מי קולחין יזם: זיהוי ואפיון של השורש גולה יזם ספציפי בתוך השעועית נפוצות
23 בדצמבר 2017
ניתוח ביטוי יזם מכריעים לשיפור ההבנה של הכונה וביטוי ייתכן היעד גנים. במסמך זה אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות, לבודד לשבט מקדם הצמח. עוד יותר, אנו מתארים את האפיון של האמרגן גולה ספציפיים שורשים שעירים שעועית נפוצות.
שורשים שעירים משמשים להשגת שורשים שעברו טרנספורמציה ב-Phaseolus עם מבנה מדווח. השורשים הטרנסגניים המתקבלים משמשים לבחינת ביטוי הגן המדווח. מחקרי ביטוי מקדמים הם חיוניים להבנת דפוסי הביטוי המרחבי-זמני של גנים.
היום אנו הולכים להדגים את המתודולוגיות לאינדוקציה של שורש שעיר ולחקור דפוסי ביטוי מקדמים בשורשים שעירים טרנסגניים בתנאים סימביוטיים של גושי שורש ב-Phaseolus. אסטרדה-נברטה ועמיתיו הקימו בעבר מערכת שורשים שעירה המושרה על ידי Agrobacterium rhizogenes ב-Phaseolus. השיטה הנוכחית תסייע להאיץ את משך השראת השורש השעיר ובכך לשפר את הרבגוניות של המערכת.
ידגימו את הנהלים עמיתי מנוג'-קומאר ארתיקלה והסטודנטיות לתואר ראשון אלמה לטיסיה וברנדה מריאנה מהמעבדה שלי. ראשית, חפש את רצף הגן NIN במסד הנתונים של הגנום Phaseolus vulgaris מ-Phytozome, ובחר את אורך הרצף הנדרש במעלה הזרם ל-ATG. תכנן את האוליגונוקלאוטידים בעקבות ניתוח רצף המקדם המתאים.
DNA גנומי טרי של Phaseolus ישמש כתבנית להגברת רצף המקדם PCR. הכן את תערובת המאסטר PCR עם פולימראז Taq בנאמנות גבוהה ורכיבי PCR סטנדרטיים, יחד עם האוליגונוקלאוטידים שתוכננו מראש. יש לערבב את המאסטר לצינורות PCR של 2 מ"ל, ולבצע את הגברת שבר המקדם בתרמו-סייקלר ועם תוכנית מתאימה.
הפרד את מוצר ה-PCR באופן אלקטרופורטי על ג'ל אגרוז 1.2%. דמיין את שבר ה-NIN המוגבר ב-700 זוגות בסיסים תחת תאורת UV. בלו, הוצא ושכפל את השבר לתוך וקטור הכניסה של Gateway pENTR/D-TOPO בהתאם להוראות הסטנדרטיות.
הפוך שני מיקרוליטרים מתערובת התגובה לתאי E.coli מוכשרים ב-42 מעלות צלזיוס למשך 50 שניות, וצלחת את ה-E.coli המותמר על LB בתוספת 50 מיליגרם לליטר קנמיצין. גדל את התאים המצופים ב -37 מעלות צלזיוס בן לילה. בצע תגובת PCR עבור פלסמידים שבודדו ממושבות E.coli שנבחרו באקראי באמצעות אוליגונוקלאוטידים M13.
השבר ב-1024 זוגות בסיסים אמור להצביע על שיבוטים חיוביים. בצע את תגובת ה-LR בין שיבוט הכניסה החיובית לווקטור הבינארי של היעד. הפוך שני מיקרוליטרים של תערובת תגובה ל-E.coli, ובחר את המושבות על 100 מיליגרם לליטר ספקטינומיצין ב-37 מעלות צלזיוס.
הגביר את הפלסמידים עם אוליגונוקלאוטידים ספציפיים ל-NIN. השיבוט החיובי אמור להתגבר ב-700 זוגות בסיסים. רצף וודא את נכונות שבר השיבוט.
גייס את מבנה מקדם ה-NIN לתאי K599 Agrobacterium rhizogenes בעלי יכולת חשמלית. ושוב, אשר את השיבוט עם אוליגונוקלאוטידים ספציפיים למקדם. גופרית מעקרת זרעי Phaseolus vulgaris ונובטת על ניירות סינון סטריליים ורטובים למשך יומיים בחושך בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס.
מורחים 150 מיקרוליטר של תאי Agrobacterium rhizogenes עם וקטור בנייה ובקרה של NIN על לוחות LB עם בחירת ספקטינומיצין. גדל את התרבות בן לילה ב -28 מעלות צלזיוס. הסר שתילי Phaseolus, וגרד תאי Agrobacterium rhizogenes עם קצה כפוף של 200 מיקרוליטר מהצלחת.
