ניתוח מדויק, תפוקה גבוהה של התפתחות חיידקים
19 בספטמבר 2017
הערכה כמותית של התפתחות חיידקים חיוני להבנת הפיזיולוגיה מיקרוביאלי כתופעה מערכות ברמת. פרוטוקול עבור גישה אנליטית מניפולציה ניסויית הם הציגו, המאפשר ניתוח מדויק, תפוקה גבוהה של התפתחות חיידקים, אשר הוא נושא מפתח עניין במערכות ביולוגיות.
המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לנתח צמיחה חיידקית באופן מדויק ובתפוקה גבוהה. באמצעות נוהל זה, ניתן לבחון בו-זמנית מספר מצעי גידול או זנים שונים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחומי הביולוגיה של מערכות והמיקרוביולוגיה, כגון מהם הגורמים הקובעים של צמיחת תאים.
היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא מאפשרת לחוקרים להעריך במדויק פרמטרים גלובליים של קצב גדילה מקסימלי וצפיפות אוכלוסייה מקסימלית בעקומות גדילה של תאי בקטריות. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי גדילת e. Coli, ניתן להחיל אותה גם על מיקרו-אורגניזמים אחרים, כגון במבדקי גדילה ובסריקה של בקטריות סביבתיות.
ראשית, הניחו על שולחן עבודה סטרילי חמש מבחנות זכוכית סטריליות עם פקקי סיליקון, פיפטות ואת זני המטרה. חשפו את פיית מבחנת הזכוכית ללהבת מבער בונסן לפני פתיחת פקק הסיליקון. חשפו את פקק הסיליקון ללהבה לאחר פתיחת המבחנה, ולאחר מכן החזירו את הפקק קלות על מבחנת הזכוכית.
בשלב הבא, השתמשו בפיפטה אלקטרונית ובפיפטה סרולוגית חד-פעמית כדי להוסיף 5 milliliters של M63 לאחת המבחנות הזכוכית ו-4.5 milliliters של M63 לארבע המבחנות האחרות. השתמשו בטיפ p200 כדי לדגום מושבה ולהחדירה למבחנת הזכוכית המכילה 5 milliliters של M63. ערבבו את המבחנה ב-Vortex כדי ליצור תרחיף.
לאחר מכן, דללו את התמיסה פי 10 על ידי העברת 0.5 milliliters של תמיסה זו לאחת מארבע המבחנות המכילות 4.5 milliliters של M63. חזרו על תהליך זה עבור שאר המבחנות. לאחר עיקור פתחי המבחנות הזכוכית ופקקי הגומי הסיליקוני, סגרו את המבחנות באמצעות הפקקים.
לאחר מכן, הניחו את חמשת המבחנות באינקובטור רועד שחומם מראש ל-37 degree celsius ובצעו ערבול במהירות של 200 rpm. דגרו את התרבית למשך לילה או למשך 10 עד 30 שעות. לאחר הדגירה, העבירו 1, 000 microliters של M63 לקובטה חד-פעמית באמצעות p1000.
הנח את הקובטה החד-פעמית בספקטרופוטומטר. הפעל את התוכנית באורך גל קבוע של 600 nanometers ומדוד את הדגימה הריקה (blank). העבר את חמשת מבחנות הזכוכית מהאינקובטור המנער אל שולחן העבודה הסטרילי (clean bench).
שפכו את M63 מהקיובטה החד-פעמית והוסיפו 1,000 µL תרבית לאותה קיובטה חד-פעמית באמצעות p1000. לאחר מכן, מדדו את העכירות האופטית של תרבית התאים. בשלב הבא, הוסיפו 250 µL של תמיסת גליקרול 60% סטרילית ו-750 µL מתרבית התאים שנבחרה למיקרוטוב של 1.5 mL ועבדו מערבוב באמצעות פיפוט.
