Name: קביעת אזור שרירים חתך הרוחב אופטי שרירי תעופה עקיף למבוגרים דרוזופילה Melanogaster (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: למדו שיטה לכימות שטח שרירים ב-Drosophila melanogaster כמדד עקיף למסת שריר. השיטה מיושמת על שרירי תעופה עקיפים במודל של דיסטרופיה מיוטונית לחקר ניוון שרירים ופתולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצה להודות חברי קבוצה גנומיקה Translational ו קתרין J הנסון עבור ההזנה-הגב ושיפורים על פרוטוקול זה. הפרויקט בוצע עם מענק מחקר SAF2015-64500-R, הכולל האירופית קרנות לפיתוח אזורי, מוענק R.A מאת y Ministerio דה Economia Competitividad.

1. קיבוע והטבעה שרף
<ol><li>עזים ומתנגד הזבובים עם פחמן דו-חמצני (CO2) או באמצעות היפותרמיה באמצעות של בלוק קרח. השתמש ויבתר מיקרוסקופ (עם הגדלה נמוכה כדי לראות את הזבוב שלם) מספריים כדי להסיר את הרגליים, כנפיים, הראש והחלק מסוף של הבטן כדי להקל על חדירת מקבע. טיפול זהיר הגוויות נדרש בשלב זה להימנע להרכב של בית החזה. הערה: להתחיל עם זבובים לפחות 12 לכל גנוטיפ כדי להבטיח מספר מספיק של אנשים מעובד כראוי בסופו של ההליך.</li>
	<li>להעביר את הגוויות צינור 1.5 מ ב- µL 200 המכילה קרח (הצבת מספר מרבי של יחידים 6 למחזור) של פתרון 1. הערה: הגוויות לא נשארים בתמיסה 1 עבור יותר מ- 20 דקות.<ol>
<li>עבור פתרון 1, לערבב מרכיבים אלה הפרופורציות נפח: ¼ paraformaldehyde 4%, 8% ¼ גלוטראלדהיד, ¼ 0.2 מ' נה2HPO4 ו- ¼ 0.2 מ' NaH2PO4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להוסיף 200 µL של פתרון 2, דגירה על קרח למשך 30 דקות.<ol>
<li>פתרון 2: לערבב פתרון 1 OsO4 ביחס 1:1 (v/v). התראה: OsO4 רעיל מאוד. להפעלתו בשכונה fume אמצעי בטיחות וסילוק המתאים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הסר את כל הנוזל. להוסיף 200 µL של פתרון 2, דגירה על קרח במשך 1-2 h.</li>
	<li>הסר את הפתרון, מייבשים את הדגימות דרך סדרה מדורגת אתנול כדלקמן: פעם אחת ב- 30%, 50%, 70%, 90% ופעמיים בתוך אתנול מוחלט; 5 דקות כל אחד. להוסיף 1 מ"ל אתנול כדי לכסות את הדגימות. הערה: לאחר הרקמה ממוקמת 90% אתנול, והשלבים הבאים יכול להתבצע בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>דגירה הדגימות פעמיים בפרופילן אוקסיד 10 דקות כל הדגירה. התראה: פרופילן אוקסיד רעיל, להשתמש בו בשכונה fume.</li>
	<li>להחליף את תחמוצת פרופילן על ידי תערובת 1:1 (v/v) של אפוקסי שרף, פרופילן אוקסיד, דגירה בטמפרטורת החדר למשך הלילה. התראה: השרף רעיל מאד במצב נוזלי. השרף זמין כערכה של ארבעה מרכיבים (A, B, C ו- D).<ol>
<li>שרף אפוקסי, להוסיף בתוך חד פעמיות 54 גר' שרף (א), 44.5 גר' במינראליים (B), 2.5 g של האצה (ג), 10 גרם של מרכך ומגמיש (ד). לשלב את כל המרכיבים שרף בשכונה fume. לאחסן השרף aliquots ב-20 ° C (עבור עד 6 חודשים) או ב- 80 ° C (מספר שנים).</li>
		<li>כדי למחוק את השרף, אופים אותו ב- 70 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה כי שרף מוצק אינה רעילה. למחוק את כל הפתרונות הקודמים בקבוצה מתכות כבדות על פי הנהלים הבינלאומיים המתאימים, מכיוון פתרונות יכולים להכיל עקבות OsO4.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>החלף את התערובת הקודמת 100% שרף, דגירה בדגימות במשך 4 שעות.</li>
	<li>להעביר את הגוויות תבניות פלסטיק המכילים שרף חדש (אחד קארקאס היטב כל התבנית). השתמש מקל עץ מחודדים או מחט כדי להעביר, אוריינט את הגוויות ב הבארות ולהשאיר לשרף פולימריזציה במשך הלילה בתנור פסטר-70 מעלות צלזיוס. הערה: כדי להבטיח כיוון המתאים הגוויות זמירה האחורי ואת חלוקתה, הגוויות צריך לשכב בצד הארוך שלהם, עם החלק הקדמי של הגופה מאוד קרוב לקצה הטוב.</li>
</ol>2. קיצוץ ואת חלוקתה של בלוקים
