט-לזיהוי ג'ל אלקטרופורזה (מרחביות-עמוד) טעינת מאגר (טבלה 1) ומערבבים היטב.
		<ol><li>Incubate הצינורות ב 100 ° C בחום לחסום עבור 10 דקות Centrifuge את הדגימות-g x 12,000 עבור 1 דקות הצניפה החרוזים. בזהירות לאסוף את supernatants מבלי להפריע את החרוזים, ולהעביר אותם ל 1.5 mL מיקרו-צנטריפוגה צינורות.</li>
		</ol></li> <li>נתח הדגימות מאת 4-20% הדרגתיות מרחביות-דף ג'ל ומערביות כתם או לאחסן אותם ב-20 ° C לשימוש מאוחר יותר.</li>
	</ol></li></ol> 2. ניתוח של מתויג 6XHis SUMOylation Rb אקסוגני בתאי אדם <ol><li>תא תרבות, תרביות תאים.
	6 HEK293 <ol><li>זרע ~ 6 × 10 בתאים 10 ס מ צלחת, תקופת דגירה של 24 שעות ביממה במדיום הגידול בתנאים התרבות תאים נורמליים לרכוש תאים confluent 75-85%. לפני תרביות תאים, הסר את מדיום הגידול ולהוסיף 6 מ של מדיום מופחת סרום prewarmed (ראה טבלה של חומרים) ולאחר מכן מקם את הכלים בחזרה לתוך החממה.</li>
		<li>עבור Rb קונסטיטוטיביות SUMOylation assay, להוסיף 15 µg כל 6XHis מתויג Rb-Ubc9-WT, Rb-Ubc9-C93S, Ubc9-WT, Ubc9-C93S פלסמידים במדיום מופחת סרום µL 500 1.5 mL מיקרו-צנטריפוגה צינורות, בהתאמה.
		<ol><li>כדי לנתח את הסומו-ההטיה של פראי סוג Rb ואת המוטציה שלה תקינה SUMOylation, לערבב µg 10 של גם מתויג 6XHis Rb-WT או Rb-K720R פלסמיד יחד עם GFP-SUMO1 (10 µg) ב- 500 µL מופחת סרום במדיום 1.5 mL מיקרו-צנטריפוגה צינורות 13.</li>
		</ol></li> <li>בינתיים, בשפופרת נפרדת, מערבבים 50 ריאגנט תרביות תאים µL (ראה טבלה של חומרים) ב- 500 µL מופחת סרום בינוני, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דק</li>
		<li>לשלב את שני הצינורות נפרד שתוארה לעיל, ואת דגירה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות הוספה תרביות תאים מתחמי ריאגנט/פלסמיד לתאים באופן מלא להמשיך תרבות 8 h ב- 5% CO 2 ו- 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>להחליף מופחת סרום בינוני עם צמיחה בינוני ולאחר דגירה את התאים בתנאים נורמליים תרבות במשך 48 שעות לאחר תרביות תאים.</li>
	</ol></li> <li>ניקל זיקה לנתץ חלבון Rb מתויג 6XHis.
	<ol><li>Lyse התאים HEK293 transfected ולחלץ את החלבונים הכולל המתואר בסעיף 1.3.1.</li>
		<li>צנטריפוגה lysates תא ב g 18,000 x למשך 30 דקות ב-4 ° C. בזהירות לאסוף את supernatants ומעבירים אותם אל צינורות נקיים. 
		הערה: החלבון שיכול להיות קפוא בנקודה זו במשך יותר מ-6 חודשים ב-80 מעלות צלזיוס</li>
		<li>להכין את השליטה כל מדגם קלט תספיג מאוחר יותר, לחסוך חלק קטן supernatants המתואר לעיל צינור חדש ו החנות ב-80 מעלות צלזיוס</li>
		<li>שטיפת 25 µL של 50% ניקל nitrilotriacetic חומצה agarose (Ni-נ) חרוזים עם מאגר ריפה פעמיים ב שפופרת מיקרו-צנטרפוגה 1.5 mL עבור כל דגימה. לאסוף את החרוזים על ידי צנטריפוגה ב g x 3000 דקות 3-4 מעלות צלזיוס</li>
