ניצול של קפסולות עבור מכתים שלילי של דגימות ויראלי בתוך Biocontainment

המטרה הכללית של שיטה זו היא לספק הליך פשוט ואפקטיבי לצביעה שלילית ב-TEM עבור דגימות נגיפים בתוך סביבת בידוד ביולוגי. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בווירולוגיה בנוגע למורפולוגיה ולמבנים של נגיפים הנחקרים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת טיפול קל ואפקטיבי ברשתות למיקרוסקופיה אלקטרונית בתוך סביבות של בידוד ביולוגי. טכניקה זו שימושית כחלק מאבחון TEM של נגיף לא ידוע, מכיוון שניתן ליישמה בקלות על דגימות נגיפים בכל הסביבות. למרות שבעיקר השתמשנו בשיטה זו כדי לסייע במחקרי TEM של נגיפים, יש לה יישום רחב בהרבה וניתן להשתמש בה בחקירת EM של רוב הננו-חלקיקים. בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקשו בתחילה, כיוון שנדרש תרגול מסוים כדי להבטיח שרשתות ה-TEM לא יינזקו בעת ההכנסה וההוצאה מהקפסולות.

הרעיון לשיטה זו עלה אצלנו לראשונה כאשר נתקלנו בקשיים בטיפול ברשתות EM קטנות תחת תנאי בידוד ביולוגי.

כדי להתחיל בפרוצדורה זו, הכין או רכוש רשתות נחושת ל-TEM מצופות ב-Formvar ובפחמן. הכנס את רשתות ה-TEM המצופות לקפסולות. לאחר מכן, העבר את הקפסולות הטעונות יחד עם ציוד וריאגנטים נוספים לאזור הביו-הכלה. לתחילת העבודה, חבר את הקפסולה לפיפט. שאב 40 µL של תמיסת נגיף אל תוך הקפסולה. הנח את הפיפט על צדו, כאשר הרשתות מכוונות באופן אופקי למשך 10 דקות. לאחר מכן, הרם את הפיפט ושפוך את תמיסת הנגיף למכל פסולת. שאב 40 µL של מקבע גלוטראלדהיד (glutaraldehyde) בריכוז 2% אל תוך הקפסולות. הנח את הפיפט על צדו למשך 20 דקות. לאחר מכן, פלוט את המקבע ושאב 40 µL של מים דה-יוניים אל תוך הקפסולה, כדי לשטוף את המקבע. חזור על שטיפה זו שלוש פעמים.

בשלב הבא, שאבו 40 µL של 1% uranyl acetate או 1% potassium phosphotungstic acid אל תוך הקפסולה. המתינו 30 שניות. לאחר מכן, הוציאו את הקפסולה מהפיפטה.

הסבירו את קצות הרשתות בעזרת נייר סינון כדי לייבשן. העבירו את נייר הסינון לפרועת צנטריפוגה בנפח 15 milliliters. לאחר מכן, השרו את נייר הסינון בתמיסת osmium tetroxide בריכוז 1%.

הניחו את הקפסולה כשהמכסה פתוח לתוך המבחנה. אטמו את המבחנה למשך שעה אחת כדי לאפשר חדירה מלאה של אדי האוסמיום טטראוקסיד. לאחר מכן, חטאו את המבחנה והעבירו אותה מתוך אזור הביו-הכלה למעבדת ה-EM ברמת BSL-2.

הוצא את הקפסולה משפופרת הצנטריפוגה, ולאחר מכן הנח אותה על פיפטה. שאב 40 µL של מים ד-יוניזים לתוך הקפסולה ולאחר מכן רוקן את המים למכל פסולת. חזור על שטיפה זו במים שלוש פעמים.

בשלב הבא, הוצא את הקפסולה מהפיפטה. בעזרת נייר סינון, יבש את הגרידים על ידי ספיגה. הנח לגרידים להתייבש באוויר ולאחר מכן אחסן אותם בקופסת גרידים, עד לביצוע הדמיית TEM.