הניחו את תשעת המיקרו-מבחנות הנותרות במעמד המיקרו-מבחנות וחלקו 100 µL מהתערובת שהוכנה לכל מבחנה. אחסנו את מלאי החומרים במקפיא העמוק ב-80 °C. כדי להגדיר את קורא המיקרו-פלטה, פתחו תחילה את התוכנה, פתחו את הפרוטוקולים (protocols) במנהל המשימות ובחרו ביצירה חדשה (create new).
לאחר מכן, בחרו בפרוטוקול סטנדרטי. פתחו את ההליך והתאימו את ההגדרות. פתחו את הגדרת הטמפרטורה ובחרו ב-incubator on.
לאחר מכן, הגדירו את הטמפרטורה ל-37 °C ואת הגרדיאנט ל-0 °C. בדקו את החימום המקדים (preheat) לפני ההמשך לשלב הבא. פתחו את Start Kinetic והגדירו את זמן ההרצה ל-24 או 48 דקות, ולאחר מכן הגדירו את המרווח ל-30 דקות או שעה אחת.
פתחו את תפריט הניעור (shake) והגדירו את מצב הניעור כליניארי. סמנו ניעור רציף (continuous shake) והגדירו תדירות של 567 cpm. לאחר מכן, פתחו את תפריט הקריאה (read), וסמנו absorbence, endpoint/kinetic ו-monochromators.
הגדירו את אורך הגל ל-600. לבסוף, לחצו על validate כדי לאשר שהפרוצדורה נכונה, ולחצו על save כדי לשמור אותה כתוכנית חדשה לשימוש עתידי.
להקלטה של גדילה בזמן אמת, הוסיפו כ-25 milliliters של M63 למאגר ריאגנטים שעקר. לאחר מכן, הוסיפו 900 microliters של M63 למיקרוטובות כהכנה לביצוע דילולות סדרתיות. בשלב הבא, הוסיפו 900 microliters של M63 למלאי הגליצרול שהופשר ובצעו ערבוב במערבל וורטקס (vortex).
העבירו 100 µl של הדילול פי 10 למיקרוטוב אחר המכיל 900 µl של M63 וערבבו במערבל Vortex. חזרו על שלב זה עד להשגת מספר הדילול הרצוי. כעת, מלאו את הבארות בקצוות של מיקרופלט סטרילי בעל 96 בארות וקרקע שטוחה עם 200 µl של M63, באמצעות פיפט רב-ערוצי בעל שמונה ערוצים.
העבירו 200 µL מכל דגימה מדוללת לבארות המיקרופלטה בהתאם לטבלת הייחוס. כדי למנוע שכבות הקצאה הנובעות מהחימום ומנצילות הזריעה, אין להשתמש בבארות שבשולי המיקרופלטה עבור הדגימות, ויש להעביר את אותה דגימה למספר בארות במיקומים שונים על פני המיקרופלטה. הניחו את המיקרופלטה בעלת 96 הבארות בתוך קורא הפלטות.
פתחו את ReadNow ואת מנהל המשימות ובחרו את התוכנית. לחצו על אישור כדי להתחיל במדידה. לבסוף, שמרו את ההקלטה כקובץ ניסוי חדש לצורך ניתוח נתונים.
מוצגת כאן דוגמה לטבלת ייחוס שהוכנה לפני ביצוע הניסוי. פיקטוגרמה של פלטת 96 בארות שורטטה כטבלה של 8 על 12 כדי לציין את מיקומי דגימות התרבית שהוחדרו לפלטת ה-96 בארות. קצב הצמיחה מחושב על ידי החלת המשוואה על כל הזוגות של ערכי OD600 עוקבים.
הממוצע וסטיית התקן של חמישה קצבי גדילה עוקבים חושבו כדי להעריך את קצב הגדילה המקסימלי. קצבי הגדילה של סך של 60 תרביות תאים מוצגים במפת החום המוצגת. מעבר מצבע לבן לאדום מעיד על קצבי גדילה מהנמוך לגבוה.