		<li>Imidazole להוסיף 1 מ' כל מדגם בריכוז הסופי של 10 מ מ. לאחר מכן, להוסיף כל מדגם הצינור המכיל את החרוזים agarose מוכן Ni-נ. ת.</li>
		<li>דגירה החרוזים, את lysates עבור 2 h ב 4 ° C עם סיבוב עדין. לסובב את החרוזים ב g x 3000 דקות 3-4 מעלות צלזיוס, הסר בזהירות את supernatants על ידי pipetting. כדי להימנע מאבדן חרוז, לא תשאף היבשה חרוזים.</li>
		<li>לרחוץ את החרוזים עם 1 מ"ל של שטיפת מאגר המכיל 20 מ מ imidazole (טבלה 1). כל זמן, לערבב הצינורות על ידי סיבוב ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות לאסוף את החרוזים על ידי ספינינג ב g x 3000 דקות 3-4 מעלות צלזיוס, ולמחוק את supernatants.</li>
		<li>לאחר השטיפה הסופית להוסיף 30 µL של • תנאי מאגר המכיל 250 מ מ imidazole (טבלה 1) כל דגימה, קפיצי לערבב. לאחר מכן, תקופת דגירה של 20 דקות ב 4 ° C כדי elute את החלבונים.</li>
		<li>מערבבים כל דגימה עם × מרחביות-דף 6 טעינת מאגר (טבלה 1). לאחר מכן, דגירה הצינורות ב 100 מעלות צלזיוס בתוך גוש חום במשך 10 דקות</li>
		<li>צנטריפוגה-12,000 x g עבור 1 דקות הצניפה החרוזים. בזהירות לאסוף את supernatants מבלי להפריע את החרוזים, ולהעביר את הדגימות 1.5 ml מיקרו-צנטריפוגה צינורות. הדגימות ניתן נותחו על ידי תספיג או המאוחסנים ב-20 ° C לשימוש מאוחר יותר.</li>
	</ol></li></ol> 3. כתם המערבי <ol><li>טען את immunoprecipitation או להוריד דוגמאות המתקבל השלבים הקודמים על גבי 4-20% ג'ל מרחביות-דף הדרגתיים. אלקטרופורזה-120 V במשך 90 דקות להפריד את החלבונים לנהל.</li>
	<li>להעביר את החלבונים בג'ל קרום difluoride (PVDF) polyvinylidene על ידי electroblotting 300 אמא במשך 90 דקות ב 4 ° C באמצעות שיטת ההעברה טנק. לחסום את הקרום PVDF במאגר בלוק המכיל 5% חלב דל שומן (טבלה 1) לשעה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>Incubate הקרום עם נוגדן ראשוני נוגדן דילול מאגר המכיל 3% אלבומין שור (BSA) (טבלה 1) לילה ב 4 º C. נוגדנים העיקרי, להשתמש ריכוז העבודה של 0.5 µg/mL (נוגדן anti-SUMO1), או לדילול 1:2000 (נוגדנים anti-Rb וטובולין נגד), או 1:5,000 (anti-GFP, נוגדן אנטי שלו).</li>
	<li>לרחוץ את הקרום 3 x 10 דקות בכל פעם באמצעות 1 x באגירה טריס תמיסת מלח עם מאגר Tween (TBST) (טבלה 1). דגירה הקרום עם 1:5,000 מדולל נוגדנים ספציפיים מצומדת חזרת Peroxidase HRP משני המינים במאגר בלוק המכיל 5% חלב דל שומן (טבלה 1). לשטוף את הקרום 3 x 10 דקות בכל פעם באמצעות מאגר x TBST 1-</li>
	<li>דגירה הקרום עם chemiluminescence משופרת (ECL) עובד פתרון. מכסה את הקרום בניילון נצמד, לחשוף אותם בפני לסרטי רנטגן תלוי בכח אות.</li>
</ol>

