שחזור תלת מימדי של הארכיטקטורה כלי הדם של השחלה העכבר בהירות-והפנים פסיבי
10 בדצמבר 2017
כאן אנו מציגים עיבוד של בהירות פסיבי, שיטת שחזור תלת-ממד עבור ויזואליזציה של השחלות להערכת, נימים הזקיקים השחלות העכבר ללא פגע.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק תצוגה תלת מימדית מלאה של התפלגות הנימים בזקיקי השחלות של העכבר ולהראות את הקשרים ביניהם. השחלה היא איבר חיוני ברבייה ובאנדוקרינולוגיה. ספרו כל שלב התפתחותי שונה של הזקיק והתאים הסומטיים.
בנוסף, בניגוד לאיברים אחרים, השחלה אינה מראה הסתעפות חוזרת ונשנית של היחידה התפקודית. מערכת כלי הדם המקומית עשויה להיות יחד עם מערכת העצבים מסוגלת גם לעבור שינויים גדולים בכל מחזור חודשי אצל נקבות בוגרות. יישום הבהירות הפסיבית בשחלה מאפשר לנו לראות את ההתפלגות הכוללת ואת הקשר בין אותם תאים וזקיקים בשחלה.
המפתח הגדול ביותר של מדד זה הוא שיש לו את ההשפעה הנמוכה ביותר על השחלה, ומסביר את ניקוי הסמנים השונים. באמצעות שחזור התמונה המיקרוסקופית סיפקנו מפה של השחלה. ניתן לראות בבירור כמה פרטים של כלי הדם, הנוירונים והזקיקים.
לניתוח תמונה, נעשה שימוש בכמה אפשרויות של אימאריס כדי להעריך את הקשרים בין השחלה למבנים. הכינו פתרונות שפע על פי הוראות המאמר ושמרו אותם על קרח. הרדמו את העכברים וודאו שלעכבר אין תגובת צביטה בבוהן.
רססו אתנול, בצעו חתך באטריום הימני, ולאחר מכן השליכו מיד את החדר השמאלי ב-20 מ"ל PBS קר כקרח במהירות של 10 מ"ל לדקה כדי לשטוף את הדם. לאחר מכן שופע את החיה בתמיסת הידרוג'ל קרה באותה מהירות. אסוף את השחלות כמו גם את הרחם כדי לשמור על שלמות המורפולוגיה השחלתית.
העבירו את השחלות המופרדות לתמיסת ההידרוג'ל הקרה. תחת מיקרוסקופ סטריאו הסר את רקמות השומן סביב השחלה. לקבלת תוצאה טובה יותר של קיבוע רקמות, אנו ממליצים להסיר את בורסת השחלות.
שמור את השחלות בתמיסת הידרוג'ל למשך שלושה ימים. לאחר שלושה ימים, העבירו את השחלות לתוך צינור זכוכית ומלאו את הצינורית בתמיסת הידרוג'ל טרייה. מתחו את הפרפילם מעל החלק העליון של הצינור ולאחר מכן עטפו פרפילם נוסף סביב צוואר הצינור.
ודא שאין בועות בין הפרפילם לתמיסת ההידרוג'ל. הנח את צינור הזכוכית על אינקובטור שייקר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים עד שנוצר ג'ל. הסר בזהירות את עודפי הג'ל סביב השחלות בעזרת פילטר נייר.
הכניסו את השחלות לשפופרת של 15 מ"ל ומלאו את השפופרת ב-10 מ"ל של תמיסת ניקוי. הנח את הצינור על אינקובטור שייקר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חודשיים לפחות. החלף את תמיסת הניקוי כל יום בשלושת הימים הראשונים ולאחר מכן מדי שבוע עד שהשחלה מתבהרת.
כל הליכי הצביעה החיסונית נעשים ב-37 מעלות צלזיוס על שייקר. ראשית, שטפו את השחלה ב-PBST למשך 24 שעות. שחלת דגירה שנייה בנוגדנים ראשוניים מדוללים על ידי PBST למשך יומיים.
שלישית, שטפו את הנוגדנים העיקריים עם מאגר PBST. רביעית, דגרו על השחלה עם הנוגדן המשני הרצוי ב-PBST למשך יומיים. חמישית, שטפו את הנוגדנים המשניים עם PBST.
שישית, להעביר את השחלה לתמיסת התאמת מקדם שבירה להומוגניזציה של RI. בדוק את השקיפות החזותית, כאשר השחלה הובהר במלואה, ניתן לצלם אותה. ראשית, הכינו צלחת תחתית זכוכית נקייה.
הכינו גליל שפכטל ועצבו אותו לצורת פרסה. לחץ את הקצה החיצוני בחוזקה על מגלשת הזכוכית כדי ליצור חלל אטום. גובה המרק צריך להיות מעט גבוה יותר מהשחלה.
