Name: הקפאה קריוגנית של דג זברה Spermatogonia על ידי מחט האשכים כולו שקוע צינון אולטרה מהיר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: למד פרוטוקול הקפאה קריוגנית של אשכי דג זברה בשלמותם באמצעות שיטת מחט שקועה בצינון אולטרה מהיר. השיטה מאפשרת אחסון ארוך טווח של תאי זרע לשימוש עתידי בהשתלות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי הלאומית למחקר, פיתוח חדשנות Office הונגריה (גרנט 116912 כדי ÁH), המשרד עלות (מזון, חקלאות עלות פעולה FA1205: AQUAGAMETE), התכנית מלגת Hungaricum Stipendium (מענק ZM) והמעבד החדש ההונגרית הלאומית Predoctoral הצטיינות (מענק EK).

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי לחוק לרווחת בעלי חיים הונגרי.
1. מגיב הכנה
<ol><li>פתרונות מניות<ol>
<li>להכין טרהלוז 1 מ' על-ידי הוספת 0.378 גר' טרהלוז וגופרית והרכבו לתוך 1 מ"ל של dH2O. לערבב היטב עד הוא מתמוסס לחלוטין.</li>
		<li>להכין סוכרוז 1 מ' על-ידי הוספת 0.342 גר' סוכרוז לתוך 1 מ"ל של dH2O. לערבב היטב עד הוא מתמוסס לחלוטין.</li>
		<li>להכין 1 מ' HEPES על-ידי הוספת 0.238 גר' HEPES 1 מ"ל של dH2O. לערבב היטב עד הוא מתמוסס לחלוטין.</li>
		<li>להכין collagenase 20 מ"ג/מ"ל (U 290/mg) על-ידי הוספת 100 מ ג מ ל- PBS. מערבבים היטב עד הוא מתמוסס. מסנן סטרילי דרך 0.2 µm מסננים. Aliquot 50 µL לתוך 0.2 מ ל PCR צינורות ומקפיאים ב- 20 º C.</li>
		<li>להכין טריפסין 15 מ"ג/מ"ל (~ 10000 U/mg) על-ידי הוספת 75 מ"ג עד 5 מ"ל ל- PBS. מערבבים היטב עד הוא מתמוסס. מסנן סטרילי דרך 0.2 µm מסננים. Aliquot 50 µL לתוך 0.2 מ ל PCR צינורות ומקפיאים ב- 20 º C.</li>
		<li>להכין 1 מ"ג/מ"ל DNase אני (~ 3000 U/mg) על-ידי הוספת 5 מ"ג עד 5 מ"ל ל- PBS. מערבבים היטב עד הוא מתמוסס. מסנן סטרילי דרך 0.2 µm מסננים. Aliquot 50 µL לתוך 0.2 מ ל PCR צינורות ומקפיאים ב- 20 º C.</li>
		<li>להכין 0.4% trypan blue על-ידי הוספת 40 מ"ג trypan blue 10 מ"ל ל- PBS. מסנן סטרילי דרך 0.2 µm מסננים. 1 מ"ל aliquot לתוך צינורות 1.5 mL.</li>
		<li>להכין 200 mg/L MS-222 (Tricaine מתאן סולפונאט) על-ידי הוספת 200 מ ג של MS-222 לתוך 1 ליטר של dH2O. לערבב היטב עד הוא מתמוסס לחלוטין. בנוסף, MS-222 בופר עם סודיום ביקרבונט כדי pH נייטרלי של 7.0.</li>
	</ol>
</li>
	<li>פתרונות עבור ויטריפיקציה<ol>
<li>להכין פתרון Equilibration (ES): להכין 2 מ"ל של ES על ידי ערבוב 121.5 µL של מתנול (MeOH; 1.5 M), 220 µL של פרופילן גליקול (פ"ג; 1.5 M), 200 µL של FBS (10%), 200 µL של טרהלוז מניות פתרון (0.1 M), 50 µL של HEPES מניות פתרון (25 מ מ) ו- µL 1208.5 של L-15 לתוך 2 mL שפופרת.</li>
		<li>להכין ויטריפיקציה פתרון (לעומת): להכין 2 מ ל VS על ידי ערבוב µL 439 של PG (3 מ'), µL 426 של דימתיל סולפוקסיד (לי2; 3 מ'), 200 µL של FBS (10%), 200 µL של פתרון מניות טרהלוז (0.1 M), 50 µL של HEPES במניה פתרון (25 מ מ) ו- 685 µL של L-15 לתוך צינור 2 מ"ל.</li>
	</ol>
</li>
	<li>פתרונות חימום<ol>
<li>להכין פתרון חימום 1 (WS1): להכין 1.5 מ של WS1 בשפופרת 2 mL על ידי ערבוב µL 150 של FBS (10%), 450 µL של פתרון מניות סוכרוז (3 מ'), 900 µL של L-15.</li>
		<li>להכין פתרון חימום 2 (WS2): להכין 1.5 מ של WS2 בשפופרת 2 mL על ידי ערבוב µL 150 של FBS (10%), 150 µL של סוכרוז מניות פתרון (1 מ') ו- 1200 µL של L-15.</li>
