פשוט חיסול רקע זריחה ברקמת המוח האנושי פורמלין-קבוע עבור מיקרוסקופ Immunofluorescence

בעיה נפוצה במיקרוסקופיה של אימונופלורסצנציה היא נוכחות של פלורסצנציה רקע אנדוגנית שעלולה להפריע לאות שלך. במקרים רבים, אוטופלורסצנציה זו עלולה להפוך את התוצאות שלך לבלתי ניתנות לפירוש. בפרוטוקול זה נדגים כיצד להסיר אוטופלורסצנציה מדגימות של רקמת מוח אנושית באמצעות פוטובליצ'ינג (הבהרה פוטוכימית) באמצעות מנורת שולחן LED מסחרית.

היתרונות העיקריים של שיטות אלו הם חיסכון משמעותי בעלויות לעומת הטכניקות הנוכחיות מבלי להקריב את היעילות, והעובדה שאינם מוכנסים תרכובים חיצוניים לדגימה. לפני התחלת העבודה, הכין תמיסות מלאי של tris-buffered saline בריכוז 1x, TBS, ו-10% sodium azide. עבור כל שלוש זלוגיות מיקרוסקופ בגודל סטנדרטי שברצונך לעבד, תזדקק לצלחת פטרי ריבועית אחת בגודל 100 millimeter על 100 millimeter שתשמש כתא לזלוגיות.

עבור כל תא שקופית, הכן 50 מיליליטר של 0.5% azide ב-TBS על ידי הוספה של 25 מיליליטר של 10% sodium azide ל-50 מיליליטר של TBS בריכוז פי אחד. צור תושבת להגבהת תא השקופית כך שראש מנורה יוכל להיכנס תחתיו. עבור צלחת פטרי ריבועית בגודל 100 מילימטר, ניתן לגזור מכלי מזון מפלסטיק בגודל דומה לצורה המתאימה.

ניתן להשתמש בכל פריט שיכול להרים באופן יציב את תא השקופיות מבלי לחסום את הגעת האור לדגימות. השג מנורת שולחן LED עם זרחן לבן והסר מפזרים או פלסטיק אטום המכסים את מקור האור. כוון את מערך ה-LED כלפי מעלה.

לצורך כך מומלץ להשתמש במנורה בעלת צוואר גמיש. הכינו כיסוי כיפה מחזיר אור למכשיר על ידי ריפוד פנים של קופסה גדולה מספיק כדי לכסות את תאי השקופיות ואת הפיגום בנייר אלומיניום. עבור תא בודד, ניתן להשתמש בקופסה של טיפים לפיפטה של 1 מילימטר.

עבור סרטון זה, רקמת מוח מאזור הגירוס הפרונטלי האורביטלי של בני אדם עם FTLD-T מקובעת בפורמלין הועמדה לטיפול מקדים של פוטובליצ'ינג (photobleaching). נהלי הכנת הרקמה וצביעת האמינו עשויים להשתנות בהתאם למקור, לקיבוע ולשיטת ההטמעה של נתחי הרקמה שלכם. בחדר קירור, בארון קירור או במקרר בטמפרטורה של 4 °C, הניחו את המנורה מתחת למסבך ואת תא הדגימה מעל למסבך.

מלא את תא הדגימה ב-50 milliliters של azide TBS. טבול חתכי רקמה בעובי 10 micrometer המורכבים על שקופיות זכוכית סטנדרטיות למיקרוסקופ לתוך תא הדגימה באמצעות פינצטה נקייה. כסה את המכשיר עם הכיפה המחזיזה והדלק את נורת ה-LED.

אפשרו לדגימות לעבור פוטובליצ'ינג (photobleaching) למשך 48 שעות. זמן דגירה זה עשוי להשתנות, בהתאם לעוצמת הנורה וכמות החומרים בעלי פלואורסצנציה עצמית ברקמה. לאחר טיפול מקדמי של פוטובליצ'ינג, ניתן לבצע לצליחות צביעה אימונוהיסטוכימית באמצעות פרוטוקול סטנדרטי עבור הרקמה הספציפית והחלבונים הנבדקים.

