מתודולוגיה סטנדרטי כדי לבדוק באתר המוטגניות כפונקציה של תיקון נקודת מוטציה על ידי CRISPR/Cas9 ו- SsODN בתאי אדם

המטרה הכוללת של הליך ניסיוני זה היא להתוות גישה בסיסית במתודולוגיה מפורטת למדידת הטרוגניות גנטית באתר היעד בצורה אמינה וחזקה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום עריכת הגנים כגון, כיצד ניתן לנתח ולמדוד מוטגנזה באתר. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמדובר במתודולוגיה סטנדרטית לתיקון מכוון הומולוגיה או תיקון גנים באמצעות אוליגונוקלאוטידים חד-גדיליים.

כדי להתחיל בפרוטוקול, יש לגדל תאי HTT11619 ב-25 מיליליטר של מדיום שהוכן בעבר לתרבית תאי HTT116 בבקבוק T-175. שאפו את המדיום ושטפו את התאים עם מי מלח פוספט או PBS של דולבקו, ללא סידן ומגנזיום, ואז שאפו את ה-PBS. לאחר מכן, הוסף טריפסין טיפה לבקבוק T-175, באמצעות פיפטה של חמישה מיליליטר.

אפשר לתאים להתנתק באינקובטור. הקש על הבקבוק כדי לעקור את התאים ולאחר מכן להרוות את התאים עם שמונה מיליליטר של מדיום שלם על פני כל שטח הבקבוק. לאחר מכן פיפטה את התערובת למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לפרק גושי תאים ולהעביר את התאים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר.

לפני סיבוב התאים כלפי מטה, קח 10 מיקרוליטר מהצינור החרוטי של 15 מיליליטר ושלב אותו עם 10 מיקרוליטר של טריפן כחול כדי לספור את התאים, ואז גלול את התאים. העבירו 10 מיקרוליטר מהתאים המעורבבים בטריפן כחול להמוציטומטר וספרו את ארבע הרשתות מבחוץ. עבור כל צלחת של 10 סנטימטר של תאים לסנכרון, הוסף חמישה מיליליטר של מדיום שלם ושישה מיקרומולר של אפידיקולין.

לאחר מכן, העבירו 100 מיקרוליטר מכדור התא התלוי מחדש לכל צלחת סנטימטר וסובבו את הצלחת בעדינות לערבוב. דגרו את הלוחות כדי לסנכרן את התאים בגבול G1S. ארבע שעות לפני המיקוד, שאפו את המדיום, שטפו עם PBS.

שאפו את ה- PBS והוסיפו חמישה מיליליטר של מדיום שלם. החזירו את הצלחת לחממה למשך ארבע שעות. הזן את רצף הגנים המוטנטי EGFP למחולל המקוון של Zane Labs ובחר את רצפי מדריך ה-CRISPR הנקשרים בסמיכות לאתר היעד.

מערבבים את ה-RNA בריכוזים מולאריים שווים ל-45 מיקרו-מולר. הוסף 6.75 מיקרוליטר של מלאי של 200 מיקרו-מולרי של CR RNA ו-6.75 מיקרוליטר של מלאי 200 מיקרו-מולרי של RNA עוקב לצינור צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף 16.50 מיקרוליטר של מאגר IDT כדי ליצור נפח סופי של 30 מיקרוליטר.

לאחר מכן, מחממים את התערובת בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, במכונת PCR. הניחו לדגימות להתקרר לטמפרטורת החדר. עבור כל דגימה, יש לדלל 2.22 מיקרוליטר של CR RNA לקומפלקס RNA עוקב ו-2.78 מיקרוליטר של מאגר IDT לנפח סופי של חמישה מיקרוליטר.

יש לדלל 1.67 מיקרוליטר של חלבון Cas9 ממלאי של 60 מיקרו-מולאר ב-3.33 מיקרוליטר של מדיום סרה נמוך, לנפח סופי של חמישה מיקרוליטר. מערבבים חמישה מיקרוליטרים של חלבון Cas9 עם חמישה מיקרוליטרים של RNA מורכב. שאפו את המדיום, שטפו עם חמישה מיליליטר PBS.

שאפו את ה-PBS והוסיפו מיליליטר אחד של טריפסין מחומם מראש לכל צלחת של 10 סנטימטרים. הכניסו את הצלחות לחממה. לאחר מכן, הקש על צלחת 10 סנטימטר כדי לוודא שכל התאים נעקרו ואז הרוו אותם בארבעה מיליליטר של מדיום שלם, על ידי פיזורו על פני כל שטח הצלחת.

פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לפרק גושי תאים ולהעביר את התאים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. הניחו 10 מיקרוליטר מהצינור החרוטי של 15 מיליליטר ושלבו אותו עם 10 מיקרוליטר טריפן כחול כדי לספור את התאים. גלולה את התאים על ידי סיבוב במשך חמש דקות ב-125 x G בטמפרטורת החדר.

שואבים את המדיום ושוטפים עם חמישה מיליליטר PBS. פרו את התאים על ידי סיבוב 125 x G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. העבירו 100 מיקרוליטר מתרחיף התא לכל קובטה במרווח של ארבעה מילימטרים.

הוסף 10 מיקרוליטר של קומפלקס RNP ל -100 מיקרוליטר תאים, בצפיפות של 5 x 10 לצפיפות התא החמישית. הוסף שני ODN מיקרו-מולרי לכל דגימה. לאחר מכן, קח את המתלה למכונת אלקטרופורציה.

העבירו קלות כל אחת מהדגימות והניחו אותן בתא. החזירו את המתלה למכסה המנוע והעבירו כל דגימה לבאר המכילה שני מיליליטר של מדיום שלם בצלחת שש בארות. דגרו את הצלחת לפני בדיקת רמות התיקון.

שאפו את המדיום ושטפו את התאים בשני מיליליטר PBS. החלף את ה- PBS ב -500 מיקרוליטר טריפסין מחומם מראש לכל באר מצלחת שש הבארות. מניחים את הצלחות בחממה.

לאחר מכן, הקש על הצלחת כדי לוודא שכל התאים נעקרו ואז להרוות עם מיליליטר אחד של מדיום שלם על ידי פיזורו על פני כל שטח הבאר. העבירו את התאים לצינור צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר וגלולה. לאחר גלולת התאים, שאפו את המדיום, ואז השעו מחדש את כדור התא ב-500 מיקרוליטר של מאגר FACS.

אלקטרופוראט את תאי HTT11619 המסונכרנים והמשוחררים בריכוז של 5 x 10 לתאים החמישיים לכל 100 מיקרו-ליטר, כאשר קומפלקס ה-RNP ב-100 פיקומולים ו-100 פיקומולה של 72 NTODN ב-2.0 מיקרומולר. העבירו את התאים לצלחת של שש בארות ואפשרו להם להתאושש במשך 72 שעות. לאחר מכן, מיין את התאים בנפרד ל-96 לוחות באר, באמצעות ממיין fac עם לייזר 488 ננומטר עבור EGFP פלוס מינוס.

מהבארות שיש להן צמיחה, בודד gDNA תאי באמצעות ערכת בידוד DNA זמינה מסחרית. הגבירו את האזורים המקיפים את בסיס היעד באמצעות PCR. לבסוף, בצע ניתוח ריצוף DNA על הדגימות.

72 שעות לאחר ניתוח ציטומטריית זרימת הדגירה, אשר את התיקון התפקודי של חלבון פלואורסצנטי ירוק. תגובת מינון הדרגתית נצפתה כאשר הרמות המתואמות של RNP ו-72NT עולות. תגובת עריכת גנים בהיעדר חלקיק RNP, תיקנה כ-1% מהתאים הממוקדים כאשר נעשה שימוש בריכוז גבוה פי 10 של אוליגונוקלאוטיד 72NT בתגובת עריכת הגנים של סוכן יחיד.

נבחרו 16 שיבוטים של דגימות חיוביות ל-EGFP והשלמות הגנטית סביב אתר המטרה נותחה על ידי רצף DNA. כל 16 התאים החיוביים ל-EGFP הכילו את חילופי הנוקלאוטידים החזויים באתר המטרה. 15 מבודדים משובטים לא ירוקים נותחו להטרוגניות באתר המטרה.

לא נצפו חילופי בסיס DNA בכמחצית מהדגימות. שאר ההרחבות המשובטות שנבדקו, הראו אוכלוסייה הטרוגנית של מוטציות מחיקה. גודל המחיקה נע בין בסיס אחד ל-19 בסיסים.

CRISPR, Cas9 ומולקולות DNA של תורם אוליגונוקלאוטיד חד-גדילי הפועלות במקביל יכולות להוביל לתיקון מדויק של המוטציה הנקודתית בגן EGFP כפי שמודגם במודל חדש זה לתיקון מוטציות נקודתיות, מסלול מולקולרי, שבו ה-DNA של התורם ניגש לתבנית שכפול לתיקון הבסיס המוטנטי. תהליך שקראנו לו, ExACT. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום עריכת הגנים לחקור את מידת ההטרוגניות באתר המטרה, כתוצאה מפעילות עריכת גנים בשורות תאים.