		<li>להכין פתרון התחממות כדור הארץ 3 (WS3): להכין 1.5 מ של WS2 בשפופרת 2 mL על ידי ערבוב 150 µL FBS (10%) ו- 1350 µL של L-15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין פתרון עיכול: עבור כל דגימה להכין µL 500 של הפתרון לעיכול על ידי ערבוב 50 µL של collagenase מניות פתרון (2 מ"ג/מ"ל), 50 µL של פתרון מניות טריפסין (1.5 mg/mL), µL 10 של DNase (20 µg/mL) ואני µL 390 של L-15 ב mL 2 צינור.</li>
	<li>להשיג כלי חיתוך: מספריים, microscissors, פינצטה, פינצטה מעוקל, דיקור מחטים.</li>
</ol>2. האשכים אוסף
<ol><li>המתת חסד הדג על-ידי הצבתו לתוך תבשיל המכיל 200 mg/L MS-222 (ה-pH = 7). לפני שתמשיך עם הקרע, ודא כי הגג יש הפסיק לזוז, זה לפחות 10 דקות חלפו מאז הרגע כדי להבטיח מוות על-ידי היפוקסיה.</li>
	<li>יבש את הדג על ידי לכם בערגה על מגבת נייר ומניחים אותו על צדו הגבי על מזרון ויבתר.<ol>
<li>קודם כל לחתוך את הסנפירים האגן, החזה עבור ניתוח קל יותר.</li>
		<li>אופקית לגזור את העור על בטנו של הדג בין במינימום וחותכים את העור והשרירים הבסיסית לאורך הבטן עד הפרק אנאלי.</li>
		<li>פתח לתוך חלל הגוף של הדג, להצמיד לקיר הגוף ימינה ושמאלה על המזרן הקרע עם מחטים. הערה: האשכים נמצאים מעל אברי מערכת העיכול משני הצדדים של שחייה שלפוחית השתן (איור 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>כדי למנוע זיהום, לא להוציא את האיברים במערכת העיכול, אבל בעדינות לדחוף אותם לצד אחד ולהסיר בזרמה מן הצד היריב. האשכים מחוברים לקיר הגוף אז להסיר אותם בקפידה, קיצוץ של הצפק חיבור microscissors.</li>
	<li>בנוסף, על מנת למנוע זיהום, ראשית לעקר את האשכים על ידי לשים אותם 70% אתנול עבור s 2, ולאחר מכן מקם אותם בתוך L-15 על צלחת 96-ובכן על קרח. הערה: אם זה הכרחי, נקי האשכים של רקמות שומן וגדולים דם כלי בדיוק מתחת stereomicroscope</li>
</ol>3. אולטרה צינון מהיר של רקמת האשכים
<ol><li>מארק מחטים עם תוויות המתאים בהתאם הדגימה הקלד ולהכין את equilibration (ES) והפתרונות ויטריפיקציה (לעומת).</li>
	<li>העבר את האשכים צלחת גדולה יותר טוב או תבשיל, הסיכה שלושה האשכים (או יותר בהתאם לגודל של המחט) על מחט אקופונקטורה סטרילי.<ol>
<li>ראשית הצב בזרמה על פינצטה מעוקל. מקם את נקודת של המחט באמצע בזרמה, משוך בזהירות בזרמה כלפי מעלה עם הפינצטה.</li>
		<li>לאחר ניקב בזרמה, משוך אותו בעדינות כלפי מעלה לכיוון החלק העליון של המחט. ודא האשכים מופרדים אחד מהשני, כי הם לא ליפול או מחליק במורד.</li>
		<li>המקום מלא המחטים עם האשכים מוצמדים צינור 2 מ"ל עם L-15 עד ויטריפיקציה (ב 25 הלעפה תרוטרפמט; אחסון זמן לא יעלה על 1 h). הערה: הצמדה האשכים המחט צריך להיעשות במהירות כדי למנוע את האשכים ממנו להתייבש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להעביר את המחט עם האשכים אל הפתרון equilibration, תקופת דגירה של 5 דקות ב- 25˚C.</li>
	<li>להעביר את המחט לתוך הפתרון ויטריפיקציה ואת תקופת דגירה של 30 s ב 25˚C.</li>
	<li>הסר את המחט מהפתרון ויטריפיקציה, במהירות ובעדינות סופגים את הפתרון הנותרים של הרקמה על ידי מגבת נייר סטרילי. . בזהירות כדי למנוע את האשכים נדבקות מגבת הנייר או ליפול.</li>
	<li>במהירות למקם את המחט לתוך חנקן נוזלי ממוקמים בתוך קופסת קלקר. הערה: לבצע שלב זה במהירות כדי למנוע חשיפה של רקמות לאדים חנקן נוזלי. השתמש כמויות נמוכות של חנקן נוזלי למניעת זיהום צולב של דגימות.</li>
	<li>שמור את המחט חנקן נוזלי בתוך קופסת קלקר סגורה למשך 5-10 דקות.</li>
	<li>Precool של cryotube מ ל 4.5 שנפתחו והכובע שלו באותה תיבת.</li>