לצורכי הדגמה, רקמת מוח של FTLD-T נצבעה לזיהוי tau מאופסרללה באמצעות נוגדנים משניים המשוררים ל-Alexa 488 ול-Texas Red. DAPI שימש כצבע נגד לגרעין. הכינו 500 מיליליטר של חוצץ לשחזור אנטיגן, 500 מיליליטר של 0.025% Triton X-100 ב-TBS, 10 מיליליטר של 1% אלבמין משרת בקר, BSA, ב-TBS, ושני מיליליטר של תמיסת חסימה, המורכבת מסרום עיזים שהתווסף ל-BSA TBS.

בצעו שחזור אנטיגן על ידי טבילת השקופיות שעברו הלבנה פוטוכימית בתוך בופר לשחזור אנטיגן בתוך אסוף שקופיות. חממו את האסוף בטמפרטורה של 90 °C למשך 30 דקות. לאחר הוצאת האסוף מהטיפול בחום, חשוב להמתין עד שהתא יתקרר בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.

הסרה מיידית של השקופיות תגרום לייבוש של החתכים. הכינו את תערובת הנוגדן הראשוני בהתאם להמלצות היצרן. במקרה זה, נוגדן anti-phospho PHF tau p-serine 202 plus threonine 205 AT8 דולל ביחס של 1:100 ב-BSA TBS ונשמר על קרח.

דרושים 150 µL של תערובת נוגדנים לכל חתך. לאחר שהחתכים התקררו במשך 30 דקות, העבירו את השקופיות ממכל השחזור של האנטיגן לצנצנת צביעה מלאה ב-TBS Triton. שטפו את השקופיות בתמיסה זו במשך חמש דקות תוך כדי ניעור עדין.

רוקנו והחליפו את ה-TBS Triton כדי לחזור על שלב שטיפה זה פעם שנייה. לאחר השטיפה, הוציאו את השקופיות מכלי הצביעה וספגו בעזרת נייר סופג כל שארית של באפר.

פעולה זו תמנע מהתמיסות לזרום מהשקופית. הקפידו לא להניח לשקופיות להתייבש. חסמו את הרקמה על ידי טפטוף של 200 µL של תמיסת חסימה על השקופיות, והניחו אותן בתוך תא לחות.

תא זה יכול להיות פשוט ככל שיהיה, כגון מתקן זכוכית בתוך קופסת טיפים לפיפט המכילה נייר סופג רטוב. ודאו שכל דגימת הרקמה מכוסה בתמיסת החסימה. דגרו בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.

הסיר את תמיסת החסימה באמצעות שואב או פיפטה. טפטף באמצעות פיפטה 100 עד 150 µL מתערובת הנוגדן הראשוני על השקופיות. ודא שכל הדגימה מכוסה בתמיסת הנוגדן ושהחתכים נשמרים על משטח מאוזן כדי למנוע הצטברות לא אחידה של הנוגדן.

הדגירה עם הנוגדן הראשוני תתבצע בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך לילה בתא לחות. למחרת, הכינו את תערובת הנוגדים השניים. במקרה זה, goat anti-mouse Alexa 488 ו-goat anti-mouse Texas Red דוללו ביחס של 1:100 באמצעות BSA TBS.

הוציאו את נתחי הרקמה והסירו את תמיסת הנוגדן הראשוני באמצעות שואב או פיפטה. שטפו את השקופיות פעמיים באופן דומה לשלבים הקודמים, תוך שימוש בצנצנת צביעה מלאה ב-TBS Triton למשך חמש דקות לכל שטיפה. לאחר השטיפה, ספגו את עודפי התמיסה.

טפטפו 100 עד 150 µL של תמיסת נוגדן משני, תוך וידוא פעם נוספת שדגימת הרקמה מכוסה לחלוטין. דגרו למשך שעתיים בטמפרטורת החדר בתא לחות בחושך. הכינו צבע נגדי DAPI בריכוז 0.1 µg/mL ב-TBS לפי המלצות היצרן או באמצעות דילול סדרתי.