<ol><li>הסר את גושי שרף polymerized התבניות. השתמש סכיני לקיטום השרף, צורה הבסיסי המקיף את הגווייה, נכנע הכיוון המתאים האזמל הקטן. התחל חלוקתה את כל הגוויות לאחר התפר רוחבי כדי להשיג תוצאות דומות. הערה: הסעיף חייב להיות בניצב לציר anteroposterior DLMs כדי לקצץ את הדגימה כראוי ( איור 3).</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig3.jpg"> איור 3 . קטעים dorsoventral של שרף-מוטבע thoraces למבוגרים של ניוון חולים Myotonic מודל זבובים. ב- (א), הגזם המדגם לא היתה נכונה, היות הסעיף בחלקו הגבי-השמאלי של התמונה לא היה לגמרי ואלכסוני לשרירים. כתוצאה מכך, שלוש שריר חבילות בצד ימין עליון נראה גדול יותר מאשר אלה של צד שמאל. טעות זו תגרום הערכה מופרזת של אזור שרירים. (ב) סעיף ממאגר שרף החתוך כראוי. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר.
<ol><li>לחתוך קטעים עבה עם ultramicrotome 1.5-מיקרומטר, להעביר את המקטעים לתוך טיפות מים על שקופיות gelatinized.<ol>
<li>השג את הסעיפים קטע mesothorax על כל הדגימות להשיג תוצאות דומות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מקם את השקופיות המכיל את המקטעים על בלוק חימום ב 70-80 ° C עד H2O מתאדה. בשלב זה, ניתן לצפות את הדגימות עם הניגוד4 OsO (איור 4A).</li>
</ol>3. צביעת חלקים IFM
<ol><li>לכסות את הסעיפים עם מספיק טולדין כחול כ 30 s על הבלוק חימום.<ol>
<li>הפתרון טולדין כחול, להמיס 1% של טולדין כחול ל- 1% של בורקס H2O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשטוף עם H2O ולהשאיר את השקופיות צלחת חמה מתמוססות במים. חזור על ההכתמה עם טולדין כחול אם הניגוד צריך להיות משופרת (איור 4B).</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig4.jpg"> איור 4 . קטעים dorsoventral של שרף-מוטבע thoraces למבוגרים עם ניגודיות שונה stainings. בשתי החלוניות מראים תמונות של זבובים דגם DM1 נמאס Abp1 כמו איור דו-ממדי. (א) תמונה של מקטע עם הניגוד4 OsO. (ב) סעיף מוכתם טולדין כחול מאפשר הדמיה טובה יותר של חבילות שריר. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר.
4. התגברות IFM מקטעים
<ol><li>יבש את השקופיות עם הרחוב חימום עד H2O מתאדה.</li>
	<li>לשים טיפות 1 או 2 של הרכבה בינונית על הסעיפים ולהניח על coverslip. התראה: לבצע שלב זה בשכונה fume כי המדיום הרכבה הוא רעיל.</li>
</ol>5. רכישת תמונות, כימות של שרירים באזור
<ol><li>קח את התמונות בהגדלה נמוכה כך כל קבוצת שרירים DLM נמצא בפוקוס. אנו משתמשים בדרך כלל 10 X.<ol>
<li>לשם ניתוח סטטיסטי לקחת לפחות 5 תמונות טורי לכל זבוב ולנתח זבובים לפחות 5 לכל קבוצה ניסיונית.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בחר את התמונה המכיל את כל השרירים (איור 5A). בדוק את ציר או הכיוון של המקטע ולמחוק את הדגימות עם אוריינטציה לא הולם, אשר לעוות את התוצאות (להשוות דמויות 3A / 3B להבחין בין רע ומקטעים מונחה היטב, בהתאמה).</li>
	<li>להשתמש בתוכנה ImageJ כדי לבחור אזור (בפיקסלים) הכולל רק את DLMs (איור 5A/5B). לשם השוואה בין קבוצות שונות ניסיוני, אזור הפניה כדי לשמש שתמיד יהיה לטוס עם השרירים הגדולים. כל התמונות של אחרים שונים להשוות, בחר אזור הכולל DLMs של ממדים שווים התייחסות לאזור (איור 5B).</li>
	<li>Binarize את התמונות באמצעות הפקודה תמונה-J: תהליך/בינארי/הפוך בינארי ולמחוק את האזורים או פיקסלים שאינן מתאימות לשרירים עניין (איור 5C).<ol>
<li>במקרה artefactual כתמים שחורים מופיעים באזורים שאינם שריר, למחוק אותם באמצעות הפקודה כלי ציור ובחר סמל המחק.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig5.jpg"> איור 5 . תמונה ניתוח נוהל קביעת אזור שרירים. (א) סעיף חציה של חולים Myotonic ניוון שרירים מסוג 1 מודל לטוס החזה עם מלבן המכיל את DLM. (B) האזור שנבחר עם רק טיסה עקיף השרירים של המעי (*). (ג) Binarized תמונה. שחור באזורים תואמים השרירים של עניין. המעי נמחק על כימות מדויק של שרירים באזור. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר.
<ol start="5"><li>לכמת אחוז של פיקסלים על רקמת השריר (פיקסלים שחורים) מתוך סה עם הפקודה: ניתוח/מדידה ולאחר מכן בחרו אפשרות אזור השבר. אחוז זה של האזור הוא הערכת DLM ומסת שרירים כל זבוב.</li>
</ol>

