ניצול של קפסולות עבור מכתים שלילי של דגימות ויראלי בתוך Biocontainment
July 19th, 2017
פרוטוקול זה מספק הוראה עבור דגימות וירוס מכתים שלילי אשר יכול בקלות לשמש במעבדות BSL-2, -3, -4 או -4. הוא כולל את השימוש בקפסולה עיבוד חדשנית, אשר מגן על רשת אלקטרונים שידור מיקרוסקופיה ומספק למשתמש טיפול קל יותר בסביבות סוערות יותר בתוך biocontainment.
המטרה הכוללת של שיטה זו היא לספק הליך צביעה שלילי TEM פשוט ויעיל עבור דגימות נגיפיות בתוך הכלה ביולוגית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בווירולוגיה לגבי המורפולוגיה והמבנים של נגיפים הנחקרים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת טיפול קל ויעיל ברשתות מיקרוסקופ אלקטרונים בסביבות הכלה ביולוגית.
טכניקה זו משמשת כחלק מאבחון TEM של נגיף לא ידוע מכיוון שניתן ליישם אותה בקלות על דגימות נגיפיות בכל הסביבות. למרות שהשתמשנו בשיטה זו בעיקר כדי לסייע במחקרי TEM של וירוסים, יש לה יישום רחב בהרבה וניתן להשתמש בה בחקר EM של רוב הננו-חלקיקים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שנדרש תרגול מסוים כדי להבטיח שרשתות TEM לא ייפגעו בעת טעינה ופריקה מהקפסולות.
הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר נתקלנו בבעיות בטיפול ברשתות EM קטנות בהכלה ביולוגית. כדי להתחיל בהליך זה, הכן או רכוש מרשתות נחושת TEM ויראליות ומצופות פחמן. הכנס את רשתות ה-TEM המצופות לכמוסות.
לאחר מכן, העבירו את הכמוסות העמוסות יחד עם אספקה וריאגנטים אחרים להכלה ביולוגית. כדי להתחיל, חבר את הקפסולה לפיפטה. שאפו 40 מיקרוליטר של התפשטות הנגיף לתוך הקפסולה.
הניחו את הפיפטה על צדה, כשהרשתות מכוונות אופקית למשך 10 דקות. לאחר מכן, הרם את הפיפטה והוציא את תמיסת הנגיף לתוך הכלת פסולת. יש לשאוב 40 מיקרוליטר של קיבוע 2% גלוטראלדהיד לתוך הכמוסות.
הניחו את הפיפטה על צדה למשך 20 דקות. לאחר מכן, הוציאו את הקיבוע ושאבו 40 מיקרוליטר מים דה-יוניים לתוך הקפסולה, כדי לשטוף את הקיבוע. חזור על שטיפה זו שלוש פעמים.
לאחר מכן, שאפו 40 מיקרוליטר של 1% אורניל אצטט או 1% חומצה פוספוטונגסטית אשלגן לתוך הקפסולה. יש להשאיר את הקפסולה למשך 30 שניות. לאחר מכן, הסר את הקפסולה מהפיפטה.
גע בפיסת נייר סינון בקצה הרשתות כדי להתייבש. מעבירים נייר סינון לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. לאחר מכן, יש להשרות את נייר הסינון בתמיסת טטרוקסיד אוסמיום 1%.
יש להניח את הקפסולה כשהמכסה פתוח לתוך הצינור. אטום את הצינור למשך שעה כדי לאפשר חדירה מלאה של אדי האוסמיום טטרוקסיד. לאחר מכן, יש לטהר את הצינור ולהעביר אותו מההכלה הביולוגית למתקן BSL-2 EM.
הסר את הקפסולה מצינור הצנטריפוגה ולאחר מכן הנח אותה על פיפטה. שאפו 40 מיקרוליטר מים נטולי יונים לתוך הקפסולה ולאחר מכן הזרימו את המים למיכל פסולת. חזור על שטיפת מים זו שלוש פעמים.
לאחר מכן, הסר את הקפסולה מהפיפטה. בעזרת נייר פילטר יש לייבש את הרשתות. הניחו לרשתות להתייבש באוויר ולאחר מכן אחסנו אותן בקופסת רשת, עד שהן מוכנות לביצוע הדמיית TEM.