ולהשעות מחדש לתוך צינור אפנדורף עם מ"ל מים סטריליים ומזוקקים. אסוף תאי Agrobacterium rhizogenes למזרק של שלושה מ"ל, והנח שתילי Phaseolus במערך צינור שהוכן בעבר. דוקרים מעט את ההיפוקוטיל של זרעים מונבטים עם קצה המחט, ובו זמנית מזריקים את תאי Agrobacterium rhizogenes.
יש להקפיד שהמחט לא תעבור דרך ההיפוקוטיל. שמור את השתילים המוזרקים בתא גידול בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס עם 16 שעות אור ושמונה שעות אור חשוך. יבלות על ההיפוקוטיל הפצוע אמורות להיות גלויות בחמישה עד שבעה ימים.
לאחר שבועיים, הסר את השורש הראשוני על ידי חיתוך הגבעול שני סנטימטרים מתחת לשורשים השעירים, והשתיל אותם בעציצים המכילים ורמיקוליט סטרילי. במקביל, חסנו את הצמחים במ"ל אחד של Rhizobium tropici כדי לגרום לקשריות. הקפד לדלל את תרבית הריזוביום ל-6 ב-OD 600.
שמור את הצמחים בתא גידול בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס, 16 שעות אור ושמונה שעות אור חשוך, והשקה בתמיסת B ו-D. כדי לחקור דפוסי ביטוי מרחביים-זמניים של מקדם NIN, הדגימה נעשית בנקודות זמן שונות. מוציאים את הצמחים מבלי לפגוע בשורשים, ושוטפים את השורשים ללא כתמי ורמיקוליט.
בחר באופן אקראי את השורשים מ-NIN ובקרה, והמשך לצביעה היסטוכימית של GUS על ידי דגירה של הדגימות במאגר בדיקת GUS ב-37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות בחושך. התבונן בשורשים המוכתמים ב-GUS תחת מיקרוסקופ סטריאו ותרכובת. תמונה זו מציגה את ביטוי מקדם ה-NIN המושרה על ידי ריזוביום בשורשים הראשוניים.
ניתן היה לראות ביטוי מקדם NIN גם בתאי שיער שורש נגועים בריזוביום. יתר על כן, ניתן לתעד את ביטוי ה-GUS בשלבים שונים של התפתחות גושי השורש. לא נראה ביטוי GUS בשורשי בקרת וקטור.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה של עיצוב מבני המקדם שלך ולימוד דפוסי ביטוי המקדם בשורשים שעירים טרנסגניים של Phaseolus. ניתן להרחיב את המערכת הזו עוד יותר כדי לחקור את דפוסי הביטוי של המקדם תחת אינטראקציות סימביוטיות ופתוגנים אחרות ב-Phaseolus וגם באודיקוטים אחרים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לזיהוי, בידוד ושבט של פרומוטורים בצמחים, תוך התמקדות באפיון של פרומוטור ספציפי לקשרי שורשים (nodules) בשורשים שיערתיים של שעועית נפוצה. מוצגות המתודולוגיות להשראת שורשים שיערתיים ולבחינת דפוסי ביטוי של פרומוטורים בשורשים שיערתיים טרנסגניים.
מרכיבי מפתח במחקר
תחום המדע
- בקרה גנטית
- ביולוגיה של הצמחים
- מערכות טרנסגניות
רקע
- ניתוחי ביטוי של פרומוטורים חיוניים להבנת הבקרה הגנטית.
- שורשים שיעריים משמשים כמודל לחקר ביטוי גנים בצמחים.
- משתמשים ב-*Agrobacterium rhizogenes* כדי להשרות שורשים שיעריים ב-*Phaseolus*.
- הבנת דפוסי ביטוי מרחביים-זמניים היא חיונית למחקרי התפתחות צמחים.
מטרת המחקר
- לשיפור מתודולוגיות להשראה של שורשים שיערניים (hairy roots).
- להקל על חקר ביטוי פרומוטורים בשורשים טרנסגניים.
- לאפיין פרומוטורים ספציפיים לקשריים בשעועית נפוצה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- השראה של שורשים שיעריים באמצעות Agrobacterium rhizogenes.
- טרנספורמציה של שורשים עם מבני דוח (reporter constructs).
- ניתוח דפוסי ביטוי של פרומוטורים בתנאי סימביוזה.
- שיבוט ואפיון של פרומוטורים צמחיים.
תוצאות עיקריות
- השראה מוצלחת של שורשים שיערים טרנסגניים.