<ol><li>Fernandes, J., Bate, M., Vijayraghavan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+indirect+flight+muscles+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of the indirect flight muscles of Drosophila.</a> Development. 113, 67-77 (1991).</li>
<li>Fernandes, J. J., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+the+dorsal+longitudinal+flight+muscles+%28DLM%29+of+Drosophila%3A+insights+from+the+ablation+of+larval+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Patterning the dorsal longitudinal flight muscles (DLM) of Drosophila: insights from the ablation of larval scaffolds.</a> Development. 122, 3755-3763 (1996).</li>
<li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.sdbonline.org/sites/fly/atlas/00atlas.htm">Atlas of Drosophila Development.</a> Atlas Drosoph. Dev. , 1-57 (1993).</li>
<li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fate+in+the+Drosophila+ommatidium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell fate in the Drosophila ommatidium.</a> Dev. Biol. 123, 264-275 (1987).</li>
<li>Griffith, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmium+Tetroxide+And+Its+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Platin+Met+Rev%22%5BJournal%5D)">Osmium Tetroxide And Its Applications.</a> Platin Met Rev. 18, 94-96 (1974).</li>
<li>Bird, T. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1165/">Myotonic Dystrophy Type 1.</a> GeneReviews. 1, 1-23 (1993).</li>
<li>Bargiela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+autophagy+and+apoptosis+contribute+to+muscle+atrophy+in+a+myotonic+dystrophy+type+1+Drosophila+model%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Increased autophagy and apoptosis contribute to muscle atrophy in a myotonic dystrophy type 1 Drosophila model.</a> Dis Model Mech. 8, 679-690 (2015).</li>
<li>Llamusi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscleblind%2C+BSF+and+TBPH+are+mislocalized+in+the+muscle+sarcomere+of+a+Drosophila+myotonic+dystrophy+model%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model.+Mech%22%5BJournal%5D)">Muscleblind, BSF and TBPH are mislocalized in the muscle sarcomere of a Drosophila myotonic dystrophy model.</a> Dis. Model. Mech. 6, 184-196 (2012).</li>
<li>García-López, A., Llamusí, B., Orzáez, M., Pérez-Payá, E., Artero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+discovery+of+a+peptide+that+prevents+CUG-RNA+hairpin+formation+and+reverses+RNA+toxicity+in+myotonic+dystrophy+models%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo discovery of a peptide that prevents CUG-RNA hairpin formation and reverses RNA toxicity in myotonic dystrophy models.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11866-11871 (2011).</li>
<li>van der Plas, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Dystrophin+is+required+for+integrity+of+the+musculature%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Drosophila Dystrophin is required for integrity of the musculature.</a> Mech. Dev. 124, 617-630 (2007).</li>
<li>Lloyd, T. E., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flightless+flies%3A+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+New+York+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann New York Acad Sci. , 1184(2010).</li>
<li>Babcock, D. T., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+accurate+and+rapid+measurement+of+flight+performance+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An improved method for accurate and rapid measurement of flight performance in Drosophila.</a> J. Vis. Exp. , e51223(2014).</li>
</ol>

שאין ניגודי אינטרסים הכריז.