<ol><li>Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+cycle+transcription+during+G1+and+S+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of cell cycle transcription during G1 and S phases.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).</li>
<li>Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G1+cell-cycle+control+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">G1 cell-cycle control and cancer.</a> Nature. 432 (7015), 298-306 (2004).</li>
<li>Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinoblastoma+protein+and+cell+cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The retinoblastoma protein and cell cycle control.</a> Cell. 81 (3), 323-330 (1995).</li>
<li>Giacinti, C., Giordano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RB+and+cell+cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">RB and cell cycle progression.</a> Oncogene. 25 (38), 5220-5227 (2006).</li>
<li>Burkhart, D. L., Sage, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+of+tumour+suppression+by+the+retinoblastoma+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms of tumour suppression by the retinoblastoma gene.</a> Nat Rev Cancer. 8 (9), 671-682 (2008).</li>
<li>Ferreira, R., Naguibneva, I., Pritchard, L. L., Ait-Si-Ali, S., Harel-Bellan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rb%2Fchromatin+connection+and+epigenetic+control%3A+opinion%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The Rb/chromatin connection and epigenetic control: opinion.</a> Oncogene. 20 (24), 3128-3133 (2001).</li>
<li>Hilgendorf, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinoblastoma+protein+induces+apoptosis+directly+at+the+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The retinoblastoma protein induces apoptosis directly at the mitochondria.</a> Genes Dev. 27 (9), 1003-1015 (2013).</li>
<li>Munro, S., Carr, S. M., La Thangue, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+within+the+pRb+pathway%3A+is+there+a+code+of+conduct%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Diversity within the pRb pathway: is there a code of conduct.</a> Oncogene. 31 (40), 4343-4352 (2012).</li>
<li>Macdonald, J. I., Dick, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+modifications+of+the+retinoblastoma+tumor+suppressor+protein+as+determinants+of+function%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cancer%22%5BJournal%5D)">Posttranslational modifications of the retinoblastoma tumor suppressor protein as determinants of function.</a> Genes Cancer. 3 (11-12), 619-633 (2012).</li>
<li>Ezhevsky, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypo-phosphorylation+of+the+retinoblastoma+protein+%28pRb%29+by+cyclin+D%3ACdk4%2F6+complexes+results+in+active+pRb%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hypo-phosphorylation of the retinoblastoma protein (pRb) by cyclin D:Cdk4/6 complexes results in active pRb.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10699-10704 (1997).</li>
<li>Ledl, A., Schmidt, D., Muller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+oncoproteins+E1A+and+E7+and+cellular+LxCxE+proteins+repress+SUMO+modification+of+the+retinoblastoma+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Viral oncoproteins E1A and E7 and cellular LxCxE proteins repress SUMO modification of the retinoblastoma tumor suppressor.</a> Oncogene. 24 (23), 3810-3818 (2005).</li>
<li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+SUMO-2%2F3+induced+senescence+through+p53-+and+pRB-mediated+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Expression of SUMO-2/3 induced senescence through p53- and pRB-mediated pathways.</a> J Biol Chem. 281 (47), 36221-36227 (2006).</li>
<li>Meng, F., Qian, J., Yue, H., Li, X., Xue, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMOylation+of+Rb+enhances+its+binding+with+CDK2+and+phosphorylation+at+early+G1+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">SUMOylation of Rb enhances its binding with CDK2 and phosphorylation at early G1 phase.</a> Cell Cycle. 15 (13), 1724-1732 (2016).</li>
<li>Geiss-Friedlander, R., Melchior, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concepts+in+sumoylation%3A+a+decade+on%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Concepts in sumoylation: a decade on.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 947-956 (2007).</li>
<li>Flotho, A., Melchior, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sumoylation%3A+a+regulatory+protein+modification+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Sumoylation: a regulatory protein modification in health and disease.</a> Annu Rev Biochem. 82, 357-385 (2013).</li>
<li>Eifler, K., Vertegaal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMOylation-Mediated+Regulation+of+Cell+Cycle+Progression+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer.</a> Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).</li>
<li>Wilkinson, K. A., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms%2C+regulation+and+consequences+of+protein+SUMOylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Mechanisms, regulation and consequences of protein SUMOylation.</a> Biochem J. 428 (2), 133-145 (2010).</li>
<li>Gill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO+and+ubiquitin+in+the+nucleus%3A+different+functions%2C+similar+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms.</a> Genes Dev. 18 (17), 2046-2059 (2004).</li>
<li>Sharma, P., Kuehn, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SENP1-modulated+sumoylation+regulates+retinoblastoma+protein+%28RB%29+and+Lamin+A%2FC+interaction+and+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">SENP1-modulated sumoylation regulates retinoblastoma protein (RB) and Lamin A/C interaction and stabilization.</a> Oncogene. 35 (50), 6429-6438 (2016).</li>
<li>Jakobs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubc9+fusion-directed+SUMOylation+%28UFDS%29%3A+a+method+to+analyze+function+of+protein+SUMOylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Ubc9 fusion-directed SUMOylation (UFDS): a method to analyze function of protein SUMOylation.</a> Nat Methods. 4 (3), 245-250 (2007).</li>
<li>Gareau, J. R., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SUMO+pathway%3A+emerging+mechanisms+that+shape+specificity%2C+conjugation+and+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).</li>
<li>Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+E2-mediated+SUMO+conjugation+revealed+by+a+complex+between+ubiquitin-conjugating+enzyme+Ubc9+and+RanGAP1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1.</a> Cell. 108 (3), 345-356 (2002).</li>
<li>Saitoh, H., Hinchey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+small+ubiquitin-related+protein+modifiers+SUMO-1+versus+SUMO-2%2F3%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of small ubiquitin-related protein modifiers SUMO-1 versus SUMO-2/3.</a> J Biol Chem. 275 (9), 6252-6258 (2000).</li>
<li>Ayaydin, F., Dasso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+in+vivo+dynamics+of+vertebrate+SUMO+paralogues%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct in vivo dynamics of vertebrate SUMO paralogues.</a> Mol Biol Cell. 15 (12), 5208-5218 (2004).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