הזיזו את השחלה בזהירות למרכז והוסיפו תמיסת הרכבה. דחפו צלחת מעל המרק והשתמשו בשני חלקי שפכטל כדי לתקן אותה. כאשר השחלה מוכנה לצילום, ניתן לבחור במיקרוסקופ קונפוקלי של ניקון עם עדשת 16X כדי לצלם אותה.
להדמיה עם מיקרוסקופ קונפוקלי, בחר תחילה את העדשה בלוח Ni-E. ברכישת החלונית, בחר את מספר הערוצים. ראשית, השתמש בלשונית יציאת העין ובג'ויסטיק בקר XY כדי להזיז את הרקמה למרכז השדה באמצעות בדיקה באמצעות עיניות מיקרוסקופ.
שנית, לאחר כיבוי נורית התריס, לחץ על לשונית חיה כדי לכוונן את עוצמת הלייזר, HV וההיסט עבור כל ערוץ. בחלונית Z Intensity Correction התאם את הרכישה לשכבה העליונה, לחץ על לחצן הפלוס כדי להגדיר את החלק העליון, הזז את העדשה למטה והגדר את עוצמת ה-HV והלייזר המתאימה לתחתית הרקמה והוסף את נתוני השכבה הנמוכה ביותר לחץ על ND כדי לסנכרן את ההגדרה עם החלונית והרכישה. וברכישה, הגדר תחילה את מספר שלבי הסריקה.
לחץ על הכרטיסיות של Z ותמונה גדולה. שנית, עבור לחלון התמונה הגדולה של הסריקה כדי להגדיר את גודל השדה בהתאם לגבול הרקמה. שלישית, חזור לרכישת ND כדי להזין את גודל שדות הסריקה ולבחור את החפיפה בתוך 10 ו-50% לאחר מכן לחץ על הפעל תיקון Z והמתן לתהליך ההדמיה.
ראשית, השתמש ב-imagic כדי לפתוח את קובץ ה-NIS המקורי. לחץ/י על הכפתור ״תמונה״, בחר/י ערוצי צבע ותצוגה ולאחר מכן לחץ/י על ״קובץ״, בחר/י רצפי תמונות ושמור/י אותם בנפרד כקובצי tiff. שנית, השתמש ב- Imaris כדי לפתוח את אחד מקבצי ה- tiff.
לחץ על כפתור העריכה ובחר את הוסף הערוצים כדי להוסיף את השאר. ניתן לשנות את השם והצבע בהתאמת התצוגה. יש לתקן את עובי הרקמה גם בתכונות התמונה.
שלישית, לחץ על כפתור עריכה ובחר חיתוך תלת מימד כדי לחתוך את החלק הנוסף. ראשית, לחץ על כפתור הנימה ולחץ על הבא. עבור ללוח הפרוסה, מצא כלי מעקב ומרחק, ואז חזור ל-Surpass, הזן את הסטטי ולחץ על הבא.
שנית, התאם את סף נקודת ההתחלה וההגדרה. בחלונית המצלמה, בחר את הבחירה, לחץ על shift ולחץ על הנקודה כדי להסיר את החלק הנוסף. שלישית, בחר את הסף הגבוה ביותר ולחץ על הבא.
אל תבחר בנקודות זיהוי ועבור לשלב הבא. ניתן להסיר חלק עודף בחלונית העריכה. ניתן לערוך את הצבע על ידי לחיצה על הצבע.
ארכיטקטורת תלת מימד של כלי דם בשחלות נחקרה בעקבות צביעה חיסונית CD31. ניתן לראות את המבנה התלת-ממדי על ידי פרוסות דרך פרוסות אחרות או בשלמותו באמצעות עיבוד נפח. CD 31 הוא צביעה של כלי דם זקיקים של עכבר בוגר נעשתה.
באמצעות שחזור הנימים על ידי החוטים, יכולנו להראות קשר בין הזקיקים הבודדים לנימים שלהם. השחלה, כמו אישה, תמיד פעילה וניתנת להחלפה. עם זאת, בשל המגבלה של הניתוח ההיסטולוגי המסורתי, קשה מאוד לתאר את היחסים בין מרכיבים מורכבים כאלה.
השיטה החדשה שפותחה, בהירות פסיבית עשויה לעזור לנו להתגבר על המכשול האופטי, לשמור על שלמות הרקמות השלמות ולספק את הרמזים התפקודיים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
מחקר זה מציג התאמה של שיטת CLARITY הפסיבית להדמיית מערכת כלי הדם השחלתיים והנימים הזקיקיים בשחלות עכבר שלמות. הפרוטוקול נועד לספק תצוגה תלת-ממדית מקיפה של חלוקת הנימים בתוך זקיקי השחלה.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה רבייה
- ביולוגיה של כלי דם
רקע
- לשחלה יש תפקיד מכריע ברבייה ובדוקרינולוגיה.