הוכח כי melanogaster דרוזופילה הוא מודל שימושי ללמוד האנושית מחלות נוירומוסקולריות7,10,11, כולל Dystrophies חולים Myotonic, אשר מאופיינים במראה ניוון שרירים. פרוטוקול המוצג כאן הוא כלי שימושי עבור לכימות ניוון שרירים שנגרם על ידי התפרצות או התקדמות של מחלה מסוימת במודל לעוף. לדוגמה, זה גם אפשרי לעקוב אחר ולכמת את ניוון של סיבי השריר על-ידי ביצוע ניתוח זה בזבובים בגילאים שונים.
יש שלבים קריטיי...

בית החזה של זבוב הפירות מכיל שתי מחלקות שונות של שרירי תעופה, אשר הן מבחינה תפקודית, פיזיולוגית והן מבחינה אנטומית נפרדות. שרירים אלו: השרירים טיסה עקיף (IFM), אשר מורכבים של אורכי-דורסו (DLM) dorso-הגחוני / (DVM) השרירים (איור 1), ואת הטיסה סינכרונית לשלוט בשרירים1,2. השרירים האלה יחד ליצור את הכוח מכני מוגברות הדרושים עבור הטיסה. תפוצה וגודל, הוצאת rostro-סימטרית IFMs מאפשרים התמצאות קלה עבור אופטים ואלכסוני3 (איור 2 א). מסיבה זו, בחרנו את השרירים האלה ללמוד הניוון שרירים melanogaster דרוזופילה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig1.jpg"> איור 1. תרשים של בית החזה של זבוב הפירות מציג השרירים טיסה עקיף סידור (IFMs). (משמאל) מייצג תצוגה לרוחב ו (מימין) מייצג חתך רוחב של בית החזה. IFMs מורכבים של השרירים האורך דורסו (DLM) (באדום), Dorso-הגחוני / (DVM) השרירים (בירוק).
שימור מבנה רקמות והשליטה dorso-הגחוני / ציר הכיוון של מקטעים היסטולוגית הם קריטיים כדי להבטיח הערכה נכונה של שטח חתך הרוחב שריר. כדי לשמר את מבנה השריר שהשתמשנו תערובת קיבוע שונה טומלינסון. et al. 4 . יתר על כן, בגלל שרירי רקמות פנימיות, אטימות של שלד של דרוזופילההוא בעיה קיבוע תערובות לא מצליח לחדור לרקמות היעד. כדי לעקוף בעיה זו, הסרנו בראש לעוף, רגליים, כנפיים, לאחרונה שני מגזרים של הבטן ליצירת חורים אשר איפשר את התערובת קיבוע להיכנס. במסגרת פרוטוקול קיבוע שכללנו טיפול עם אוסמיום ארבע-חמצני (OsO4)5, המשמש בהרחבה בשל יכולתה נתקן שומנים, לרבות טריגליצרידים. OsO4 שומר על רוב המבנים מאוד טוב, במיוחד ברמה cytological, באותו זמן ומספק החדות של התמונה. לאחר קיבוע, דרוזופילה thoraces הוטבעו שרף על חציה למחצה דק אופטים (1.5 מיקרומטר). ' ניגוד ' משופר, רקמות יכול להיות בנוסף מוכתם טולדין כחול. תמונות של thoraces מלאה צולמו ב-10 X, שרירים באזור הייתה לכמת על-ידי binarizing תמונות (של ממדים שווים) וכימות אחוז של פיקסלים על רקמת השריר (פיקסלים שחורים) מתוך סה כ, בעזרת תוכנת ImageJ.
שינויים רקמות קיבוע והכנה תערובות, כמו עליית ריכוז OsO פתרון4 ו גלוטראלדהיד, הציג את פרוטוקול זה, מותר ייחודי שימור רקמת השריר. זה כי הפרוטוקול מונע את ההשפלה ואת דפורמציה של הרקמה, ביצוע ניתוח האחורי של הדגימות אמין יותר גם בתנאים מאוד מנוונת המשויך neuromuscular מחלות ניווניות כגון ניוון חולים Myotonic (DM). בצורתו נפוץ יותר, מיט סוג 1, הפרעה גנטית נדירה זו הוא הביא על ידי חזרה CUG המורחב של תעתיקים ניוון חולים myotonic קינאז (DMPK). מוטציה DMPK RNA אגרגטים מוקדים ribonuclear טופס זה sequester את Muscleblind כמו גרעיני RNA מחייב חלבונים (MBNL1-3; Muscleblind (Mbl) בדרוזופילה)6. יצרנו מודל דרוזופילה של ניוון חולים Myotonic בהבעת 250 חזרה CTG תחת מקדם מכירות שרשרת כבדה שרירים צולבות הקישור חוטים שרירן (Mhc-Gal4). זבובים דגם היו לעוף עם פנוטיפ אופייני 'שנערך למעלה כנפיים' והיו שרירים חמורה להתנוון ב שלהם IFMs (איור 2B). מחקרים קודמים שבוצעו במעבדה שלנו הראו כי קביעת אזור שרירים של IFMs היא שיטה אמינה לכמת את השפעות שונות כימי או גנטי מודיפיקטורי הניוון שרירים אלה זבובים דגם7. לדוגמה, ביטוי של isoform Mbl C בזבובים לבטא את CTG 250 חוזר לשריר, מושגת הצלה של שרירים באזור, כמו דלדול Mbl מאת פחמיות הוא גורם מפעילה DM1 פתוגנזה8 (איור 2C). שרירים באזור חולץ גם לאחר האכלה דגם DM טס עם Abp1, האקסאפאפטיד עם פעילות מוכחת אנטי-DM19 (איור דו-ממדי).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig2.jpg"> באיור 2. כימות של קטעים dorsoventral של שרף-מוטבע thoraces למבוגרים. (י-ם) טיסה עקיף שרירי דרוזופילה melanogaster עם אחרים רלוונטיים המצוין. (א) שליטה זבובים (yw). (ב) ביטוי של 250 ללא קידוד CTG חוזר בשריר (UAS-CTG(250)x) גרמה ירידה של שרירים באזור של DLMs לעומת שליטה זבובים. (ג) זה פנוטיפ ניוון שרירים ניצל ע י ביטוי של Muscleblind (MblC) (UAS-CTG (250) x UAS-MblC) (D) מאכילים את הזבובים דגם עם האקסאפאפטיד Abp1 (UAS-CTG (250) x Abp1). כל התמונות הצד הגבי הוא על העליונה. Transgenes גורשו אל שריר באמצעות מקדם כבד-שרשרת צולבות הקישור חוטים שרירן (Mhc)-Gal4. (ה) כימות אחוזי השריר באזור יחסית הזבובים שליטה אישר כי ההבדלים היו משמעותיים. ההיסטוגרמה מציגה אמצעי ± S.E.M. * *p< 0.01 ו * p < 0.05 (Student´s-t-test). סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56179/56179fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
שיטת דיווח כאן יהיה עניין לחוקרים התמקדות פיתוח שרירים, תחזוקה, הזדקנות, המחלה פתולוגיה, בדיקות סמים כפי שהיא מספקת מידע אמין על כיצד רקמת השריר יגיב לגורמים אנדוגניים וחיצוניים.