מאמר זה מתאר פרוטוקול לזהות ולנתח SUMOylation אנדוגני של Rb בתאים אנושיים. כפי בשיטה זו מתמקדת באופן ספציפי חלבון Rb אנדוגני ללא כל ההתחלפות של האות הגלובלית הקשורות סומו, זה כלי חשוב עבור חוקרים Rb-סומו שינוי בנסיבות הפיזיולוגיות טבעי לחלוטין.
כדי להשיג מטרה זו, חשוב לזכור כי: 1) למרות סומו כוללת ארבעה איזופורמים (SUMO1-4, אחד מקודד על ידי גנים שונים) בהשוואה ubiquitination, כל המינים סומו נפוצים הרבה פחות; 2) עבור רוב חלבונים היעד סומו, רק חלק קטן של חלבון נתון הוא SUMOylated על מצב יציב, אש...

שליטה מדויקת של מחזור התא. להתקדם בתוך התאים האיקריוטים מבוסס על רשת רגולציה הדוקה, אשר מבטיח כי האירועים מתקיימים בצורה מסודרת1,2. אחד השחקנים מפתח רשת זו הוא החלבון רטינובלסטומה (Rb), הראשון משובטים הגידול משתיק קול1,3. חלבון Rb נחשב מווסת שלילי של התקדמות מחזור התא, במיוחד עבור ה-G0/G1 מעבר פאזה S ולאחר גידול צמיחה4,5. כישלון של פונקציה Rb גם ישירות מוביל גידול ממאיר תוך-עיני הנפוצות ביותר אצל ילדים, רטינובלסטומה, או תורם להתפתחות של סוגים רבים אחרים של סרטן5. יתר על כן, Rb מעורב משעולים הסלולר רבים כולל תאית התמיינות, כרומטין שיפוץ של אפופטוזיס המיטוכונדריה בתיווך3,6,7.
שינויים post-translational לשחק תפקיד מרכזי בוויסות RB פונקציה8,9. זרחון הוא אחד שינוי כזה, זה בדרך כלל מוביל Rb איון. בתאים G0 השבתה הדרגתית, Rb פעילה עם רמה נמוכה זירחון. כמו תאים התקדמות דרך שלב G0/G1, Rb הוא ברצף היפר-phosphorylated על ידי סדרה של חלבון cyclin תלוית kinases (CDKs), cyclins, כגון cyclin E/CDK2, cyclin D/CDK4/6, אשר בטל Rb ולחסל את יכולתו לדכא את מחזור התא הקשורים גנים ביטוי4,10. Rb יכול גם להיות שונה על-ידי צירוף הקשורות אוביקוויטין קטן (סומו)11,12,13.
סומו הוא חלבון כמו אוביקוויטין שאליו מחובר covalently מגוון רחב של חלבונים היעד. . זה קריטי עבור תהליכים תאיים מגוונים, כולל תקנה מחזור התא, שעתוק, לוקליזציה הסלולר חלבון, השפלה, תחבורה ו DNA תיקון14,15,16, 17 , 18. סומו ההטיה מסלול מורכב dimeric סומו E1 הפעלת האנזים SAE1/UBA2, יחיד E2 conjugating האנזים Ubc9, ligases E3 מרובים, פרוטאזות סומו ספציפיים. באופן כללי, חלבונים סומו nascent יש לעבד proteolytically כדי ליצור את הטופס בוגרת. בגלל הסומו בוגרת מופעל על ידי heterodimer E1, הועבר לאחר מכן האנזים E2 Ubc9. בסופו של דבר, גליצין C-מסוף של סומו הוא covalently מצומדת על פי ליזין היעד של מצע, תהליך זה בדרך כלל בהנחייתם של E3 ligases. החלבון סומו ניתן להסיר את המצע ששונה על-ידי פרוטאזות ספציפיים. מחקר קודם על ידי מחברי המאמר חשף כי SUMOylation של Rb מגביר שלה מחייב CDK2, שמוביל hyper-זרחון בשלב G1 מוקדם, תהליך אשר יש צורך מחזור התא התקדמות13. גם להדגים כי האובדן של Rb SUMOylation גורמת שגשוג תאים ירד. יתר על כן, לאחרונה הוכח כי SUMOylation של Rb מגן על חלבון Rb תחלופת proteasomal, ובכך מגדילים את רמת חלבון Rb תאים19. לכן, SUMOylation ממלא תפקיד חשוב בתפקוד Rb בתהליכים הסלולר השונות. כדי להמשיך לחקור תוצאה פונקציונלית והרלוונטיות פיזיולוגיים של Rb SUMOylation, חשוב לפתח שיטה יעילה כדי לנתח את מצב סומו Rb תאים אנושיים או רקמות החולה.
SUMOylation הוא תהליך הפיך, דינמי מאוד. לכן בדרך כלל קשה לזהות את החלבונים סומו-השתנה בתנאים לחלוטין אנדוגני. מאמר זה מציג שיטה לגילוי SUMOylation Rb אנדוגני. יתר על כן, זה מראה איך מזהים SUMOylation Rb אקסוגני של פראי-סוג Rb והן המוטציה שלה לקויה סומו11. בפרט, ג'ייקובס. ואח תיאר שיטה להגדיל את השינוי סומו של מצע נתון במיוחד על ידי SUMOylation (UFDS) מכוון היתוך של Ubc920. מבוסס על שיטה זו, פרוטוקול זה מתאר כיצד לנתח SUMOylation כפויה של Rb והשלכותיה פונקציונלי. בהתחשב בכך מאות סומו סובסטרטים שתוארו קודם לכן, נוסף בשם דיאלקטריים סומו זוהו של מבחני רבים מבוססי פרוטיאומיה מבנית, פרוטוקול זה ניתן להחיל לנתח הסומו-השינוי של אלה חלבונים בתאים אנושיים.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>מלח חוצץ פוספט (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>תימידין</td><td>סיגמא</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>נוקודאזול</td><td>סיגמא</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>פרופידיום יודיד</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100&nbsp;</td><td>אמרסקו</td><td>694</td><td></td></tr><tr><td>RNase A&nbsp;</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>N-אתילמלימיד</td><td>סיגמא</td><td>E3876&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט (SDS)</td> <td>תחליף AMRESCO</td><td>M107</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40 (NP-40)</td> <td>מעכב פרוטאז AMRESCO</td><td>M158</td><td></td></tr><tr><td>אימונוגלובולין עכבר</td> Roche 5892970001 <td></td><td></td> G (IgG) סנטה קרוז ביוטכנולוגיה sc-2025 <td></td></tr><tr><td>Rb נוגדנים</td> טכנולוגיית <td>איתות תאים</td> <td>#9309</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>חלבון A/G-חרוזי ספרוז</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>SC-2003</td><td></td></tr><tr><td>ליפופקטמין-2000&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>חומצה ניטרילוטריאצטית ניקל (Ni-NTA) חרוזי אגרוז</td><td>Qiagen</td><td>30230</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma</td><td>I0250</td><td></td></tr><tr><td>4%-20% שיפוע SDS-PAGE ג'ל</td><td>BIO-RAD</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>פוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF) ממברנה</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>AMRESCO</td><td>נוגדן M147</td><td></td></tr><tr><td>טובולין</td><td>Abmart</td><td>M30109</td><td></td></tr><tr><td>SUMO1 נוגדן</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>33-2044</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן GFP</td><td>Abmart</td><td>M20004</td><td></td></tr><tr><td>חזרת פרוקסידאז (HRP) נוגדן משני</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>715-035-150</td><td></td></tr><tr><td>ערכת כימילומינסנציה משופרת (ECL)</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>32106</td><td></td></tr></tbody></table>