	<li>לאחר 5-10 דקות, להעביר כל המחט לתוך cryotube נפרדים מתחת לפני השטח של חנקן נוזלי וסגור את cryotube. התראה: השתמש תמיד ביגוד מגן (כגון כפפות מבודדות) כאשר עובד עם חנקן נוזלי, כמו חשיפה יכולה להוביל כווית קור חמורה.</li>
	<li>מניחים את cryotube על מקל מתכת ומניחים אותו בתוך המיכל cryobank מהר ככל האפשר. לאחסן את הדגימות לאחסון מיכל דיואר עד שימוש נוסף.</li>
</ol>4. תהליך התחממות כדור הארץ
<ol><li>חמים כל המחט בנפרד. כל הפתרונות התחממות כדור הארץ צריך להיות ב 25 º C.</li>
	<li>לנתק את cryotube של המקל מתכת, טיבלו זה חנקן נוזלי המאוחסנים בתוך קופסת קלקר.</li>
	<li>לפתוח את cryotube האדים חנקן נוזלי (באמצעות מלקחיים) ולשחרר את המחט לתוך החנקן הנוזלי.</li>
	<li>להעביר את המחט מהר מאוד לתוך הפתרון התחממות כדור הארץ הראשונה, תקופת דגירה של 1 דקה (25 ° C). הקפד להעביר את המחט במהירות כדי למנוע את ההתחממות באוויר במהלך העברת.</li>
	<li>להעביר את המחט לתוך הפתרון ההתחממות השניה, תקופת דגירה של 3 דקה (25 ° C).</li>
	<li>להעביר את המחט לתוך הפתרון התחממות כדור הארץ השלישי, תקופת דגירה של 5 דקות (ב- 25 ° C).</li>
	<li>שחרר את האשכים מן המחט על-ידי הזזה אותם כלפי מטה עם פינצטה מעוקל. המקום לכל testis ומחוממת בנפרד לבאר נפרד (96-ובכן צלחת) מלא עם 250 µL של L-15 בתוספת 10% FBS. ודא כי הבארות מסומנות על פי המדגם. לקחת את הצלחת היטב על הקרח עד כל דוגמאות מחוממות, ועד עבודה נוספת.</li>
</ol>5. רקמות עיכול
<ol><li>היכונו µL 500 של הפתרון דיסוציאציה כל דגימה נפרדת mL 2 צינורות. תווית הצינורות על פי הקוד של המדגם. דגירה הפתרון דיסוציאציה מוכן עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>בוזקים את הרקמה ומחוממת הפתרון עיכול, לחתוך אותו לחתיכות קטנות על ידי לפחות 30 תנועות מספריים קטנים.</li>
	<li>דגירה הרקמה שנגזרו על צלחת חזק במשך 90 דקות ב 25 הלעפה תרוטרפמט.</li>
	<li>להפסיק את תהליך העיכול על-ידי הוספת 400 µL של µL L-15 ו- 100 של FBS (10% FBS וי/v). בקצרה לנער את הפתרון, תקופת דגירה של 1 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לסנן את הפתרון שהושג דרך 50 מיקרומטר מסננים לתוך צינור 1.5 מ. תווית הצינורות בהתאם.</li>
	<li>Centrifuge הפתרון המסוננות ב 200 g × 10 דקות ב 25 הלעפה תרוטרפמט.</li>
	<li>בזהירות להסיר את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 20 µL של L15 בתוספת 10% FBS. יש לנער את הצינור באופן ידני עד התפרקה לחלוטין בגדר. לשמור התליה תא על קרח או הלעפה תרוטרפמט 4 עד להמשך השימוש.</li>
</ol>6. הכדאיות הערכה וספירת תא
<ol><li>µL מיקס 5 של הבולם תא, µL 5 של 0.4% פתרון trypan blue בצינור PCR mL 0.2 שכותרתו כראוי. אם אמצעי אחסון שונים משמשים, ודא כי היחס דילול שרידי 1:1.</li>
	<li>דגירה ההשעייה 1 עד 3 דקות בטמפרטורת החדר (25 ° C).</li>
	<li>בדוק את הכדאיות של כל מדגם hemocytometer מתחת למיקרוסקופ.</li>
	<li>לספור את מספר תאים חיים (מוכתם על ידי trypan blue) בשדות 15. לחשב את המספר הכולל של תאים ב- 20 מיקרומטר של התליה תא. ההשעיה מוכן כעת עבור כל יישום במורד הזרם. הערה: כאשר ייעול ההליך עבור מינים אחרים עם גודל הגוף גדול יותר, השתמש testis שברי משקל שווה. השתמש האשכים מאדם אחד עבור כל קבוצות ניסוי על מנת להימנע השתנות בודדים בתוצאות. במקרה של דג זברה, ניצלנו את העובדה כי שמאלה, testis נכון צריך להכיל מספר זהה (או דומה) בתאי הנבט13 (ראה את התוצאות נציג). בזרמה שמאל נשמר כפקד בזמן בזרמה נכון היה vitrified/מחמם. הכדאיות אחוז מחושב מספר התאים מבודד בזרמה vitrified/חימם לעומת מספר התאים מבודד בזרמה טריים.</li>
</ol>