<table><tbody><tr><td>תוכנת Image-J</td><td>המכונים הלאומיים לבריאות</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Ultramicrotome</td><td>Leica</td><td>Leica UC6</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Leica</td><td>Leica MZ6</td><td>טכניקת שדה בהיר.</td></tr><tr><td>סכיני גילוח</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>71970</td><td>קיימים מספר ספקים חלופיים.</td></tr><tr><td>מספריים</td><td>עולם דיוק עולם</td><td>14003</td><td>קיימים מספר ספקים חלופיים.</td></tr><tr><td>הטמעת תבניות</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>70900</td><td>קיימים מספר ספקים חלופיים.</td></tr><tr><td>גלוטראלדהיד</td><td>פלוקה (סיגמא)</td><td>49624</td><td>רעיל.</td></tr><tr><td>OsO4</td><td>Polyscience</td><td>0972A</td><td>רעיל ביותר.</td></tr><tr><td>תחמוצת פרופילן</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>82320-250 מ"ל</td><td>רעיל במיוחד.</td></tr><tr><td>שרף (דורקופן)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>44611-44614</td><td>מסרטן כאשר הוא לא מפולימר.</td></tr><tr><td>טולואידין כחול</td><td>Panreac</td><td>251176</td><td>רעיל.</td></tr><tr><td>Mountant Medium (DPX)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44581</td><td>מסוכן.</td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P6148-500G</td><td>מזיק.</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Panreac</td><td>122507</td><td>דילול של 0.2 M.</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Panreac</td><td>121677</td><td>דילול של 0.2 M.</td></tr><tr><td>בורקס</td><td>Panreac</td><td>3052</td><td>רעיל.</td></tr></tbody></table>

קביעת אזור שרירים חתך הרוחב אופטי שרירי תעופה עקיף למבוגרים דרוזופילה melanogaster