אין ויוו זיהוי וניתוח של sumoylation חלבון rb בתאי אדם

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

השינויים post-translational של חלבונים חיוניים לוויסות תקין של אותות תאיים. בין השינויים האלה, צירוף הקשורות אוביקוויטין קטן (סומו) הוא חלבון כמו אוביקוויטין שאליו מחובר covalently שאריות ליזין מגוון רחב של חלבונים היעד כדי לווסת תהליכים תאיים, שעתוק גנים, תיקון ה-DNA, חלבונים האינטראקציה השפלה, תחבורה subcellular ו מעבר אותות. הגישה הנפוצה ביותר כדי זיהוי חלבונים SUMOylation מבוסס על הביטוי ולטיהור מתויג חומרים של חיידקים, המאפשרות במבחנה הביוכימי לתגובה וזה פשוט מתאימים למיעון מכניסטית שאלות. עם זאת, בשל המורכבות של התהליך של SUMOylation ויוו, זה יותר מאתגר כדי לזהות ולנתח חלבון SUMOylation בתאים, במיוחד כאשר תחת תנאים אנדוגני. מחקר שנערך לאחרונה על ידי מחברי המאמר חשף רטינובלסטומה אנדוגני (רובידיום) חלבון, מדכאי מהווה מרכיב ברגולציה השלילית של ההתקדמות מחזור התא, הוא במיוחד SUMOylated בשלב G1 מוקדם. מאמר זה מתאר פרוטוקול זיהוי, ניתוח של Rb SUMOylation בתנאים אנדוגני והן אקסוגני בתאים אנושיים. פרוטוקול זה מתאים החקירה פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר ופונקציונליים של הסומו-השינוי של Rb, כמו גם רבים אחרים, ממוקדות סומו חלבונים, בתאים אנושיים.

לזיהוי SUMOylation Rb אנדוגני במהלך מחזור התא התקדמות, מחקר זה קודם מסונכרנים תאים HEK293-חמישה שלבים שונים של מחזור התא (G0, מוקדם G1, G1, S ו- G2/M) כמתואר בסעיף פרוטוקול של מאמר זה. האיכות של סינכרון אושר באמצעות חומצות גרעין הכתם עם יודיד propidium שלאחריה יבוא ניתוח cytometry זרימה (איור 1). בשלב הבא, התאים שנאספו, lysed על ידי denaturing ריפה מאגר. מעכבי פרוטאזות סומו, N-Ethylmaleimide, נוספה ריכוז סופי של 20 מ מ כדי לשמר את האות סומו יליד במהלך הניסויי...

חלבונים משפחתי קטן הקשורות אוביקוויטין צירוף (סומו) הם מצומדת ל ליזין שאריות לחלבונים היעד כדי לווסת תהליכים תאיים שונים. מאמר זה מתאר פרוטוקול איתור רטינובלסטומה (Rb) חלבון SUMOylation בתנאים אנדוגני, אקסוגני בתאים אנושיים.