<ol><li>Mazur, P., Leibo, S. P., Seidel, G. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+the+germplasm+of+animals+used+in+biological+and+medical+research%3A+Importance%2C+impact%2C+status%2C+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status, and future directions.</a> Biol. Reprod. 78 (1), 2-12 (2008).</li>
<li>Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+and+In+Vitro+Fertilization+at+the+Zebrafish+International+Resource+Center%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation and In Vitro Fertilization at the Zebrafish International Resource Center.</a> Methods Mol. Biol. 546, 45-65 (2009).</li>
<li>Yang, H., Carmichael, C., Varga, Z. M., Tiersch, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+simplified+and+standardized+protocol+with+potential+for+high-throughput+for+sperm+cryopreservation+in+zebrafish+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Development of a simplified and standardized protocol with potential for high-throughput for sperm cryopreservation in zebrafish Danio rerio.</a> Theriogenology. 68 (2), 128-136 (2007).</li>
<li>Morris, J. P. IV, Berghmans, S., Zahrieh, D., Neuberg, D. S., Kanki, J. P., Look, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+sperm+cryopreservation+with+N%2CN-dimethylacetamide%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Zebrafish sperm cryopreservation with N,N-dimethylacetamide.</a> Biotechniques. 35 (5), 956-968 (2003).</li>
<li>Yoshizaki, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermatogonial+transplantation+in+fish%3A+A+novel+method+for+the+preservation+of+genetic+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biochem.+Physiol.+Part+D%3A+Genomics+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Spermatogonial transplantation in fish: A novel method for the preservation of genetic resources.</a> Comp. Biochem. Physiol. Part D: Genomics Proteomics. 6 (1), 55-61 (2011).</li>
<li>Gao, D., Critser, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cryoinjury+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cryoinjury in living cells.</a> ILAR J. 41 (4), 187-196 (2000).</li>
<li>Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horváth, Á <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress%2C+challenges+and+perspectives+on+fish+gamete+cryopreservation%3A+A+mini-review%5BTitle%5D)+AND+%22Gen.+Comp.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 69-76 (2017).</li>
<li>Kása, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+sperm+vitrification+protocols+for+freshwater+fish+%28Eurasian+perch%2C+Perca+fluviatilis%29+and+marine+fish+%28European+eel%2C+Anguilla+anguilla%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gen.+Comp.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Development of sperm vitrification protocols for freshwater fish (Eurasian perch, Perca fluviatilis) and marine fish (European eel, Anguilla anguilla).</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 102-107 (2017).</li>
<li>Cuevas-Uribe, R., Leibo, S. P., Daly, J., Tiersch, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+channel+catfish+with+sperm+cryopreserved+by+rapid+non-equilibrium+cooling%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Production of channel catfish with sperm cryopreserved by rapid non-equilibrium cooling.</a> Cryobiology. 63 (3), 186-197 (2011).</li>
<li>Wang, Y., Xiao, Z., Li, L., Fan, W., Li, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+needle+immersed+vitrification%3A+A+practical+and+convenient+method+with+potential+advantages+in+mouse+and+human+ovarian+tissue+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Novel needle immersed vitrification: A practical and convenient method with potential advantages in mouse and human ovarian tissue cryopreservation.</a> Hum. Reprod. 23 (10), 2256-2265 (2008).</li>
<li>Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Live+Offspring+from+Testicular+Tissue+Cryopreserved+by+Vitrification+Procedures+in+Japanese+Quail+%28Coturnix+japonica%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Production of Live Offspring from Testicular Tissue Cryopreserved by Vitrification Procedures in Japanese Quail (Coturnix japonica).</a> Biol. Reprod. 88 (5), 124(2013).</li>
<li>Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+needle-in-straw+vitrification+can+effectively+preserve+the+follicle+morphology%2C+viability%2C+and+vascularization+of+ovarian+tissue+in+Japanese+quail+%28Coturnix+japonica%29%5BTitle%5D)+AND+%22Anim.+Reprod.+Sci%22%5BJournal%5D)">Novel needle-in-straw vitrification can effectively preserve the follicle morphology, viability, and vascularization of ovarian tissue in Japanese quail (Coturnix japonica).</a> Anim. Reprod. Sci. 134 (3-4), 197-202 (2012).</li>
<li>Lee, S., Yoshizaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+cryopreservation+of+spermatogonia+in+critically+endangered+Manchurian+trout+%28Brachymystax+lenok%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Successful cryopreservation of spermatogonia in critically endangered Manchurian trout (Brachymystax lenok).</a> Cryobiology. 72 (2), 165-168 (2016).</li>
<li>Marques, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viability+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29+ovarian+follicles+after+vitrification+in+a+metal+container%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Viability of zebrafish (Danio rerio) ovarian follicles after vitrification in a metal container.</a> Cryobiology. 71 (3), 367-373 (2015).</li>
<li>Lujić, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+successful+vitrification+of+salmonid+ovarian+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">First successful vitrification of salmonid ovarian tissue.</a> Cryobiology. 76, 154-157 (2017).</li>
<li>Bono-Mestre, C., Cardona-Costa, J., García-Ximénez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+on+cell+viability+of+three+zebrafish+testicular+cell+or+tissue+cryopreservation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22CryoLetters%22%5BJournal%5D)">Effects on cell viability of three zebrafish testicular cell or tissue cryopreservation methods.</a> CryoLetters. 30 (2), 148-152 (2009).</li>
<li>Marinović, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryosurvival+of+isolated+testicular+cells+and+testicular+tissue+of+tench+Tinca+tinca+and+goldfish+Carassius+auratus+following+slow-rate+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22Gen.+Comp.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Cryosurvival of isolated testicular cells and testicular tissue of tench Tinca tinca and goldfish Carassius auratus following slow-rate freezing.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 77-83 (2017).</li>
<li>Pšenička, M., Saito, T., Rodina, M., Dzyuba, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+early+stage+Siberian+sturgeon+Acipenser+baerii+germ+cells%2C+comparison+of+whole+tissue+and+dissociated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of early stage Siberian sturgeon Acipenser baerii germ cells, comparison of whole tissue and dissociated cells.</a> Cryobiology. 72, 119-122 (2016).</li>
<li>Lee, S., Iwasaki, Y., Shikina, S., Yoshizaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+eggs+and+sperm+from+cryopreserved+whole+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nati.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Generation of functional eggs and sperm from cryopreserved whole testes.</a> Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 110 (5), 1640-1645 (2013).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