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

מסת השריר, מבזבז את המכונה ניוון שרירים, הוא הפנוטיפ הנפוץ דרוזופילה דגמים של מחלות נוירומוסקולריות. השתמשנו השרירים טיסה עקיף (IFMs) של זבובים, במיוחד dorso-האורך השרירים (DLM), כמו ניסיוני על מידה פנוטיפ מנוונת הביא על ידי גורמים גנטיים שונים. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד להטביע את שרירי החזה לטוס חלוקתה דק חצי כיצד להשיג קונטרסט טוב בין השריר ואת הרקמה הסובבת, כיצד לעבד תמונות מיקרוסקופ אופטי עבור רכישת חצי אוטומטי של מידע כמיתים, ניתוח. אנו מתארים שלושה יישומים ספציפיים של הצינור מתודולוגי. ראשית, אנו מראים איך ניתן להחיל את שיטת לכמת ניוון שרירים במודל לטוס ניוון חולים myotonic; שנית, מדידה של שטח חתך הרוחב שריר יכול לעזור לזהות גנים לקדם או למנוע ניוון שרירים ו/או ניוון שרירים; שלישית, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם כדי לקבוע אם תרכובת המועמד הוא אפשרות לשנות באופן משמעותי את הפנוטיפ מנוונת נתון המושרה על ידי מוטציה גורמי מחלותאו על-ידי של גורם סביבתי.

כדי לכמת אם את ביטוי של MblC או הממשל של Abp1 הייתה השפעה כלשהי פנוטיפ מנוונת של המודל לטוס ניוון חולים Myotonic התמקדנו DLMs, אשר מהווים חלק IFMs (איור 1). קבענו כי המודל זבובים, אשר אקספרס 250 ללא קידוד CTG חזרה לאורך מערכת השרירים מונע על ידי האמרגן צולבות הקישור חוטים שרירן כבד-שרשרת (Mhc)-Gal4, היתה ירידה 50% משטח השריר בהשוואה לשלוט זבובים. לעומת זאת, ביטוי משותף של MblC, חזרה CTG מורחבת עם הנהג אותו, לדכא בחריפות פנוטיפ כזה, crossectional שריר...

. מדווחים שיטה לכמת שרירים באזור, אשר היא שיטה עקיפה כדי לקבוע את מסת השרירים במבוגרים דרוזופילה . נדגים היישום של המתודולוגיה שלנו על-ידי ניתוח הטיסה עקיף השרירים במודל דרוזופילה ממחלת ניוון שרירים חולים Myotonic.

קביעת אזור שרירים חתך הרוחב אופטי שרירי תעופה עקיף למבוגרים דרוזופילה Melanogaster