- הזקיקים עוברים שלבים התפתחותיים שונים, כל אחד עם תאי גוף מובחנים.
- בניגוד לאיברים אחרים, השחלה אינה מציגה הסתעפות חוזרת של יחידות תפקודיות.
- מערכת כלי הדם בשחלה יכולה להשתנות משמעותית במהלך כל מחזור הווסת.
מטרת המחקר
- להדמיה של התפלגות הנימים הכוללת בזקיקי השחלה של עכברים.
- להמחיש את היחסים בין תאים ובין זקיקים בתוך השחלה.
- להעמיק את ההבנה של הווסקולריזציה השחלתית וההשלכותיה על בריאות הרבייה.
שיטות בשימוש
- יישום של טכניקת CLARITY פסיבית.
- שיקום תלת-ממדי של כלי הדם השחלתיים.
- הדמיה של נימים זקיקיים בשחלות עכבר שלמות.
- ספירת שלבי התפתחות שונים של זקיקים ותאי גוף.
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של רשתות נימיות בזקיקי השחלה.
- מיפוי מפורט של חיבורים וסקולריים בין זקיקים.
- תובנות לגבי השינויים הדינמיים במערכת כלי הדם השחלתית.
- ביסוס מסגרת למחקרים עתידיים על ביולוגיה של השחלה.
מסקנות
- שיטת CLARITY הפסיבית מגלה ביעילות את הארכיטקטורה הוסקולרית השחלתית.
- גישה זו יכולה לקדם את הבנתנו את התפקוד והבריאות השחלתיים.
- מחקר עתידי יכול לבנות על ממצאים אלו כדי לחקור את האנדוקרינולוגיה הרבייה.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Visualizing intact ovarian vasculature in 3D enables mechanistic de-risking of reproductive target hypotheses by clarifying structural relationships between follicles and their capillary networks. This approach supports predictive confidence in early discovery by providing quantitative, reproducible readouts of vascular architecture that can inform target validation and phenotypic screening workflows. The method addresses a key discovery-stage challenge: linking anatomical context to functional ovarian biology without tissue distortion.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping follicular capillary length to follicular wall volume, supporting functional target validation.
- Operational Value: Provides a standardized, shrinkage-minimized clearing protocol that preserves tissue integrity for reproducible vascular analysis.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking through quantitative correlation data (P<0.01) between capillary extent and follicular development.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated 3D vascular maps that serve as disease-relevant systems for assessing compound effects on ovarian microstructure.
- Operational Value: Enables assay standardization via consistent immunostaining (CD31), clearing, and imaging parameters across follicles.
- Scalability: Supports platform reuse through adaptable clearing and reconstruction workflows applicable to other endocrine tissues.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links discovery-stage vascular phenotypes to preclinical models by preserving native ovarian architecture for longitudinal study.
- Mechanistic De-risking: Clarifies neurovascular interactions in the ovary, reducing ambiguity in endocrine target pathways.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides structural biomarkers (e.g., capillary length, follicular volume) to inform go/no-go decisions in follicle-modulating programs.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling hypothesis-driven analysis of vascular contributions to follicle maturation, supporting lead identification through phenotypic vascular profiling, and informing preclinical validation via intact tissue phenotyping.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of vascular regulators in follicle development through direct 3D visualization of capillary networks.
- Screening: Delivers assay-ready, cleared ovarian tissue with quantitative vascular outputs for compound screening campaigns.
- Analytics: Provides morphometric measurements (capillary length, follicular volume) and correlation statistics to enable comparative condition analysis.
- Translational Research: Maintains histological fidelity from discovery through preclinical stages by avoiding tissue sectioning artifacts.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable vascular mapping capability for endocrine and reproductive tissue atlases across discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing mechanistic ambiguity in ovarian vascular biology.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across labs via passive CLARITY’s minimal tissue perturbation.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of vascular-related follicle phenotypes, reducing late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on vascular-structural phenotypes in follicle cohorts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hydrogel-based tissue clearing, immunostaining, and multiphoton confocal microscopy.
- Depends on specialized instrumentation including shaker incubators, refractive index matching systems, and 3D reconstruction software (e.g., Imaris).
- Necessitates cross-team standardization of clearing duration, antibody validation, and imaging parameters for reproducible vascular quantification.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to non-ovarian tissues due to differences in density and lipid content.
- Limited by extended clearing timelines (up to two months) and the need for optimized antibody penetration in dense stromal regions.