כדי להתחיל, ערבבו את תרחיף הנגיף בנפח שווה של 4% גלוטרלדהיד, כדי להשיג ריכוז סופי של 2% גלוטרלדהיד. באמצעות תיקון, השבת את הווירוס למשך 24 שעות לפחות. לטהר את הצינור ולהעביר אותו למתקן BLS-2 EM.
לאחר מכן, חבר לכידה טעונה ברשת לפיפטה. שואבים את התערובת לתוך הכמוסה. הניחו את הפיפטה על צדה כשהרשתות מכוונות אופקית למשך 10 דקות.
לאחר מכן, הרימו את הפיפטה והוציאו את תערובת הנגיפים למיכל פסולת. שאפו 40 מיקרוליטר מים נטולי יונים לתוך הקפסולה ולאחר מכן השליכו את המים למיכל פסולת. חזור על שטיפה זו שלוש פעמים.
לאחר מכן, יש לשאוב 40 מיקרוליטר של 1% QA או 1% PTA לתוך הקפסולה למשך 30 שניות. הסר את הקפסולה מהפיפטה. בעזרת נייר פילטר יש לייבש את הרשתות.
לאחר מכן, הניחו לרשתות להתייבש באוויר. במחקר זה, דגימות נגיף האבולה בזאיר עוברות צביעה שלילית, הן בשיטת הטיפה הידנית והן בשיטת הקפסולה. תמונות ה-TEM שנוצרו משיטות אלה, שתיהן מציגות פרטים מוגדרים בבירור, עם מבנים נוקלאוקפסידים במרכז הווריון, וגליקופרוטאינים גלויים על פני השטח.
לפיכך, שיטת הקפסולה מסוגלת לייצר תמונות TEM באיכות דומה לאלו המופקות בשיטת הטיפות הידנית. לאחר מכן, משווים שיטות שונות של השבתת דגימה באמצעות וירוס צ'יקונגוניה. השבתת הדגימה מושגת במהירות, על ידי שימוש ב-2% גלוטרלדהיד למשך 20 דקות עם חשיפה לאחר מכן ל-1% אוסמיום טטרוקסיד למשך שעה, או למשך הלילה, על ידי שימוש ב-2% גלוטרלדהיד למשך 24 שעות.
כפי שניתן לראות, תהליך ההשבתה הארוך יותר ללא אוסמיום טטרוקסיד מאפשר לראות פרטים אולטרה-מבניים יותר. לאחר מכן, בשיטת הקפסולה, הושוו שני כתמים באמצעות חלקיקים דמויי וירוס קבועים של אלדהיד. גם אורניל אצטט וגם חומצה פוספוטונגסטית מציגים תוצאות באיכות גבוהה, עם גבולות מוגדרים בבירור וגליקופרוטאינים גלויים.
לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשעה וחצי, תלוי במספר הדגימות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבחור ריאגנטים קיבוע וצביעה מתאימים למטרות הניסוי שלך. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ספירת חלקיקים על מנת לענות על שאלות נוספות על ידי חישוב ריכוזי הנגיף.
טכניקה זו משפרת את האופן שבו וירולוגים יכולים לחקור את המורפולוגיה של הנגיף ולבנות מידע בקלות רבה יותר, במיוחד בנגיפים ברמה BLS-3 ו-4. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לטפל בקלות ברשתות TEM לצביעה שלילית בתוך הכלה ביולוגית. אל תשכח שעבודה עם אלדהיד, אוסמיום טטרוקסיד ואורניל אצטט עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש להשתמש תמיד באמצעי זהירות כגון ציוד מגן אישי מתאים ומכסה אדים כימי בעת ביצוע הליך זה.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
פרוטוקול זה מספק שיטת צביעה שלילית פשוטה ויעילה עבור דגימות ויראליות בתוך בידוד ביולוגי. הוא כולל כמוסת עיבוד חדשנית שמשפרת את הטיפול ברשתות מיקרוסקופ אלקטרונים במעבדות BSL-2, -3 או -4.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- וירולוגיה
- מיקרוסקופיית אלקטרונים
- טכניקות בידוד ביולוגי
רקע
- צביעה שלילית חיונית לחקר מורפולוגיית הנגיף.
- מיקרוסקופיית אלקטרונים בהעברה (TEM) היא כלי מרכזי בתחום הוירולוגיה.
- טיפול בדגימות בבידוד ביולוגי מציב אתגרים ייחודיים.
- שיטה זו נועדה לפשט את האתגרים הללו.