אין ויוו זיהוי וניתוח של SUMOylation חלבון Rb בתאי אדם

The post-translational modifications of proteins are critical for the proper regulation of intracellular signal transduction. Among these modifications, ...

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לזהות SUMOylation של חלבוני retinoblastoma תחת תנאים אנדוגניים ואקסוגניים בתאים אנושיים. חלבונים ממשפחת ה-Small ubiquitin-related modifier, או SUMO, מצומדים לשארי lysine של חלבוני מטרה כדי לווסת תהליכים תאיים שונים. בדרך כלל, קשה יותר להתחיל תהליך של SUMOylation של חלבון בתאים בשל המורכבות של SUMOylation in vivo.ניסוי זה מזהה SUMOylation של חלבוני Rb אנדוגניים ואקסוגניים כאחד. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי SUMOylation של חלבוני Rb, היא מתאימה גם לזיהוי של חלבוני מטרה רבים אחרים של SUMO בתאים. ראשית, הוסיפו 25 milliliters של DMEM המכיל one percent penicillin streptomycin, והדגירו את תאי HEK293 בטמפרטורה של 37 °C למשך 72 שעות.שטפו את התאים מהצלחת באמצעות 3 mL של PBS קר בקרח. לאחר מכן, העבירו את התאים למבחנה חדשה בנפח של 5 mL. כדי לקבל תאים בשלב G1 בסיום תהליך הסנכרון לשלב G0, הסירו את ה-DMEM והוסיפו מצע גידול טרי, ובכך אפשרו לתאי HEK293 להיכנס מחדש למחזור התא.לאחר מכן, אספו את התאים בשלבים שונים של פאזה G1 לצורך אנליזה של מחזור התא ובדיקת SUMO נוספת. כדי לסנכרן את תאי ה-HEK293 בפאזה S, השתמשו בשיטת חסימה כפולה של תימידין (double thymidine block). ראשית, גדלו את תאי ה-HEK293 עד לרמת התמזגות (confluency) של 50%, ולאחר מכן שטפו את התאים ב-PBS שחומם מראש.הוסיפו מצע גידול המועשר ב-2.5 millimolar thymidine למשך 18 שעות כחסימה ראשונה. הסירו את המצע המכיל thymidine ושטפו את התאים פעמיים ב-PBS שחומם מראש. הוסיפו מצע גידול טרי למשך 14 שעות כדי לשחרר את התאים מהחסימה.לאחר שחרור התאים מהחסימה הראשונה, השליכו את המצע באמצעות פיפטה. לאחר מכן, הוסיפו מצע גידול המועשר ב-2.5 millimolar thymidine למשך 18 שעות נוספות כחסימה שנייה, לפני ביצוע ניתוח של מחזור התא ושל Rb SUMOylation. עבור סנכרון לשלב G2 או M, זרעו כ-15 מיליון תאי HEK293 בצלחת של 15 סנטימטר עם 25 milliliters של מצע גידול, וגדלו למשך 24 שעות.לאחר מכן, הוסיפו nicotisol למצע עד להשגת ריכוז סופי של 400 nanograms per milliliter. לבסוף, דגרו את התאים למשך 16 שעות לפני ביצוע ניתוח של מחזור התא באמצעות ציטומטריה של זרימה (flow cytometry) כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. ליזו את תאי ה-HEK293 הסנכרוניים על ידי תליה מחדש עדינה במיליליטר אחד של radioimmunoprecipitation assay, או RIPA, lysis buffer קר מאוד (בטמפרטורת קרח), המכיל מעכב isopeptidase שהוסף טרי כדי לחסום SUMO proteases ולייצב SUMO conjugates.יש להומוגניזציה נוספת של התאים על קרח על ידי העברתם 10 פעמים דרך מחט בכיול 21 המחוברת למזרק של 2 milliliters. לאחר מכן, יש להדגיר את התאים על קרח למשך חמש דקות. בשלב הבא, יש לסבב את ליזאטי התאים בקיבס ב-18000 ×g למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 °C.לאחר הסנטריפוגציה, העבירו את העל-נוזלים (supernatants) למבחנות מיקרו-סנטריפוגה חדשות בנפח 1.5 milliliter. הוסיפו לעל-נוזלים מיקרוגרם אחד של immunoglobulin G של עכבר שאינו ספציפי, מאותו מין ומאותו איזוטייפ של הנוגדן המונוקלונלי Rb. כמו כן, הוסיפו 20 microliters של protein AG sephyroslurry בריכוז 50 percent, ולאחר מכן הדגרירו את התערובת למשך שעה אחת בטמפרטורה של ארבע degrees celsius תוך כדי סיבוב עדין.