בידוד ואפיון של החולדה הראשית שסתום תאים ביניים: מודל חדש ללמוד הסתיידות שסתום אבי העורקים

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לבודד תאי ביניים של מסתם חולדה או VICs כדי לחקור את המנגנונים של מחלת מסתם אבי העורקים ההסתיידות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הסתיידות המסתמים, כגון מדוע VICs מסתיידים ומה אנו יכולים כדי למנוע התאים הללו להסתייד. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם הנגישות והפוטנציאל להפוך לקווי תאים למחקרים נוספים.

בצע את כל הניתוחים במכסה מנוע מאוורר שחוטא בעבר באתנול 70% כדי להבטיח סטריליות של דגימות וריאגנטים. יש לעקר כלי חיטוי על ידי חיטוי, ולאחר מכן לטבול את קצות הכלים בכוס המכילה 70% אתנול לפני השימוש. השרו את כלי החיתוך בכוסות של מאגר כביסה לפני שבאים במגע עם החיה או הרקמות.

לאחר השמדת החולדות כמתואר בפרוטוקול הטקסט, הניחו את החיה על לוח חיתוך זכוכית וחטאו את העור על ידי ריסוס באתנול 70%. כדי לנתח את הלב, בצע חתך של ארבעה סנטימטרים בקו האמצע של החולדה בעזרת מספריים לדיסקציה כדי לחשוף את חלל הבטן, והסר בזהירות את כלוב הצלעות והריאות כדי לחשוף את הלב. הסר את הלב בעזרת מספריים חדים.

אחסן את הלב המנותח במאגר כביסה קר כקרח עד להשלמת כל הנתיחות הגסות של החולדות. כדי לנתח כל לב, העבירו את הלב המנותח לצלחת פטרי מכוסה במאגר כביסה. חתוך את שריר הלב עם זוג מספריים ישרים קפיציים כדי להיות שמאלה עם אזור קטן המקיף את אבי העורקים העולה ושורש אבי העורקים.

בעזרת אותם מספריים ישרים קפיציים, חתכו בזהירות את אבי העורקים העולה לכיוון החדר השמאלי וחשפו את עלוני המסתם האאורטלי. לאחר מכן, העבירו את אבי העורקים הפתוח לצלחת פטרי סטרילית טרייה במילוי תמיסת המלח המאוזנת של האנק. נתח את עלוני המסתם האאורטלי המסומנים בצורת ה-U הייחודית שלהם בבסיס אבי העורקים בעזרת מספריים של Vannas.

אחסן את כל העלונים במיליליטר אחד של מאגר כביסה קר כקרח בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר עד להשלמת כל הניתוחים. לאחר שנקטפו כל העלונים, צנטריפוגה אותם ב-100 גרם למשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר את מאגר הכביסה. כדי להסיר את תאי האנדותל של השסתום או VECs, עכל את העלונים ב-100 מיקרוליטר של 425 יחידות למיליליטר של קולגנאז II למשך חמש דקות ב-37 מעלות צלזיוס.

לשבש את העיכול על ידי פיפטינג בעדינות למעלה ולמטה באמצעות קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר. צנטריפוגה ב-100 גרם למשך 30 שניות לכדור העלונים. לאחר השלכת הסופרנטנט בזהירות, שטפו את העלונים עם 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה וגלולה מחדש את התאים על ידי צנטריפוגה ב-100 גרם למשך 30 שניות.

כדי לקצור את ה-VICs מהעלים, עכל עם 100 מיקרוליטר של קולגנאז II במשך 1.5 עד שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן שחרר את ה-VICs על ידי פיפטינג בעדינות למעלה ולמטה באמצעות קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר. יש לדלל את הקולגנאז II ב-19 מיליליטר של מדיום תרבית וצנטריפוגה ב-670 גרם למשך חמש דקות כדי לזרוק את ה-VICs ואת שאריות עלוני השסתום.

