פשוט חיסול רקע זריחה ברקמת המוח האנושי פורמלין-קבוע עבור מיקרוסקופ Immunofluorescence

בעיה נפוצה במיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית היא נוכחות של פלואורסצנטי רקע אנדוגני שיכול להפריע לאות שלך. במקרים רבים, האוטופלואורסצנציה הזו יכולה להפוך את התוצאות שלך לבלתי ניתנות לפרשנות. בפרוטוקול זה נדגים כיצד להסיר אוטופלואורסצנטיות מדגימות רקמת מוח אנושית באמצעות פוטוהלבנה עם מנורת שולחן LED מסחרית.

היתרונות העיקריים של שיטות אלה הם החיסכון המשמעותי בעלויות על פני הטכניקות הקיימות מבלי לוותר על היעילות ושלא מוכנסות תרכובות אקסוגניות לדגימה. לפני שתתחיל, הכינו תמיסות מלאי של תמיסת מלח חד פעמית, TBS ו-10% נתרן אזיד. עבור כל שלוש שקופיות מיקרוסקופ בגודל סטנדרטי שתרצה לעבד, תזדקק לצלחת פטרי אחת בגודל 100 מילימטר על 100 מילימטר כתא שקופיות.

עבור כל תא שקופיות, הכינו 50 מיליליטר של 05% אזיד ב-TBS על ידי הוספת 25 מיליליטר של 10% נתרן אזיד ל-50 מיליליטר של פעם אחת TBS. צור פיגום כדי להעלות את תא ההחלקה שלך כך שראש מנורה יכול להיכנס מתחתיו. עבור צלחת פטרי בגודל 100 מילימטר מרובע, ניתן לחתוך מיכל מזון מפלסטיק בגודל דומה לצורה.

ניתן להשתמש בכל דבר שיכול להעלות את תא ההחלקה בצורה מאובטחת מבלי להפריע לאור להגיע לדגימות. רכשו מנורת שולחן LED זרחנית לבנה והסירו את כל המפזרים או הפלסטיק האטום המכסים את מקור האור. כוון את מערך ה-LED כלפי מעלה.

לשם כך מומלצת מנורה עם צוואר גמיש. בנה כיסוי כיפה רפלקטיבי למנגנון על ידי הארת החלק הפנימי של קופסה גדולה מספיק כדי לכסות את תאי ההחלקה והפיגום בנייר אלומיניום. עבור תא יחיד ניתן להשתמש בקופסת קצה פיפטה של מילימטר אחד.

עבור סרטון זה, רקמת מוח גירי קדמית מסלולית FTLD-T אנושית קבועה בפורמלין עברה את הטיפול המקדים בפוטו-הלבנה. הליכי הכנת רקמות וצביעה באמינו עשויים להשתנות בהתאם למקור, קיבוע והטמעה של חלקי הרקמה שלך. בחדר קירור של ארבע מעלות צלזיוס, ארון קר או מקרר, הנח את המנורה מתחת לפיגום ואת תא הדגימה על גבי הפיגום.

מלאו את תא הדגימה ב-50 מיליליטר של אזיד TBS. טבלו קטעי רקמה בעובי 10 מיקרומטר המותקנים על מיקרוסקופ זכוכית סטנדרטי לתוך תא הדגימה באמצעות מלקחיים נקיים. מכסים את המנגנון בכיפה רפלקטיבית ומדליקים את מנורת הלד.

אפשר לדגימות לפוטו-אקונומיקה למשך 48 שעות. זמן הדגירה הזה עשוי להשתנות, בהתאם לעוצמת המנורה ולכמות החומר האוטו-פלואורסצנטי ברקמה. לאחר טיפול מקדים בפוטו-הלבנה, ניתן לצבוע את השקופיות בפרוטוקול סטנדרטי עבור הרקמות והחלבונים הספציפיים המעניינים שלך.

למטרות הדגמה, רקמת מוח FTLD-T נצבעה לטאו זרחני באמצעות נוגדנים משניים מצומדים ל-Alexa 488 ו-Texas Red. DAPI שימש ככתם נגד גרעיני. הכן 500 מיליליטר של מאגר אחזור אנטיגן, 500 מיליליטר של 0.025% טריטון X-100 ב-TBS, 10 מיליליטר של 1% אלבומין בסרום בקר, BSA, ב-TBS, ושני מיליליטר של תמיסת חסימה, המורכבת מסרום עזים שנוסף ל-BSA TBS.

בצע אחזור אנטיגן על ידי טבילת השקופיות המולבנות לתוך מאגר אחזור אנטיגן באספן שקופיות. מחממים את הקולט בחום של 90 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר הוצאת הקולט מהטיפול בחום, חשוב לאפשר לתא להתקרר בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.

הסרת השקופיות מיד תגרום להתייבשות חלקים. הכן את תערובת הנוגדנים העיקרית שלך בהתאם להמלצות היצרן. במקרה זה, נוגדן אנטי-פוספו PHF tau p-serine 202 בתוספת תראונין 205 AT8 דולל אחד מכל 100 עם BSA TBS והושאר על קרח.