סבב את הדגימות בצנטריפוגה ב-3,000 ×g למשך שלוש דקות בטמפרטורה של 4 °C. אסוף בזהירות את העלונות (supernatants) מבלי להפריע לחרוזים והעבר אותן למבחנות מיקרו-צנטריפוגה חדשות בנפח של 1.5 mL. לכל אחת מהדגימות, הוסף 5 µL של נוגדן ראשוני rb ו-40 µL של תרחיף (slurry) של Protein AG Sepharose בריכוז של 50%, ולאחר מכן הדגר את הדגימות למשך לילה ב-4 °C בסיבוב עדין.לאחר הצנטריפוגציה, שטפו את החרוצים עם מיליליטר אחד של rifa buffer. ערבבו היטב את המבחנות באמצעות סיבוב בטמפרטורה של 4 °C למשך 15 דקות. לאחר מכן אספו את החרוצים על ידי צנטריפוגציה במהירות נמוכה כפי שבוצע קודם לכן והסילו את העלויות.לאחר ביצוע השטיפה ארבע פעמים, השביה מחדש את החרוצים ב-30 µL של תמיסת טעינה ל-SDS-PAGE בריכוז 1x וערבב היטב. דגרי את המבחנות ב-100 °C בבלוק חימום למשך 10 דקות. סבב את הדגימות בצנטריפוגה במהירות של 12,000 ×g למשך דקה אחת כדי לשקיע את החרוצים.לבסוף, אספו בזהירות את העל-נתיכים (supernatants) מבלי להפריע לחרוזים והעבירו אותם למבחנות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 ml. בצעו טרנספקציה של תרבית תאים וליזיס של תאי HEK293 כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, רחצו 25 µl של חרוזי nickel nitrilotriacetic acid agarose בריכוז 50% עם RIPA buffer במבחנת מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 ml עבור כל דגימה.אסוף את החרו지를 באמצעות סרז'יפוגציה ב-3,000 ×g למשך שלוש דקות בטמפרטורה של 4 °C. הוסף emytozol בריכוז 1 M לכל דגימה כדי להגיע לריכוז סופי של 10 mM. לאחר מכן, העבר כל דגימה לשפופרת המכילה את חרוזי ה-agoros שהוכנו.דגרו את החרוזים ואת הליזאטים למשך שעתיים בטמפרטורה של 4°C עם סיבוב עדין. לאחר מכן, סובבו את החרוזים ב-3,000 ×g למשך שלוש דקות בטמפרטורה של 4°C. לאחר הצנטריפוגציה, הסירו בזהירות את העלייה (supernatants) באמצעות פיפטה.כדי למנוע אובדן של חרו지를, אין לשאוב את החרוזים עד ליובש. לאחר מכן, יש לשטוף את החרוזים ב-1 mL של תמיסת שטיפה המכילה 20 mM emytozol. ערבבו היטב את המבחנות באמצעות סיבוב ב-4 °C למשך 15 דקות לפני איסוף החרוזים באמצעות סבוב (spinning).לאחר השטיפה האחרונה, הוסיפו 30 µL של בופר Eleusian המכיל 250 mM emitozol לכל דגימה ונערה בקישקוש (flick) לערבוב. לאחר מכן, דגרו את הדגימות למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 °C כדי לאלואציה של החלבונים. ערבבו כל דגימה עם בופר טעינה של SDS page בריכוז 6x.לאחר מכן, דגרו את המבחנות ב-100 °C בבלוק חימום למשך 10 דקות. בעקבות סבוב בצנטריפוגה, טענו את דגימות ה-immunoprecipitation או ה-pull-down לג'לי SDS-PAGE במעבר (gradient) של 4% עד 20%. בצעו אלקטרופורזה ב-120 V למשך 90 דקות כדי להפריד את החלבונים.לאחר סנכרון מחזור התא ושיקוע חיסוני (immunoprecipitation) של מיני rb אנדוגניים, נוכחותו של אות ה-SUMO זוהתה באופן ספציפי באמצעות נוגדן anti SUMO one בשלב G1 המוקדם. תוצאות מייצגות מראות SUMOylation מאולץ של חלבון rb על ידי היתוך ישיר של אנזים SUMO E2 מסוג UBC9 לקצה ה-C שלו. שימו לב לחלבון rb ה-SUMOylated בעל מהירות הנדידה האיטית ביותר.באמצעות שימוש במוטציה של rb שחסרה יכולת SUMOylation, K720R, מאושרת באופן נוסף נוכחותו של rb SUMOylation בתאים. לפיכך, בהליך זה ניתן לנתח חלבונים רבים אחרים המהווים מטרות ל-SUMO בתרביות תאים. ברוב המקרים, רק חלק קטן מאוד מהסובסטרט עובר SUMOylation, לכן בעת ביצוע הליך זה חשוב למקסם את יעילות האימונו-פרסיפיטציה.