מטרת המחקר
- לספק שיטת צביעה שלילית אמינה ל-TEM לדגימות ויראליות.
- להקל על חקירת מבני הנגיף.
- לשפר את הטיפול בדגימות בסביבות בידוד גבוה.
שיטות ששימשו
- צביעה שלילית של דגימות ויראליות.
- שימוש בכמוסת עיבוד לטיפול ברשתות.
- יישום במעבדות BSL-2, -3 או -4.
- הדרכה למשתמשים חדשים כדי למזער נזק לרשתות.
תוצאות עיקריות
- טיפול יעיל ברשתות TEM בבידוד ביולוגי.
- יישום מוצלח לדגימות ויראליות שונות.
- פוטנציאל לשימוש רחב יותר בחקירות ננו-חלקיקים.
- חוויות משתמש משופרת עם כמוסת העיבוד.
מסקנות
- שיטה זו משפרת את חקר הנגיפים בסביבות מאובטחות.
- היא מספקת פתרון מעשי לחוקרים בתחום הוירולוגיה.
- יתכן והכשרה נוספת נדרשת לשימוש אופטימלי.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Handling electron microscopy grids in high-containment laboratories presents significant operational challenges due to environmental turbulence and restricted dexterity from personal protective equipment. This capsule-based method improves sample preparation reliability and throughput for virology discovery workflows in BSL-3 and BSL-4 settings. By minimizing manual grid manipulation, the technique supports consistent ultrastructural characterization of viral targets, enabling more confident go/no-go decisions in early-stage antiviral target validation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables morphological interrogation of viral targets to confirm structural integrity and support hypothesis-driven target selection.
- Operational Value: Reduces grid handling errors in biocontainment, improving data quality for downstream target de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, high-contrast TEM specimens suitable for quantitative morphology assessment in screening cascades.
- Operational Value: Streamlines sample preparation for nanoparticle and macromolecule analysis, increasing assay readiness and reproducibility.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports translational continuity by providing reliable ultrastructural data from discovery through preclinical evaluation of viral candidates.
- Operational Value: Facilitates cross-functional collaboration between virology, microscopy, and toxicology teams through standardized, transferable sample preparation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling reliable negative staining of viral samples after inactivation and prior to imaging, supporting hypothesis testing and lead confirmation stages.
- Discovery Biology: Supports viral target validation by providing clear ultrastructural readouts that help clarify morphology and inform mechanistic understanding.
- Screening: Enhances assay standardization by producing consistent, artifact-minimized TEM grids for comparative analysis across conditions.
- Analytics: Generates quantitative morphometric outputs (e.g., particle size, shape, surface features) that enable objective comparison of viral variants or treatment effects.
- Translational Research: Ensures sample preparation continuity from BSL-3/4 discovery to BSL-2 imaging, maintaining data integrity across containment levels.
- Enterprise Reuse: Functions as a platform capability applicable to diverse specimens including viruses, nanoparticles, and macromolecules, maximizing infrastructure utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence in target validation by reducing variability in ultrastructural data acquisition.
- Operational Value: Increases reproducibility and scalability of TEM workflows in high-containment environments through encapsulated grid handling.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by minimizing false negatives from grid damage or staining inconsistency.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of viral targets based on reliable structural data, reducing late-stage attrition due to unexpected morphology.
Implementation Considerations
- Requires training in aseptic grid loading and unloading to prevent capsule or grid damage.
- Dependent on access to TEM-compatible capsules, pipettes, and biocontainment-approved reagents (glutaraldehyde, stains, osmium tetroxide).
- Necessitates standardized timing and orientation protocols across users to ensure uniform staining and washing.
- Requires adaptation of wash and staining times based on specimen density and contaminant load.
- Limited by the need for post-staining decontamination and transfer protocols to move samples from BSL-3/4 to BSL-2 imaging facilities.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:08
Experiment Preparation in a BSL-2 Environment Prior to Working with the Virus Samples (Biocontainment Procedures were Filmed in BSL-4 Training Lab)
1:45
The Capsule Method for Negative Staining in Biocontainment Using Aqueous Glutaraldehyde and 1% Osmium Tetroxide Vapor Inactivation
4:24
The Capsule Method for Inactivation in Biocontainment 2% Glutaraldehyde Followed by Negative Staining in BSL-2 Laboratory
5:50
Results: Analyzing the Capsule Method of Negative Staining Viral Samples
7:14
Conclusion