ברגע שתשלטו בטכניקה זו, ניתן לבצעה תוך מספר דקות אם היא מבוצעת כראוי ובסדר הנכון. לאחר צפייה בסרטון זה, תגמירו להבנה טובה של אופן הכנת הדגימות והטענתן למיקרופלט למדידות מדויקות מאוד של צמיחה בקטריאלית באופן בעל תפוקה גבוהה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להכין טבלת ייחוס לפני ביצוע הניסוי כדי למנוע תרביות תאים בדחיפות נמוכה ולהבטיח שהתאים יתחילו לצמוח תוך 24 שעות.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות נוספות כגון אוטומציה של מניפולציות ניסוייות וניתוח חישובי, וזאת כדי לענות על שאלות נוספות, כגון מהם הגורמים הקובעים עבור תפוצת האוכלוסייה והדינמיקה שלה. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחומי הביולוגיה של מערכות והמיקרוביולוגיה, במטרה לחקור את העקרונות הבסיסיים בצמיחת תאים ולהבטיב את הרכבי מצעי התרבית.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לאנליזה מדויקת ובספיקת גבוהה של צמיחה חיידקית, שהיא קריטית להבנת פיזיולוגיה מיקרוביאלית. השיטה מאפשרת בדיקה סימולטנית של מצעים מרובים או זנים שונים, ומספקת תובנות לגבי גורמי מפתח המשפיעים על צמיחת תאים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- פיזיולוגיה מיקרוביאלית
- ביולוגיה של מערכות
- מיקרוביולוגיה
רקע
- הבנת הצמיחה הבקטריאלית חיונית לפיזיולוגיה של מיקרואורגניזמים.
- ניתוח בסביעות גבוהה (High-throughput analysis) מאפשר הערכה של פרמטרי צמיחה.
- ניתן ליישם שיטה זו על מיקרואורגניזמים שונים.
- היא מסייעת במתן תשובה לשאלות יסודיות במיקרוביולוגיה.
מטרת המחקר
- לניתוח מדויק של צמיחה בקטריאלית.
- להערכת פרמטרים גלובליים של קצבי צמיחה וצפיפות אוכלוסייה.
- לספקים תובנות לגבי צמיחת E. coli ומיקרואורגניזמים אחרים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מניפולציה ניסויית של תנאי גידול חיידקים.
- טכניקות ניתוח בסביבת תפוקה גבוהה (High-throughput).
- בדיקה סימולטנית של זנים ומצעי גידול מרובים.
- הערכת עקומות גידול של חיידקים.
תוצאות עיקריות
- הערכה מדויקת של שיעורי הצמיחה המקסימליים שהושגו.
- הערכה של צפיפות האוכלוסייה המקסימלית בעקומות צמיחה.
- תובנות שנרכשו לגבי הגורמים הקובעים את הצמיחה הבקטריאלית.
- היתכנות ליישום בסריקת בקטריות סביבתיות.
מסקנות
- השיטה משפרת את ההבנה של דינמיקת הצמיחה המיקרוביאלית.
- היא מספקת מסגרת למחקרים עתידיים בביולוגיה של מערכות.
- פוטנציאל ליישומים רחבים יותר במחקרים מיקרוביולוגיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח סמיכות גבוהה של צמיחת חיידקים מאפשר הערכה מהירה של כשירות זנים ואופטימיזציה של מצעי גידול, ובכך תומך בתיקוף של מטרות בשלבים מוקדמים של גילוי חומרים אנטימיקרוביאליים. כימות מדויק של קצב הצמיחה וצפיפות האוכלוסייה מספק ביטחון ניבוי להפחתת סיכונים עבור מועמדים מובילים בקווי פיתוח הממוקדים במיקרוביולוגיה. שיטה זו נותנת מענה לצורך בסינון פנוטיפי שניתן להרחבה ולשחזור במחקר של ביולוגיה של מערכות ומיקרוביולוגיה תרגומית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי מדידת קצב הצמיחה המקסימלי כמדד לכשירות תאית תחת תנאים גנטיים או סביבתיים משתנים.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות השוואה בסביבה של תפוקה גבוהה בין זני פרא (wild-type) לזנים מוטנטיים על פני הרכבי מצעים מרובים.