המטרה העיקרית של מחקר זה היתה להתאים את המחט שקוע אולטרה מהירה הליך קירור שפותח עבור מינים העופות בתרבית של10,11,12 הקפאה קריוגנית של דגים testis (דג זברה כמודל האורגניזם). רוב המחקרים הקודמים לגבי הקפאה קריוגנית של משאבים גנטי דג זברה התמקדו בעיקר הקפאה קריוגנית של דג זברה זרע2,3,4. עם זאת, פרוטוקולים עבור הקפאה קריוגנית oocytes בוגר, ...

הרומן מגמות מדעים וביוטכנולוגיה הובילו ליצירתו של אלפי שורות מוטציה חדשה של עכברים, דרוזופילה, דג זברה, מינים אחרים משמשים והאורגניזמים מודל ביורפואי ו- מדעים אחרים1. יתר על כן, כפי טכנולוגיות חדשות שפותחו ולהיות זמין, מספרי הקווים המוטנטים להגדיל בהתמדה2. זה מוביל הצורך אחסון בטוח של משאבים גנטי מעבר השיטות הנפוצות אצל לשמור. על גידול במושבות. כמו שיטה המאפשרת אחסון בטוח של משאבים גנטי לתקופה לא מוגבלת של זמן, הקפאה קריוגנית מציע יתרונות רבים כגון הארכת עונת הרבייה, עוקף את הצורך תחזוקה רציפה של broodstock, זה יותר עלות - ו עבודה יעיל2.
פרוטוקולים עבור זרע הקפאה קריוגנית פיתחה במהלך בעבר מספר שנים2,3,4 מציעים את ההזדמנות לאחסון מוצלחת של חומר גנטי זכר דג זברה. עם זאת, הקפאה קריוגנית של ביציות או עוברים בדגים אינו אפשרי עדיין בשל המבנה המורכב שלהם ואת כמויות גדולות של חומר חלמון. לאחרונה, המנהג של השתלת בתאי הנבט הקדמוני (PGCs) או בתאי גזע spermatogonial (SSCs) מציע ניתוח מעקפים כדי מחסום זה מתפתח זרע פונקציונלי וביצים לאחר השתלת5. לכן, הקפאה קריוגנית של SSCs מציע אפיק חדש בתחום שימור משאבים גנטי נדיר ורב ערך.
אף-על-פי הקפאה קריוגנית מציע יתרונות רבים, תהליך ההקפאה של קצב איטי מייצר מספר תנאים שעלולות להוביל לנזק תא2. אלה כוללים היווצרות קרח תאיים חוץ-תאית, התייבשות, רעילות cryoprotectant ואחרים. קרח תאיים גורם נזק לתאים, קרח חוץ-תאית עשויה להוביל ריסוק מכני של תאים, תוך פיזור מים מתאי במהלך קצב איטי קפוא עלול להוביל להתייבשות6. לאחרונה הוחל ויטריפיקציה כמו שיטה אשר מונע את ההשפעות השליליות של היווצרות קרח ב הקפאה קריוגנית של דגים גמטות7,8,9. הוא מציג שיטת הקירור אולטרה מהירה שדרכו התקשורת פנימיים וחיצוניים להפוך מצב אמורפי מזוגגות ללא crystalizing לתוך קרח7,10. ויטריפיקציה מוצלחת של רקמת האשכים ואת השחלות העגום מינים העופות בתרבית של10,11,12, ובכך לפתוח אפשרויות היישום שלה בדגים, כמו גם.
במחקר זה, אנו מציגים את המחט שקוע ויטריפיקציה (ניב) נוהל הקפאה קריוגנית של כל דג זברה האשכים. נדגים שיטה אמינה עבור בידודו של דג זברה בשלב מוקדם בתאי הנבט ללא זיהום, תהליך הקפאה קריוגנית המניבה כמות גבוהה יחסית בתאי הנבט בשלב מוקדם עם נוכחות נמוכה של תאים אחרים, במיוחד spermatozoa. לפי מיטב ידיעתנו, זהו המחקר הראשון להדגים פרוטוקול מטמיעים מפורט לקירור אולטרה מהירה של רקמת האשכים דגים דג זברה germline תאים. בנוסף, הדיר של השיטה הוא הפגינו חמישה זנים שונים דג זברה: AB פראי סוג, קספר (רוי- / -; נאקרה- / -), נמר (ליאוt1/t1), "ואסה" [Tg (vas::eGFP)] וקו Wilms הגידול [Tg (wt1b::eGFP 1)] מהונדס.