נדרשים 150 מיקרוליטר תערובת נוגדנים לכל חלק. לאחר שהחלקים התקררו במשך 30 דקות, העבירו את השקופיות מקולט אחזור האנטיגן לצנצנת מכתים מלאה ב-TBS Triton. שטפו את השקופיות בתמיסה זו במשך חמש דקות בניעור עדין.

רוקן והחלף את ה-TBS Triton כדי לחזור על שלב הכביסה הזה בפעם השנייה. לאחר הכביסה, הסר את השקופיות מצנצנת הצביעה והסר את כל המאגר העודף. בעזרת עט הידרופובי, צייר קווי מתאר סביב הרקמה.

פעולה זו תמנע מהפתרונות שלך לברוח מהשקופית. הקפד לא לתת למגלשות להתייבש. חסום את הרקמה על ידי פיפטינג של 200 מיקרוליטר של תמיסת חסימה על המגלשות והנח אותן בתוך תא לח.

תא זה יכול להיות משהו פשוט כמו מתלה שקופיות בתוך קופסת קצה פיפטה המכילה מגבת נייר רטובה. ודא שדגימת הרקמה כולה מכוסה בתמיסת חסימה. דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.

הסר את התמיסה החסומה על ידי שואב או פיפטה. פיפטה 100 עד 150 מיקרוליטר של תערובת נוגדנים ראשונית על השקופיות. ודא שהדגימה כולה מכוסה בתמיסת נוגדנים ושהחלקים נשמרים על משטח ישר כדי למנוע איגום לא אחיד של נוגדנים.

דגירה עם נוגדן ראשוני בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה בתא לח. למחרת, הכינו את תערובת הנוגדנים המשנית. במקרה זה, עז נגד עכבר Alexa 488 ועזים נגד עכבר טקסס רד דוללו אחד מכל 100 באמצעות BSA TBS.

אחזר את חלקי הרקמה והסר את תמיסת הנוגדנים העיקרית על ידי שואב או פיפטה. שטפו את השקופיות פעמיים באופן דומה לזה שהשתמשו בעבר בצנצנת מכתים מלאה ב-TBS Triton למשך חמש דקות כל שטיפה. לאחר הכביסה, יש לנדף את כל הבופר העודף.

פיפטה 100 עד 150 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים משנית, מה שמבטיח שוב שדגימת הרקמה מכוסה לחלוטין. דגירה במשך שעתיים בטמפרטורת החדר בתא הלח בחושך. הכן 0.1 מיקרוגרם לכל כתם נגד DAPI מיליליטר ב- TBS בהתאם להמלצות היצרן או דילול סדרתי.

הקפד לערבב היטב את תמיסת מלאי DAPI עקב חוסר מסיסות אפשרי. אחזר את השקופיות והסר את תערובת הנוגדנים המשנית. שטפו את הדגימות פעמיים, אך במקום להשתמש ב-TBS Triton, השתמשו ב-TBS רגיל.

שאפו או פיפטו את תמיסת הכביסה שנותרה ופיפטה 100 עד 150 מיקרוליטר של כתם DAPI על חלקי הרקמות שלכם. דגירה בחושך בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. אחזר את הדגימות ושטוף שלוש פעמים עם TBS רגיל במקום שתיים.

לאחר הכביסה, הסר בזהירות את תמיסת הכביסה שנותרה. החל מדיום הרכבה. השלם את הרכבת השקופיות על ידי כיסוי הדגימות בהחלקות כיסוי זכוכית.

הימנע מבועות על ידי הנחת קצה אחד של הכיסוי מחליק כלפי מטה והורדה איטית מאוד של הקצה הנגדי באמצעות מלקחיים. הניחו למדיית ההרכבה להתייבש לפני האחסון בארבע מעלות צלזיוס בחושך. השקופיות מוכנות כעת להצגה חזותית.

ההגדרות עבור המיקרוסקופיה הקרינה ישתנו בהתאם לפלואורופורים המשמשים לצביעה ולמיקרוסקופ. הפעל את מנורת הקרינה, המיקרוסקופ והמחשב, ואפשר למנורה להתחמם למשך 15 דקות. הנח את שקופיות הרקמה המוכתמות במיקרוסקופ הקרינה.

השתמש בשדה הבהיר כדי לאתר את הרקמה בהגדלה פי 10. לאחר איתור אזור רקמה מתאים, הוסף טיפת מים על גבי תלוש הכיסוי של הדגימה. עבור לעדשת טבילה במים פי 20.

בחר אורכי גל עירור ופליטת לייזר המתאימים לכל פלואורופור במסלולים נפרדים לקבלת האות הטוב ביותר. פרטים נוספים על ההגדרות ואורכי הגל שבהם נעשה שימוש ניתן למצוא בכתב היד המצורף. התאם את הגדרות עוצמת הלייזר והרווח כדי לייעל את עוצמת האות עבור כל רצועה.