Muscle mass wasting, known as muscle atrophy, is a common phenotype in Drosophila models of neuromuscular diseases. We have used the indirect flight ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לכמת את שטח השריר בשרירי בוגרים של Drosophila, כדרך לכמת באופן עקיף את מסת השריר ולהעריך נכונה את רמות התהליכים של התפתחות שריר או ניוון שרירים. לצורך כך, התמקדנו בשרירים האורכיים הגביים (dorsal longitudinal muscles) בשל גודלם, פיזורם, וכן בשל העובדה שמיקומם מאפשר התמצאות קלה ופשוטה לביצוע חיתוכים רוחביים. שלב ראשון: קיבוע וטמיעה בשרף.השלב הראשון של הפרוצדורה הוא הרדמת הזבובים באמצעות CO2, ובעזרת מספריים ופינצטה, הסרת הרגליים, הכנפיים והחלק הקצבי של הבטן. שנית, יש להעביר בזהירות את הגופות, כדי למנוע עיוות של החזה, לשפופרת של 1.5 מיליליטר על קרח, כאשר מניחים מקסימום שישה פרטים לשפופרת המכילה 200 µL של תמיסה 1. הגופות אינן יכולות להישאר בתמיסה זו יותר מ-20 דקות.לבסוף, הוסיפו 200 µl מתמיסה שתיים והדגירו בקרח למשך 30 דקות. לאחר ההדגרה, הסירו את כל הנוזל, הוסיפו 200 µl מתמיסה שתיים, והדגירו את הגופות בקרח למשך שעה עד שעתיים. השלב הבא הוא הסרת התמיסה ודהידרציה של הדגימות באמצעות סדרת אתנול מדורגת.דגרו את הדגימות פעמיים ב-propylene oxide למשך עשר דקות בכל דגירה. לאחר מכן, החליפו את ה-propylene oxide בתערובת של 500 µL resin ו-500 µL propylene oxide ודגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך לילה.לאחר מכן, העבירו את הגופות לתבניות פלסטיק המכילות שרף חדש, תוך הקפדה להניח גופה אחת בכל השקע של התבנית. בעזרת מקל עץ, כווןו את הגופות בתוך השקעים והניחו לשרף לעבור פולימריזציה במהלך הלילה בתנור פסטור בטמפרטורה של 70 °C. כדי להשליך את השרף, אפו אותו בטמפרטורה של 70 °C למשך 24 שעות, שכן שרף אפוי ומוצק אינו רעיל.שנית, קיטום וחיתוך של הבלוקים. בעזרת להבי תער, קטמו את השרף וצרו צורה טרפזית סביב הגופה כדי להבטיח אוריינטציה מתאימה במיקרוטום. בדקו תחת המיקרוסקופ שהשרירים מכוונים באופן מושלם.לאחר מכן, חתכו חתכים בעובי של 1.5 µm באמצעות אולטרה-מיקרוטום, והעבירו את החתכים לטיפות מים על גבי שקופיות ג'לטיניות. לבסוף, הניחו את השקופיות המכילות את החתכים על בלוק חימום בטמפרטורה של 70 עד 80 °C עד שכל המים יתאדו. שלוש, צביעת חתכי IFM.כסה את הסדורים ב-toluidine blue למשך כ-30 שניות על גבי בלוק חימום. לאחר מכן, שטוף בכמה החלפות של מים והשאר את השקופיות על פלטה חמה עד להתאיידות המים. ארבע, הרכבת חתוכים של IFM.קחו את השקופיות, טפטפו טיפה אחת או שתיים של מדיום להשבחה (mountant medium) על החתכים והניחו מכסה זכוכית ארוך. חמש, רכישת תמונות וכימות של שטח השריר. השתמשו בתוכנת ImageJ כדי לבחור אזור המכיל רק את ה-DLMs.תוך שימוש בממדי התמונה של הזבוב בעל שטח השריר הגדול ביותר כביקורת, בצעו עידון (finerize) של התמונות ומחקו את האזורים, או הפיקסלים, שאינם תואמים לשרירים המדוברים. כמתו את אחוז הפיקסלים המתאימים לרקמת השריר מתוך הסך הכל באמצעות הפקודה analyze, measurement, ובחירת האפשרות area fraction. אחוז שטח זה מהווה הערכה של מסת השריר של ה-DLM בכל זבוב.תוצאות מייצגות. קבענו כי לזבובים המודל, המבטאים 250 חזרות לא מקודדות של CTG ברחבי השרירים, תחת קידום של ה-myosin heavy chain, MhC Gal four, הייתה הפחתה של 50 אחוזים בשטח השריר בהשוואה לזבובי ביקורת. בניגוד לכך, ביטוי משותף של muscle blind C וחזרות CTG מורחבות עם אותו דרייבר דיכאא בעוצמה פנוטיפ זה, ושטח החתך של השריר היה 70 אחוזים מזו של זבובי הביקורת.מתן ההקספפטיד Abp1 במצע התזונה דיכא באופן דומה את הפנוטיפ האטרופי, וזבובים של המודל שקיבלו את התרכובת הראו שטח שריר של כ-60 אחוזים מהשטח הנורמלי, במקום 50 אחוזים, האופייניים לזבובים מסוג DF1. מסקנות. הפרוטוקול המוצג כאן הוא כלי שימושי לכימות ניוון השרירים הנגרם מהופעה או התקדמות של מחלה מסוימת במודל של זבוב. לבסוף, שיטה זו מותאמת גם לזיהוי הבדלים קטנים בשטח השריר, או אפילו לכימות השטח של מבנים שונים כגון nephyocytes.תודה לצפייה.

optical-cross-sectional-muscle-area-determination-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

זיהוי המנגנונים נזק לשרירים הוא קריטי. כאן אנו מציגים את הטכניקה היסטולוגית להכנת פרפין משובצים ו קפוא קטעי תסיסנית שרירי החזה. זה מאפשר ניתוח של מורפולוגיה שרירים לוקליזציה של חלבונים אחרים בתא השריר המרכיבים.

מדורים פרפין-Embedded קפואים של תסיסנית סקס שרירים

שרירי התעופה של דרוזופילה משמשים כמערכת מודל להתפתחות שרירים ופיזיולוגיה. סרטון זה מתאר את שרירי התעופה של מבוגרים ומדגיש פרוטוקול לניתוח שרירי טיסה עקיפים מתפתחים המתאימים לריצוף RNA מגלמים.

דרוזופילה דיסקציה מאוחרת של שריר התעופה העקיפה של הגלמים (IFM): שיטה לאיסוף רקמות בתפוקה גבוהה

C. לאלגנס יש שני סוגים של שרירים, סרקומר יחיד וסרקומר מרובה, או שרירים מפושטים. סרטון זה מתאר את סידור שרירי דופן הגוף המפוספסים, האחראים על תנועת התולעת, וכולל פרוטוקול לדוגמה למדידת מורפולוגיית שרירים באמצעות תוכנת ניתוח תמונה.