لتחילתו, ערבבו את תרחיף הנגיף עם נפח שווה של גלוטראלדהיד 4%, כדי להגיע לריכוז סופי של גלוטראלדהיד 2%. השתמשו במקבע כדי להשבית את הנגיף למשך 24 שעות לפחות. דהו נזקו את המבחנה והעבירו אותה למתקן ה-EM ברמת בטיחות BLS-2. לאחר מכן, הצמידו תפס טעון ברשתות לפיפטה. שאבו את התערובת לתוך הקפסולה. הניחו את הפיפטה על צדה כאשר הרשתות מונחות באופן אופקי למשך 10 דקות.

בשלב הבא, הרים את הפ pipette ורוקן את תערובת הנגיף אל תוך מיכל פסולת. שאב 40 microliters של מים דה-יוניים אל תוך הקפסולה ולאחר מכן השלך את המים למיכל פסולת. חזור על שטיפה זו שלוש פעמים.

לאחר מכן, שאבו 40 µL של 1% UA או 1% PTA לתוך הקפסולה למשך 30 שניות. הסירו את הקפסולה מהפיפטה. ייבשו את הרשתות בעזרת נייר סינון.

לאחר מכן, יש להניח לרשתות להתייבש באוויר.

במחקר זה, דגימות של נגיף האבולה זאיר עוברות צביעה שלילית, באמצעות שיטת הטיפה הידנית ושיטת הקפסולה. תמונות ה-TEM שהופקו בשיטות אלו מראות שתיהן פרטים מוגדרים בבירור, עם מבני נוקלאוקפסייד במרכז הויראון וגליקופרוטאינים נראים על פני השטח. לפיכך, שיטת הקפסולה מסוגלת להפיק תמונות TEM באיכות דומה לזו המופקת בשיטת הטיפה הידנית. לאחר מכן, משווים שיטות שונות להבטחה (אינאקטיבציה) של דגימות באמצעות נגיף הצ'יקונגוניה. הבטחת הדגימה מושגת באופן מהיר, על ידי שימוש ב-2% glutaraldehyde למשך 20 דקות עם חשיפה עוקבת ל-1% osmium tetroxide למשך שעה אחת, או במהלך הלילה, על ידי שימוש ב-2% glutaraldehyde למשך 24 שעות. כפי שניתן לראות, תהליך ההבטחה הממושך יותר ללא osmium tetroxide מאפשר לראות פרטים אולטרה-מבניים רבים יותר.

לאחר מכן, באמצעות שיטת הקפסולה, הושוו שני צבעים תוך שימוש בחלקיקים דמויי-נגיף מקובעים באלדהיד. הן uranyl acetate והן phosphotungstic acid הראו תוצאות באיכות גבוהה, עם גבולות מוגדרים בבירור וגליקופרוטאינים נראים.

ברגע שהטכניקה נשלטת, ניתן לבצעה בכשעה וחצי, בהתאם למספר הדגימות. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לבחור את חומרי הקיבוע והצביעה המתאימים למטרות הניסוי. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון ספירת חלקיקים, כדי לענות על שאלות נוספות באמצעות חישוב ריכוזי הווירוס.

טכניקה זו משפרת את האופן שבו וירוסולוגים יכולים לחקור מידע על מורפולוגיה ומבנה של נגיפים בקלות רבה יותר, במיוחד בנגיפים מרמות BLS-3 ו-4. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי הטיפול הקל ברשתות TEM לצביעה שלילית בתוך מתקני בידוד ביולוגי. זכרו כי עבודה עם אלדהיד, אוסמיום טטראוקסיד ואורניל אצטט עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש להשתמש תמיד באמצעי זהירות כגון ציוד מגן אישי מתאים ומבת הכרימה כימית בעת ביצוע הליך זה.