- ביסוס מערכת חסונה לחקר ביטוי גנים.
- אפיון של פרומוטור ספציפי לקשרי שורשים (nodules) בשעועית נפוצה.
- הדגמה של מתודולוגיות משופרות להשראת שורשים שיערים.
מסקנות
- הפרוטוקול משפר את ההבנה של בקרה גנטית בצמחים.
- הוא מספק כלי בעל ערך לחוקרים הלומדים על פרומוטורים של צמחים.
- מחקרים עתידיים יכולים להסתמך על מתודולוגיות אלו לצורך יישומים רחבים יותר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
ניתוח מדויק של פרומוטורים במערכות צמחים מאפשר מחקרי ביטוי גנים ממוקדים, התומכים בפיתוח של מודלים טרנסגניים חסונים לגילוי ותיקוף של תכונות. פרוטוקול טרנספורמציה מהיר וניתן לשחזור של שורשים שיערתיים ב-Phaseolus vulgaris מספק פלטפורמה ניתנת להרחבה לניתוח ויסות גנים בסימביוזה של קשרי שורשים. יכולת זו מחזקת את תהליכי הגילוי המוקדמים על ידי אפשור גנומיקה פונקציונלית ובחינת מסלולים בקטניות רלוונטיות מבחינה חקלאית.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מקל על תיקוף פונקציונלי של אלמנטים ויסותיים של גנים בסביבת שורשים מבוקרת.
- מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית על ידי הבהרת דפוסי ביטוי המונחים על ידי פרומוטורים במהלך אינטראקציות סימביוטיות.
- תומך בביטחון חיזוי בבחירת גנים מטרה להנדסת תכונות בהמשך התהליך.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מספק מערכת מתוקפת לבדיקות רפורטר כמותיות בשורשים שיערים טרנסגניים.
- מאפשר הערכה הדירה של פעילות פרומוטור לאורך שלבים התפתחותיים ותנאים שונים.
- תומך בסטנדרטיזציה של בדיקות ביטוי גנים לצורך ניתוח השוואתי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את פעילות הפרומוטור לאירועי התקינה (nodulation) בעלי רלוונטיות פיזיולוגית בקטניות.
- מאפשר רציפות משלב גילוי הגנים ועד לתיקוף התכונה בקווי תהליך לשיפור גידולים חקלאיים.
- תומך בזיהוי ביו-מרקרים תרגומיים לפיתוח קשרי שורשים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
פרוטוקול זה לניתוח פרומוטורים משולב ברצף הגילוי, החל מזיהוי גנים ועד לתיקוף תפקודי והנדסת תכונות בביוטכנולוגיה של צמחים.
- ביולוגיה של הגילוי: מאפשרת בדיקת השערות לגבי ויסות גנים וספציפיות של פרומוטורים בתהליך יצירת קשרי שורשים (nodulation).
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור של ביטוי רפורטר המונע על ידי פרומוטור.
- אנליטיקה: תומכת בהשוואה סטטיסטית של פעילות פרומוטורים תחת תנאים סימביוטיים מוגדרים.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים לבין תיקוף פרה-קליני של תכונות בקטניות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה מודולרית הניתנת להתאמה לפרומוטורים ולמיני צמחים אחרים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתפקוד הגנים ובבקרה הרגולטורית.
- ערך תפעולי: מספק זרימת עבודה מהירה וסטנדרטית לטרנספורמציה ולבדיקה.
- ערך אסטרטגי: מפחית עמימות ביולוגית ומאיץ החלטות go/no-go בקווי ייצור של תכונות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות גנים לשיפור יבולים בהתאם לסיכון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בשבטיקה מולקולרית, טרנספורמציה של צמחים ובדיקות גנים דגליים (reporter gene assays).
- נדרשת גישה לתאי גידול לצמחים, עבודה בטכניקה סטרילית ומערכות דימוי פלואורסצנטיות או היסטוכימיות.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין צוותים כדי להבטיח מדידות הדירות של פעילות הפרומוטור.
- ניתן להתאימו למינים אחרים של דו-פסיינים (eudicots) באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- מוגבל לביטוי בשורשים ובהקשרים סימביוטיים כפי שמתואר.
שאלות נפוצות בביו-פארמה
Chapters in this video
0:00
Title
1:03
Identification, Isolation, and Cloning of Phaseolus vulgaris NIN Promoter
5:11
Agrobacterium rhizogenes Transformed Hairy Roots of Phaseolus vulgaris
9:44
Results: NIN Promoter Expression in Root Nodules of Phaseolus vulgaris
10:21
Conclusion