יש לוודא שערבבתם היטב את תמיסת המקור של DAPI בשל אפשרות לחוסר מסיסות. הוציאו את השקופיות והסירו את תערובת הנוגדן המשני. שטפו את הדגימות פעמיים, אך במקום להשתמש ב-TBS Triton, השתמשו ב-TBS רגיל.

שאבו או העבירו בפיפט את תמיסת השטיפה שנותרה, והוסיפו בפיפט 100 עד 150 µL של צבע DAPI על חיתוכי הרקמה. הדגירה תתבצע בחשכה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. הוציאו את הדגימות ושטפו שלוש פעמים עם TBS בלבד במקום פעמיים.

לאחר השטיפה, הסירו בזהירות את תמיסת השטיפה שנותרה. מרחו חומר הרכבה. השלימו את הרכבת הפיתוח על ידי כיסוי הדגימות עם זכוכיות כיסוי.

יש למנוע היווצרות בועות על ידי הנחת קצה אחד של זכוכית הכיסוי ולאחר מכן הורדה איטית מאוד של הקצה הנגדי באמצעות פינצטה. יש להמתין לייבוש של מדיום הקיבוע לפני אחסון בטמפרטורה של 4°C בחשכה. כעת הפיתחים מוכנים לתצפית.

ההגדרות למיקרוסקופיה פלואורסצנטית ישתנו בהתאם לפלואורופורים ששימשו לצביעה ולסוג המיקרוסקופ. הדלק את מנורת הפלואורסצנציה, את המיקרוסקופ ואת המחשב, והמתן 15 דקות לחימום המנורה. הנח את נגבי הרקמה הצבועים במיקרוסקופ הפלואורסצנציה.

השתמשו בשדה בהיר (bright field) כדי לאתר את הרקמה בהגדלה של 10 פעמים. לאחר איתור אזור רקמה מתאים, הוסיפו טיפת מים על זכוכית הכיסוי של הדגימה. עברו לעדשת טבילה במים בהגדלה של 20 פעמים.

בחרו אורכי גל של עירור ופליטה של הלייזר המתאימים לכל פלואורופור בערוצים נפרדים כדי להשיג את האות המיטבי. פרטים נוספים על ההגדרות ואורכי הגל שבהם נעשה שימוש מופיעים במאמר הנלווה. כווננו את הספק של הלייזר ואת הגדרות ההגבר (gain) כדי למקסם את עוצמת האות עבור כל ערוץ.

לאחר מציאת ההגדרות ושדה הראייה המתאימים, שמרו תמונת קומפוזיט (composite) המכילה את נתוני הפלואורסצנציה מכל ערוץ. לצורך ויזואליזציה של עוצמת הפלואורסצנציה בכל ערוץ, התקינו את המאקרו RGB Profile Tools עבור ImageJ. פתחו את קובץ תמונת הקונפוקל בפורמט lsm בתוכנת ImageJ והמירו את תמונות הקומפוזיט משלושת המחסניתים (stacks) ל-RGB על ידי מעבר לתפריט Image, Color, Channel Tool.

בחר ב-Composite וסמן את כל שלושת הערוצים. לאחר מכן, עבור ל-Image, Type ו-RGB Color. בחר בסמל של RGB Profile Tools ושרטט קו לאורך המקטע בתמונה שיש לבצע עבורו פרופיל.

בסרטון זה תוארו השלבים לביצוע טיפול מקדים של פוטובליצ'ינג (photobleaching) לדגימות רקמה כדי להפחית פלואורסצנציית רקע. ניתן להוסיף הליך זה לכל פרוטוקול סטנדרטי של פלואורסצנציית חומצות אמינו לפני שלב שחזור האנטיגן וצביעת חומצות האמינו. המכשור המשמש לפוטובליצ'ינג הוא זול וקל להשגה, ומורכב מרכיבים זמינים מהמדף.