לאחר השלכת הסופרנטנט, העבירו את העלונים ואת ה-VICs לצלחות תרבית או צלוחות. תרבית את ה-VICs במשך חמישה עד שבעה ימים במדיום תרבית עד שמגיעים למפגש של 37 מעלות צלזיוס בנוכחות 5% CO2, ומחליפים את המדיום לאחר 72 שעות. כדי להכין VICs ראשוניים של חולדות לניסויי הסתיידות במבחנה, זרעו את התאים בצפיפות של 150,000 תאים לבאר בצלחות של שש בארות.

שמור על התאים במדיום תרבית עד למפגש של יותר מ -90%. טפלו ב-VICs עם הסתיידות לעומת מדיום ביקורת ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס בנוכחות 5% CO2 למשך 72 שעות נוספות. כדי לחקור את ה-VICs הראשוניים של החולדות המסויידות לניתוחים הבאים במורד הזרם, הסר את אמצעי ההסתיידות או הבקרה.

שטפו את החד-שכבות עם מאגר כביסה כדי להסיר יוני סידן ופוספט שאינם קשורים לפני ביצוע אפיון VIC של חולדה כמפורט בפרוטוקול הטקסט. למחקרי הסתיידות VIC של חולדות, יש לצבוע את שכבות התאים בתמיסת 5% Alizarin Red S, תוך נדנדה עדינה על שייקר למשך 20 דקות. לאחר מכן, יש לשטוף שלוש פעמים במים מזוקקים למשך חמש דקות בכל פעם.

כדי לכמת את שקיעת הסידן, השתמש בערכת בדיקת סידן ביוכימית. יוני סידן עלוקה באמצעות חומצה הידרוכלורית 0.6 מולרית למשך 24 שעות בארבע מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה. קצרו את הסופרנטנט ומדדו את ריכוז הסידן באמצעות ערכת בדיקת סידן בהתאם להנחיות היצרן.

לבסוף, חשב את ריכוז הסידן כשבריר מסך החלבון התאי כמתואר בפרוטוקול הטקסט. פנוטיפ VIC של תאים מבודדים אושר באמצעות אימונופלואורסצנטיות, חיפוש אחר סמני VIC, וימנטין ואקטין שריר חלק אלפא. בנוסף, הביטוי של מווסת הגדילה VIC, גורם גדילת רקמות בטא-1 ו-2, אושר באמצעות ניתוח PCR.

ניתוח כתמים מערביים בוצע גם כדי לוודא ש-VICs של חולדות היו שליליים לסמן תאי האנדותל CD 31, תוך שימוש ב-VECs מיטרליים של כלבים כביקורת חיובית. חולדות VICs נחשפו לרמות גבוהות של סידן ופוספט, המחקים מצבים פתולוגיים של היפרקלצמיה והיפרפוספטמיה. טיפול ב-VICs עם הסתיידות הנגרמת על ידי סידן ופוספט, כפי שנקבע על ידי צביעת אליזרין אדום לשקיעת סידן וקביעה קולורימטרית של רמות הסידן לאחר שטיפת חומצה הידרוכלורית.

טיפול ב-VICs עם סידן ופוספט גרם לעלייה משמעותית בביטוי ה-mRNA של הסמנים האוסטיאוגניים MSX2, ALPL ו-PHOSPHO1. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעה עד שעתיים, למעט העיכול של 18 עלוני שסתומים. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב להקפיד על סטריליות במהלך החיתוך והעיכול.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לבודד VICs ראשוניים של חולדות ולהשתמש בהם כדי לחקור את המנגנונים שמאחורי הסתיידות VIC. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ציטומטריית זרימה וניתוח מיקרוסקופיה על מנת לחקור את הפיזיולוגיה וההתנהגות של VIC. לאחר פיתוחה, טכניקה זו יכולה לסלול את הדרך לחוקרים בתחום מחקר הלב וכלי הדם לחקור את המנגנונים של סיווג מסתמי אבי העורקים בבני אדם באמצעות מודל החולדות.