לאחר מציאת ההגדרות ושדה הראייה המתאימים, שמור תמונה מורכבת המכילה את נתוני הקרינה מכל רצועה. להדמיה של עוצמת הקרינה בכל ערוץ, התקן את המאקרו RGB Profile Tools עבור ImageJ. פתח את קובץ התמונה הקונפוקלית lsm ב-ImageJ והמר את התמונות המורכבות משלושת האוספים ל-RGB על ידי מעבר אל Image, Color, Channel Tool.

בחר Composite ובדוק את כל שלושת הערוצים. לאחר מכן, עבור אל תמונה, סוג וצבע RGB. בחרו בסמל RGB Profile Tools וציירו קו על פני המקטע בתמונה שברצונכם ליצור פרופיל.

בסרטון זה תוארו השלבים לביצוע טיפול מקדים בהלבנת אור של דגימות רקמה כדי לייצר פלואורסצנטיות ברקע. ניתן להוסיף הליך זה לכל פרוטוקול פלואורסצנטי אמינו סטנדרטי לפני אחזור אנטיגן וצביעה של אמינו. המנגנון המשמש להלבנת פוטו הוא זול וניתן להשגה בקלות, המורכב מרכיבי מדף.

נוריות זרחן לבן פולטות אור על פני ספקטרום רחב של אורכי גל, מה שהופך אותן למתאימות ביותר להלבנת פוטו בטווח רחב. באמצעות מנורת שולחן LED זמינה, דגימות רקמת מוח אנושיות FTLD-T לא מוכתמות הולבנו וצולמו באמצעות אורכי הגל שהיו מתאימים אם דגימות אלה היו מוכתמות בטקסס אדום ואלקסה 488. דגימות שלא טופלו הראו כמויות גדולות של אוטופלואורסצנטיות.

לעומת זאת, פוטו-הלבנה הביאה להפחתה משמעותית בעוצמה של כתמי אוטופלואורסצנציה הדומים לליפופוסין, כמו גם פלואורסצנטי רקע כללי. לצורך אימות נוסף של טכניקה זו, דגימות רקמת מוח FTLD-T נצבעו עבור טאו היפר-זרחני, חלבון שמתקפל בצורה שגויה ומצטבר במחלה זו כגופי הכללה נפרדים. שני נוגדנים משניים שונים הופעלו כדי להבחין טוב יותר בין תיוג טאו לבין פלואורסצנטיות לא ספציפית.

בתמונות מורכבות אלה, קולוקליזציה של Alexa 488 ו-Texas Red מוצגת בצהוב, המייצג חלבון טאו צבוע כהלכה. הופעתם של אזורים אדומים או ירוקים מעידה על פלואורסצנטיות לא ספציפית או על כיבוי של אחד הכרומופורים. בדגימת הבקרה הלא מטופלת ניתן לראות רקע משמעותי ואות לא ספציפי, במיוחד בערוץ טקסס אדום.

גם טיפול מקדים בפוטו-הלבנה, כמו גם יישום של מרווה כימי מביאים לאות רקע מופחת מאוד. אם נפצל את ערוצי הקרינה ונסתכל על התמונות בהגדלה גבוהה יותר, ניתן לבצע תצפיות מפורטות יותר. לבקרה הלא מטופלת יש פלואורסצנטיות רקע בכל הערוצים, כמו גם מאפיינים לא ספציפיים, בעיקר בערוץ טקסס אדום, בעלי עוצמה דומה לתיוג הספציפי לטאו.

אם לגופי הכללת טאו לא הייתה מורפולוגיה מובחנת וניתנת לחיזוי, ניתן היה לפרש את התוצאות הללו של טקסס רד באופן שגוי בשל נוכחותם של תכונות אוטו-פלואורסצנטיות אלה. טיפול מקדים בפוטו-הלבנה מבטל לחלוטין את התכונות הלא ספציפיות הללו של טקסס אדום, תוך שמירה על רוב האותות הספציפיים לטאו טקסס אדום ואלקסה 488. עם זאת, נראה כי להלבנת אור יש השפעה מועטה על הקרינה ברקע DAPI.

מרווה כימי הפחית את הקרינה ברקע בערוץ Alexa 488 באותה יעילות כמו פוטו-הלבנה. עם זאת, זה גם הפחית את עוצמות הקרינה הן של DAPI והן של טקסס אדום, מה שמרמז על נוכחות של מרווה לא פרודוקטיבית. ניתן לראות כימות של השפעות אלה בפרופילי האותות.

כפי שאתה יכול לראות, שיטה זו מייצרת תמונות נקיות ללא תכונות מבלבלות. ניתן לשלב טיפול מקדים זה בפוטו-הלבנה בכל פרוטוקול פלואורסצנטי אמינו סטנדרטי כדי להסיר אוטו-פלואורסצנציה ולהפיק תוצאות איכותיות וחד משמעיות.