in-vivo-detection-analysis-rb-protein-sumoylation-human

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מדגים את שיטת in vitro עבור SUMOylation של חלבוני סובסטרט באמצעות מפל אנזימים רציף. יתר על כן, מצב SUMOylated של החלבון מזוהה באמצעות אלקטרופורזה וטכניקת immunoblotting.

בדיקת SUMOylation: טכניקה במבחנה לזיהוי מצב SUMOylation של חלבוני סובסטרט על ידי immunoblotting

משואות bimolecular ratiometric (RBMBs) יכולות לשמש לתעתיקים בודדים תמונה מהונדסת RNA בתאים חיים. כאן, אנו מתארים את ההכנה וטיהור של RBMBs, מסירה של RBMBs לתוך תאים על ידי microporation ודימות פלואורסצנטי של מולקולות RNA אחת בזמן אמת.

הדמיה בזמן אמת של יחיד תכנון הנדסי RNA תמלילים בתאים חיים באמצעות משואות bimolecular רציומטרי

כתב יד זה מתאר את הגילוי של sumoylation וubiquitination של חלבוני קינטוכור, Ndc10 וNdc80, בcerevisiae Saccharomyces שמרי ניצנים.

טכניקת טיהור חלבון המאפשרת איתור של Sumoylation וUbiquitination של שמרים להנץ החלבונים קינטוכור Ndc10 וNdc80

אינטראקציות חלבון-חלבון יכולות להתרחש הן בגרעין והן בציטופלזמה של התא. כדי לחקור אינטראקציות אלה, מיושמים קו-אימונו-משקעים מסורתיים ובדיקת קשירת קרבה מודרנית. במחקר זה, אנו משווים את שתי השיטות הללו כדי לדמיין את התפלגות האינטראקציות של NF90-RBM3 בגרעין ובציטופלזמה.

ויזואליזציה של אינטראקציה בין חלבונים ב גרעיני cytoplasmic שברים על ידי Co-immunoprecipitation ו<em&gt; באתרו</em&gt; Assay קשירת הסמיכות

אנו מתארים פרוטוקול כדי לזהות רנ א מחייב חלבונים ולמפות אזורים מחייב RNA שלהם ב תאים חיים באמצעות photocrosslinking בתיווך UV וספקטרומטר מסה.

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

בניגוד ligases אוביקוויטין, זוהו מספר ligases סומו E3. ששונה זה במבחנה SUMOylation פרוטוקול הוא מסוגל לזהות ligases סומו E3 הרומן מאת assay שיחזור במבחנה .

במבחנה SUMOylation Assay ללמוד סומו E3 ליגאז פעילות

כאן אנו מציגים פרוטוקול לפתח מערכת inducible דומיננטה-שלילי, שבו כל חלבון יכול להיות מותנה מומת על ידי הפיכה overexpressing גרסה מוטציה דומיננטית-שלילי של זה.

עיכוב חלבונים inducible והפיך דומיננטי שלילי (DN)

סומו הוא הכרחי ושמרו במידה רבה, חלבון שימור קטן כמו הצירוף. בפרוטוקול זה אנו מתארים את השימוש רקומביננטי העמידות בפני סומו חלבון השמנה להשמנה (kmUTAG) כדי להמחיש מקורי, שערי סומו לא מתויגים ולוקליזציה שלהם במגוון סוגי תאים.

לוקליזציה של חלבונים ששונו באמצעות סומו פלורסנט-השמנה חלבונים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להעשיר, לבודד, לזהות, ולאפיין חלבונים ששונו על-ידי סומו ב vivo הן של תאי hepatoma אנושיים וגידולים בכבד שהתקבלו מדגמי העכבר של קרצינומה hepatocתאיים באמצעות ישויות כריכת סומו (SUBEs).

מחייב סומו ישויות (SUBEs) ככלים עבור העשרה, בידוד, זיהוי, ואפיון של פרוטאום סומו בסרטן הכבד

פרוטוקול זה מטרתו להקים אוביקוויב (וכדומה) ו אוביקוויב-אוהב (Ubls) הפרוטאמים ספציפיים כדי לזהות שינויים של סוג זה של שינויים לאחר העברה (לאחר ההעברה), הקשורים במצב ספציפי כגון טיפול או פנוטיפים.

יצירת פרופיל אוביקוויפין ואוביקוויב-שינויים עצמאיים וזיהוי של שינויים משמעותיים

פרוטוקולים אלה מספקים את המתודולוגיה המשמשת להערכת הפעילות האנזימטית של חברים בודדים במשפחת החלבון ארגינין מתילטרנספראז (PRMT) בתאים. הנחיות מפורטות על הערכת פעילות PRMT באמצעות סמנים ביולוגיים אנדוגני אקסוגני, מתיל ארגינין זיהוי נוגדנים, ותרכובות כלי מעכב מתוארים.

שיטות כמותיות לחקר חלבון ארגינין מתילטרנספראז 1-9 פעילות בתאים

למד לזהות ולנתח SUMOylation של חלבון Rb בתאי אדם בשיטת in vivo. הפרוטוקול משתמש בתאי HEK293 ומספק בסיס לחקר חלבוני SUMO נוספים בתאים תרבתיים.

אין ויוו זיהוי וניתוח של SUMOylation חלבון Rb בתאי אדם

גלה סרטונים נוספים