<table><tbody><tr><td>מדיה לייבוביץ (L-15)</td><td>סיגמא-אולדריץ</td><td>' L1518</td><td>בתוספת L-גלוטמין</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>סיגמא-אולדריץ</td><td>' F9665</td><td></td></tr><tr><td>טריקאין מתאן סולפונאט (MS-222)</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>אקרוס אורגני</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>Trehalose</td><td>Acros Organics</td><td>99-20-7</td><td>דיהידראט</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>ריאנל</td><td>20740-0-08-65</td><td></td></tr><tr><td>פרופילן גליקול</td><td>ריאנל</td><td>08860-1-08-65</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד</td><td>ריאנל</td><td>00190-1-01-65</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז</td><td>גיבקו</td><td>9001-12-1</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T8003</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Panreac AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>טריפן כחול</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח (PBS)</td><td>טבליות Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>להכנת תמיסת PBS 200 מ"ל</td></tr></tbody></table>

הקפאה קריוגנית של דג זברה spermatogonia על ידי מחט האשכים כולו שקוע צינון אולטרה מהיר

Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

המגמות הנוכחיות מדעים וביוטכנולוגיה להוביל יצירה של אלפי קווים חדשים דגם אורגניזמים ובכך מובילים והצורך שיטות חדשות עבור אחסון בטוח של משאבים גנטי מעבר השיטות הנפוצות אצל לשמור. על גידול במושבות. המטרה העיקרית של מחקר זה היה להתאים את המחט שקוע ויטריפיקציה (ניב) הליך כדי cryopreserve כל דג זברה האשכים. הקפאה קריוגנית תאי נבט בשלב מוקדם על ידי האשכים כל ניב מציע אפשרויות האחסון של דג זברה משאבים גנטי, במיוחד לאחר ההשתלה יכולה פירעונם לתוך גמטות גם זכר וגם נקבה. האשכים היו טוחנות, על מחט אקופונקטורה, equilibrated בתקשורת cryoprotective שני (equilibration לאודנום מתנול 1.5 M ו- 1.5 M פרופילן גליקול; ופתרון ויטריפיקציה המכילה 3 מ' דימתיל סולפוקסיד ו 3 מ' פרופילן גליקול) צלל לתוך חנקן נוזלי. הדגימות היו חימם בסדרה של שלושה פתרונות חימום הסוגר. היתרונות העיקריים של שיטה זו הם (1) חוסר spermatozoa לאחר העיכול של האשכים ומחוממת למוצא מניפולציות במורד הזרם; (2) אולטרה מהירה קירור המאפשרים את החשיפה האופטימלית של רקמות לחנקן נוזלי ולכן למקסם את הקירור ואת הקטנת הריכוז הנדרש של cryoprotectants, ובכך מקצר את הרעילות שלהם; (3) סינכרונית חשיפת האשכים מספר cryoprotectants, חנקן נוזלי; והפגינו הדיר (4) על-ידי רכישת יכולת הקיום של מעל 50% ב- 5 זנים שונים דג זברה.