- ערך חיזוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי כימות של תיאום תפקודי גנים התלוי בצמיחה, ובכך מפחית עמימות מכניסטית בבחירת מטרות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנה של מאגרי חיידקים מאושרים לסטנדרטיזציה של בדיקות הניתנות לשחזור, להבטחת קריאות עקביות המבוססות על OD600 לאורך קמפיינים של סריקה.
- ערך תפעולי: שימוש בפורמט של פלטת 96 בארות המאפשר בדיקה מקבילה ובקנה מידה רחב של עשרות זנים או תנאים עם צריכת ריאגנטים מינימלית.
- מוכנות הבדיקה: יצירת עקומות גדילה זמניות מפורטות המשפרות את מהימנות הסריקה על ידי לכידת שלבי הפיגור (lag), השלב האקספוננציאלי והשלב הסטציונרי לצורך אישור פגיעות (hits).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רצף תרגומי: מקשר בין פנוטיפים של צמיחה בשלב הגילוי למודלים פרה-קליניים, תוך שמירה על נאמנות מערכתית רלוונטית למחלה בחיידקים סביבתיים ופתוגניים.
- קידום מותאם סיכון: תומך בהחלטות go/no-go על ידי קישור קינטיקת צמיחה לארגון מחדש של התרנסקריפטום ולמגמות כשירות (fitness) ברחבי הגנום.
- הפחתת סיכון מכניסטית: מתמקד בביטחון חיזוי במסלולים תלויי-צמיחה במקום בתוצאות קליניות, בהלימה למטרות הפחתת סיכונים בשלב מוקדם.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות בביולוגיה מוקדמת ועד להכנת בדיקות (assays) לזיהוי מובילים (lead identification), במיוחד בתוכניות המכוונות לאנטימיקרוביאליים ולמיקרוביום.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על ידי מתן אפשרות להשוואה מדויקת של דינמיקת צמיחה בין ביטולי גנים (knockouts), גרסאות שונות של פרומוטורים או תנאי עקה.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקות באמצעות מדידות OD600 סטנדרטיות, הכנה הדירה של תמיסות אם ופלט נתונים קינטיים לצורך תיקוף פגיעות (hit validation).
- אנליזה: מספקת פלטים כמותיים — קצב צמיחה מקסימלי וצפיפות אוכלוסייה — המאפשרים השוואה סטטיסטית של תנאים וביצועי זנים.
- מחקר תרגומי: מקשר לרצף פרה-קליני באמצעות שימוש בחיידקים ובמדיות רלוונטיות לסביבה המדמות תנאים פיזיולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה הדירה לאפיוני צמיחה בין פרויקטים, מה שמפחית פיתוח כפול של פרוטוקולים ומאפשר התאמה של נתונים בין צוותים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי באישור המטרה, הפחתת עמימות מכניסטית במסלולים הקשורים לצמיחה.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה של מדידות צמיחה על פני זנים ומצעי גידול שונים.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשך התקדמות או עצירה (go/no-go), יעילות הון באמצעות בדיקות מקבילות והפחתת סיכון ביולוגי בתוכניות מוקדמות לאנטימיקרוביאליים.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעוד עדיפויות מותאם סיכון המבוסס על נתוני כשירות צמיחה, המאפשר קידום של זנים בעלי פרופילים פנוטיפיים חסונים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוביולוגיה בטכניקה סטרילית, הכנת תמיסות סטוק וכיול OD600.
- תלוי בקורא מיקרו-פלייטים עם בקרת טמפרטורה, יכולת ניעור וקריאת בליעה קינטית ב-600 nm.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של טבלאות ייחוס, פרוטוקולי דילול ומיקום בארות כדי למנוע אפקטי שוליים.
- שיקולי התאמה כוללים התאמה של צפיפות האינוקולום והרכב המצע עבור זנים בעלי צמיחה איטית או דרישות תזונתיות קפדניות.
- מגבלה מעשית: סף גילוי מחמיר יותר בצפיפויות אוכלוסייה נמוכות בהשוואה ל-CFU, דבר המחייב אינוקולום מספיק לקבלת אות אמין.