נורות LED עם פוספור לבן פולטות אור בטווח רחב של אורכי גל, מה שהופך אותן למתאימות מאוד להבהלה פוטוכימית (photobleaching) בטווח רחב. באמצעות מנורת שולחן LED זמינה, דגימות של רקמת מוח אנושית עם FTLD-T שלא נצבעו עברו הבהלה פוטוכימית ודגימה תמונתית באמצעות אורכי גל שיהיו מתאימים אילו דגימות אלו היו נצבעות ב-Texas Red וב-Alexa 488. דגימות שלא טופלו הראו כמויות גדולות של פלואורסצנציה עצמית.

לעומת זאת, הבהרה פוטוכימית (photobleaching) הובילה להפחתה משמעותית בעוצמת נקודות האוטופלואורסצנציה שדמו לליפופוסין, וכן לפלואורסצנציית רקע כללית. לצורך תיקוף נוסף של טכניקה זו, דגימות רקמת מוח של FTLD-T נצבעו עבור tau היפר-פוספורילated, חלבון שעובר קיפול שגוי ונערם במחלה זו כגופי הכללה (inclusion bodies) מובחנים. שני נוגדנים משניים שונים יושמו כדי להבדיל טוב יותר בין סימון של tau לבין פלואורסצנציה לא ספציפית.

בתמונות מרוכבות אלו, קולוקליזציה (colocalization) של Alexa 488 ו-Texas Red מוצגת בצבע צהוב, המייצג חלבון tau שנצבע בצורה נכונה. הופעתם של אזורים אדומים או ירוקים מעידה על פלואורסצנציה לא ספציפית או על כיבוי (quenching) של אחד הכרומופורים. בדגימת הביקורת שלא טופלה, ניתן לראות רקע משמעותי ואות לא ספציפי, במיוחד בערוץ ה-Texas Red.

הן טיפול מקדים של פוטובליצ'ינג (photobleaching) והן יישום של מחמיר (quencher) כימי גורמים להפחתה משמעותית של אות הרקע. אם נפריד את ערוצי הפלואורסצנציה ונבחן את התמונות תחת הגדלה גבוהה יותר, ניתן יהיה להגיע לתצפיות מפורטות יותר. בביקורת הבלתי מטופלת קיימת פלואורסצנציית רקע בכל הערוצים, וכן מאפיינים לא ספציפיים, בעיקר בערוץ ה-Texas Red, בעלי עצימות דומה לסימון הספציפי של tau.

אם לגופי ההכלה של tau לא הייתה מורפולוגיה מובחנת וצפויה, תוצאות ה-Texas Red היו עלולות להיות מושגות באופן שגוי בשל נוכחותם של מאפיינים אלו בעלי פלואורסצנציה עצמית. טיפול מקדיים של פוטובליצ'ינג (Photobleaching) מבטל לחלוטין את המאפיינים הלא-ספציפיים של Texas Red, תוך שימור רוב האותות הספציפיים של tau עבור Texas Red ו-Alexa 488. עם זאת, נראה כי לפוטובליצ'ינג השפעה מועטה על פלואורסצנציית הרקע של DAPI.

מכבה כימי הפחית את הפלואורסצנציית הרקע בערוץ Alexa 488 ביעילות דומה לזו של פוטובליצ'ינג. עם זאת, הוא הפחית גם את עוצמות הפלואורסצנציה של DAPI ושל Texas Red, מה שמרמז על קיומה של השפעת כיבוי מנוגדת. את הכמות של השפעות אלו ניתן לראות בפרופילי האות.

כפי שניתן לראות, שיטה זו מפיקה תמונות נקיות ללא מאפיינים מבלבלים. ניתן לשלב טיפול מקדיים זה של פוטו-בליצ'ינג (photobleaching) בכל פרוטוקול סטנדרטי של פלואורסצנציית חומצות אמינו כדי להסיר אוטופלואורסצנציה ולהפיק תוצאות איכותיות וחד-משמעיות.