בממוצע, המספר בתאי הנבט בשלב מוקדם מבודד מבחן יחיד דג זברה טריים מגוונות בין תאים 40,000 ו- 200,000 בהתאם לגודל הדג. כאשר מעכל האשכים דג זברה טריים בכל 5 זנים, בתאי הנבט המוקדמות היו לא התאים רק נוכח המתלים תא (איור 2). ליד תאי נבט בשלב מוקדם, spermatozoa רבים נמצאו גם כן. מצד שני, היו הרבה פחות spermatozoa לאחר עיכול של האשכים cryopreserved. זה יצוין כי spermatozoa אינם שורדים פרוטוקול זה קירור מהיר במיוחד, כי הם ככל הנראה מסולקת במהלך תהליך העיכול, אשר מניב...

המטרה העיקרית של מחקר זה היה להתאים את המחט שקוע ויטריפיקציה (ניב) הליך כדי cryopreserve כל דג זברה האשכים. בנוסף, נבדקה את הדיר של שיטת חמישה זנים שונים דג זברה.

הקפאה קריוגנית של דג זברה Spermatogonia על ידי מחט האשכים כולו שקוע צינון אולטרה מהיר

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods ...

הקפאה בטמפרטורות נמוכות (Cryopreservation) מציעה את האפשרות לשמר תאים ורקמות חיים בטמפרטורות נמוכות למשך פרק זמן בלתי מוגבל, לפחות במונחים אנושיים. ויטריפיקציה היא סוג של שימור בהקפאה הכולל קירור מהיר במיוחד למצב זכוכיתי ואמורפי, ללא היווצרות של קרח גבישי וללא הנזקים הנלווים לכך. בסרטון זה, אנו מציגים את הפרוטוקול לוויטריפיקציה של אשכים שלמים של דג הזברה (zebrafish), המאפשר את אחסונם הבטוח עד לשימוש בהם מאוחר יותר כמקור לתאי נבט להשתלה במקבלים מתאימים.לפרוטוקול הוויטריפיקציה הנוכחי יש יתרון משמעותי אחד על פני פרוטוקולי ההקפאה בקצב איטי בכל הנוגע למניפולציות של תאי גזע נבטיים. והוא שלאחר הוויטריפיקציה והחימום, תאי הזרע מתים והם מוסרים כך שאינם נוכחים בסספנסיית התאים. לפיכך, אין צורך בבידוד של תאים נבטיים לאחר החימום.דבר זה מקל באופן משמעותי על המניפולציות הבאות. יש להקרין את הדג על ידי הנחתו בצלחת המכילה 200 milligrams per liter של MS-222 ב-pH 7. לפני המשך הניתוח, ודאו שהזימים הפסיקו לנוע, ושעברו לפחות 10 דקות מרגע זה כדי להבטיח מוות מהיפוקסיה.ייבשו את הדג על ידי טפיחות עם נייר סופג והניחו אותו על גבו על משטח נתיחה. ראשית, גזרו את סנפירי הגב והסנפירים החזיים כדי להקל על הנתיחה. גזרו לרוחב את העור בבטן הדג בין הסנפירים החזיים, וחתכו את העור ואת השריר שמתחתיו לאורך הבטן עד לסנפיר הפיט

cryopreservation-zebrafish-spermatogonia-whole-testes-needle-immersed

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

זהו תפוקה גבוהה cryopreservation זרע פרוטוקול דג הזברה. זרע cryopreserved בפרוטוקול זה יש ממוצע של 25% פוריות הפריה חוץ גופית לאחר מכן והוא יציב לאורך שנים רבות.

שיטת תפוקה גבוהה עבור cryopreservation זרע דג הזברה במבחנה הפריה

זוהי שיטה להפקת דיפלואידי gynogenetic עוברי דג הזברה (אשר עוברים רק תרומה גנטית מגיע מהאם) על ידי חסימת חלוקת meiotic מחרה מחזיק אחריה מיד לאחר ההפריה עם זרע אור אולטרה סגול מומת. עוברים EP אינם הומוזיגוטים במלואה עקב רקומבינציה במהלך החלוקה meiotic הראשון, אולם הם הומוזיגוטים בכלל לוקוסים שלא היה מופרד centromere שלהם על ידי רקומבינציה.