C. elegans מדידות שטח שריר: שיטה סטנדרטית לכימות מורפולוגיית שריר מתוח

ב פרוטוקול זה, נדגים היישום של אלקטרון סדרתי-סעיף טומוגרפיה להבהיר את מבנה מיטוכונדריאלי בשריר טיסה עקיף דרוזופילה .

Ultrastructure מיטוכונדריאלי תלת-ממד של שריר טיסה עקיף דרוזופילה התגלה על ידי אלקטרון סדרתי-סעיף טומוגרפיה

כאן, אנו מציגים שיטה קלה לשימוש, רב-תכליתי לביצוע חי הדמיה של תהליכים התפתחותיים מורפוגנזה הכללי של גיד השריר בפרט חי הגלמים דרוזופילה .

אין ויוו הדמיה של גיד השריר מורפוגנזה ב דרוזופילה הגלמים

דרוזוהילה שריר הטיסה הוא מודל רב-עוצמה לחקר רגולציה משלימה, שחבור חלופיים, חילוף חומרים ומכניאולוגיה. אנו מציגים פרוטוקול לניתוח שריר הטיסה המסומן באמצעות פלורסנט מן הגלמים החיים כדי ליצור דגימות מועשר מאוד אידיאלי עבור פרוטאומוניקס וברצף עמוק. דגימות אלה יכולות להציע תובנות מכניסטיות חשובות להיבטים מגוונים של פיתוח שרירים.

חיתוך של דרוזופילה מלאנוסטר שרירי הטיסה לגישות omics

פרוטוקול מוצג המאפשר הדמיה של Drosophila melanogaster שלם בכל שלב של פיתוח באמצעות טומוגרפיה מיקרו מחשב.

הדמיה חיה שלמה של Drosophila melanogaster באמצעות טומוגרפיה מיקרו-מחשבתית

אנו מתארים טכניקת ניתוח המשמרת את הארכיטקטורה של הצומת הנוירו-שרירי ומאפשרת מחקר אימונוציטוכימי מפורט של נוירונים מוטוריים ברגלו הבוגרת של דרוסופילה .

ניתוח ואימונוהיסטוכימיה של הרגל הבוגרת של דרוסופילה לזיהוי שינויים בצומת הנוירו-שרירי עבור נוירון מוטורי מזוהה

דרוזופילה היא מודל מבוסס היטב לחקר מולקולות מפתח המווסתות מיוגנזה. עם זאת, השיטות הנוכחיות אינן מספיקות כדי לקבוע דינמיקת שעתוק mRNA והתפלגות מרחבית בתוך סינציטיה. כדי להתמודד עם מגבלה זו, ביצענו אופטימיזציה של שיטת הכלאה פלואורסצנטית באתרה של RNA המאפשרת זיהוי וכימות של mRNA בקנה מידה של מולקולה אחת.

חקר דינמיקת שעתוק שרירים בסקאלות של מולקולות בודדות בדרוזופילה

כאן, אנו מציגים זרימת עבודה מהירה, בעלות נמוכה, עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של עיני דרוזופילה בוגרות כדי לכמת דפוסי דפוס ופגמי גדילה. אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו להכנת דגימות על ידי הרכבה נקודתית, רכישת תמונה ברזולוציה גבוהה וניתוח תמונה.

תהליך עבודה מהיר ופשוט לכימות מבני דרוזופילה חיצוניים למבוגרים

דרוזופילה היא מודל רב עוצמה להבנת מנגנונים בסיסיים של מיוגנזה. פרוטוקול זה לדיסקציה והכנה של חצאי בית החזה מאפשר ניתוח מיקרוסקופיה של שרירי תעופה עקיפים הן משלב הגולם והן משלב הבוגר. פרוטוקול זה מאפשר הדמיה קונפוקלית של מורפולוגיה תאית, לוקליזציה של חלבונים, מבנה שרירים והיבטים רבים אחרים של מיוגנזה.

דיסקציה של שרירי טיסה עקיפים של Drosophila melanogaster לגישות מיקרוסקופיות

למדו שיטה לכימות שטח שרירים ב-Drosophila melanogaster כמדד עקיף למסת שריר. השיטה מיושמת על שרירי תעופה עקיפים במודל של דיסטרופיה מיוטונית לחקר ניוון שרירים ופתולוגיה.

קביעת אזור שרירים חתך הרוחב אופטי שרירי תעופה עקיף למבוגרים דרוזופילה Melanogaster

גלה סרטונים נוספים