ביצוע דיפלואידי דג הזברה Gynogenetic על ידי לחץ מוקדמת

בסרטון זה, אנו מדגימים שיטת ויטריפיקציה קריוגרפית מהירה במיוחד לשימור דגימות ביולוגיות. השיטה כוללת שימוש בשילוב של cryoprotectants כדי להגן על הרקמה הביולוגית מפני נזקי קיפאון על ידי מניעת היווצרות גבישי קרח תוך תאיים.

שימור בהקפאה מבוסס ויטריפיקציה: טכניקת קירור מהירה במיוחד לשימור דגימות ביולוגיות בטמפרטורות נמוכות מאוד לאחסון לטווח ארוך

בסרטון זה, אנו מתארים את הליך הוויטריפיקציה של עוברי ארנבים שנקטפו בשלב ההתפתחות הרצוי באמצעות אתילן גליקול ודימתיל סולפוקסיד כהגנה קריוגנית וקש קריוגני כמערכת הנשא. לעוברים המזוגגים יש שיעור הישרדות גבוה וניתן לאחסן אותם לתקופה ממושכת עד לשימוש.

ויטריפיקציה של עוברי ארנב באמצעות קש קריוגני: טכניקת קירור מהירה במיוחד לשימור עוברי ארנבים לאחסון לטווח ארוך

דג הזברה הוא מערכת מודל רבת עוצמה לביולוגיה התפתחותית וחקר מחלות אנושיות בשל הדמיון הגנטי שלהם עם בעלי חוליות גבוהים יותר. פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה ליצירת עוברי דג זברה הפלואידים שניתן להשתמש בהם לאסטרטגיות מסך קדימה לזיהוי מוטציות רצסיביות בגנים החיוניים לאמבריוגנזה מוקדמת.

ייצור של הפלואידים עוברי דג הזברה על ידי<em&gt; במבחנה</em&gt; הפריה

השימוש בדגי זברה למחקר קרדיווסקולרי מתרחב למחקר על לבבות בוגרים. עבור יישומים אלה, בידוד מהיר ופשוט של רקמות לב הוא המפתח למניעת שינויים לאחר המוות ולהשגת מספר מספיק של דגימות. כאן, אנו מתארים שיטה מהירה וניתנת לשחזור לניתוח לבבות דגי זברה בוגרים.

שחזור של לבבות למבוגרים דג הזברה עבור יישומי תפוקה גבוהה

דגימת דם חוזרת היא הכרחית וחשובה במחקר בבעלי חיים. פיתחנו שיטה חדשנית, לא קטלנית ואמינה לאיסוף דם חוזר מדגי זברה בוגרים, ויישמנו שיטה זו לחקר הביוכימיה של הדם, כולל מטבוליזם של גלוקוז.

איסוף דם חוזרים ונשנים לבדיקות דם בדג הזברה למבוגרים

פרוטוקול שונה עבור מניפולציה ploidy משתמשת הלם החום להשפיע על דוכן אחד-מחזור ב cytokinesis בעובר המוקדם. פרוטוקול זה מודגם דג הזברה אבל עשוי לחול על מינים אחרים.

מניפולציה ploidy של עוברי דג הזברה עם חום 2 הלם טיפול

כפולות משטח גרעיני הם כלי הכרחי עבור לימוד אירועי כרומוזום במהלך meiosis. כאן אנו מדגימים שיטה כדי להכין ולדמיין כרומוזומים מיוטיים במהלך prophase הייתי מתוך הדגים הספרציטים.

הכנת כרומוזום מיוסטי כפולות מדגים בזימטציטים

כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה להפרדת תאים זקיקיים וביצית בזקיקים השחלות זברה, אשר יקל על חקירות של התפתחות השחלות ב זברה.

הפרדת תאים זקיקים וביצים בזקיקי השחלות של זברהפיש

טכנולוגיות CRISPR-Cas חוללו מהפכה בתחום עריכת הגנום. עם זאת, מציאת ובידוד עריכת קו הנבט הרצויה נותרה צוואר בקבוק משמעותי. לכן, פרוטוקול זה מתאר שיטה חזקה לסינון מהיר של זרע דג זברה מוזרק F0 CRISPR לעריכות קו הנבט באמצעות טכניקות PCR סטנדרטיות, תקציר הגבלה ואלקטרופורזה בג'ל.

בדיקת זרע לבידוד מהיר של עריכות נבט בדגי זברה

למד פרוטוקול הקפאה קריוגנית של אשכי דג זברה בשלמותם באמצעות שיטת מחט שקועה בצינון אולטרה מהיר. השיטה מאפשרת אחסון ארוך טווח של תאי זרע לשימוש עתידי בהשתלות.

הקפאה קריוגנית של דג זברה Spermatogonia על ידי מחט האשכים כולו שקוע צינון אולטרה מהיר

גלה סרטונים נוספים