Name: DNA פולימראז פעילות Assay באמצעות DNA שכותרתו פלורסנט-סגול, דמיינו ידי אקרילאמיד אלקטרופורזה בגל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: חקור פעילות DNA פולימראז ברמת נוקלאוטיד בודד באמצעות אלקטרופורזה בג'ל אקרילאמיד ודמיינו פלורסצנטי. שיטה זו מאפשרת תצפית מדויקת של שינויים ב-DNA ומסייעת לזהות מגבלות בסינתזת DNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי חברת מחקר לקידום מדעי (Cottrell המכללה מלומד פרס #22548) ועל ידי מנרב TriLink (ResearchReward גרנט #G139).

<ol><li>Ong, J. L., Loakes, D., Jaroslawski, S., Too, K., Holliger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+DNA+polymerase%2C+RNA+polymerase+and+reverse+transcriptase+activity+in+a+single+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide.</a> J Mol Biol. 361 (3), 537-550 (2006).</li>
<li>Chen, T., Romesberg, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+polymerase+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Directed polymerase evolution.</a> FEBS letters. 588 (2), 219-229 (2014).</li>
<li>Leconte, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+DNA+polymerases+for+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of DNA polymerases for next-generation sequencing.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (34), 5921-5924 (2010).</li>
<li>Xia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+novel+polymerase+activities%3A+mutation+of+a+DNA+polymerase+into+an+efficient+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of novel polymerase activities: mutation of a DNA polymerase into an efficient RNA polymerase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (10), 6597-6602 (2002).</li>
<li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+thermophilic+DNA+polymerases+for+the+recognition+and+amplification+of+C2%27-modified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem%22%5BJournal%5D)">Evolution of thermophilic DNA polymerases for the recognition and amplification of C2'-modified DNA.</a> Nat Chem. 8 (6), 556-562 (2016).</li>
<li>Thirunavukarasu, D., Chen, T., Liu, Z., Hongdilokkul, N., Romesberg, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+2%27-Fluoro-Modified+Aptamers+with+Optimized+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Selection of 2'-Fluoro-Modified Aptamers with Optimized Properties.</a> J Am Chem Soc. 139 (8), 2892-2895 (2017).</li>
<li>Taylor, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalysts+from+synthetic+genetic+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Catalysts from synthetic genetic polymers.</a> Nature. 518 (7539), 427-430 (2015).</li>
<li>Alves Ferreira-Bravo, I., Cozens, C., Holliger, P., DeStefano, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+2%27-deoxy-2%27-fluoroarabinonucleotide+%28FANA%29+aptamers+that+bind+HIV-1+reverse+transcriptase+with+picomolar+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Selection of 2'-deoxy-2'-fluoroarabinonucleotide (FANA) aptamers that bind HIV-1 reverse transcriptase with picomolar affinity.</a> Nucleic Acids Res. 43 (20), 9587-9599 (2015).</li>
<li>Schultz, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taq+DNA+Polymerase+Mutants+and+2%27-Modified+Sugar+Recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Taq DNA Polymerase Mutants and 2'-Modified Sugar Recognition.</a> Biochemistry. 54 (38), 5999-6008 (2015).</li>
<li>Rosenblum, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+discovery+of+new+combinations+of+mutant+DNA+polymerases+and+modified+DNA+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Design and discovery of new combinations of mutant DNA polymerases and modified DNA substrates.</a> Chembiochem. 18 (8), 816-823 (2017).</li>
<li>Creighton, S., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel+kinetic+analysis+of+DNA+polymerase+fidelity+in+the+presence+of+proofreading+using+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Gel kinetic analysis of DNA polymerase fidelity in the presence of proofreading using bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> J Biol Chem. 270 (9), 4759-4774 (1995).</li>
<li>Joyce, C. M., Benkovic, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+fidelity%3A+kinetics%2C+structure%2C+and+checkpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase fidelity: kinetics, structure, and checkpoints.</a> Biochemistry. 43 (45), 14317-14324 (2004).</li>
<li>Leconte, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterization%2C+and+optimization+of+an+unnatural+base+pair+for+expansion+of+the+genetic+alphabet%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterization, and optimization of an unnatural base pair for expansion of the genetic alphabet.</a> J Am Chem Soc. 130 (7), 2336-2343 (2008).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li>
<li>Karger, B. L., Guttman, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2782523/">DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis.</a> Electrophoresis. 30 (Suppl 1), S196-S202 (2009).</li>
<li>Lawyer, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+expression%2C+purification%2C+and+enzymatic+characterization+of+full-length+Thermus+aquaticus+DNA+polymerase+and+a+truncated+form+deficient+in+5%27+to+3%27+exonuclease+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5' to 3' exonuclease activity.</a> PCR Methods Appl. 2 (4), 275-287 (1993).</li>
<li>Lawyer, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterization%2C+and+expression+in+Escherichia+coli+of+the+DNA+polymerase+gene+from+Thermus+aquaticus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus.</a> J Biol Chem. 264 (11), 6427-6437 (1989).</li>
<li>Carroll, S. S., Cowart, M., Benkovic, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutant+of+DNA+polymerase+I+%28Klenow+fragment%29+with+reduced+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A mutant of DNA polymerase I (Klenow fragment) with reduced fidelity.</a> Biochemistry. 30 (3), 804-813 (1991).</li>
<li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat Biotechnol. 26 (10), 1135-1145 (2008).</li>
<li>Larsen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+strategy+for+expanding+polymerase+function+by+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A general strategy for expanding polymerase function by droplet microfluidics.</a> Nat Commun. 7, 11235(2016).</li>
<li>Cozens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+Synthesis+of+Nucleic+Acids+with+Defined+Regioisomeric+2%27-5%27+Linkages%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Enzymatic Synthesis of Nucleic Acids with Defined Regioisomeric 2'-5' Linkages.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 54 (51), 15570-15573 (2015).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

. הנה, תארנו assay כדי לאפיין את הסינתזה בתיווך DNA פולימראז של M-DNA. באמצעות אינפרא אדום הקרוב תחל דנ א שכותרתו ולאחר שימוש בג'ל לזיהוי denaturing כדי לפתור oligonucleotides בגודל שונה, אפשר להשיג רזולוציה נוקלאוטיד יחיד ב- oligonucleotides, מאפשר מדידה מדויקת של סינתזה. גישות אלה ניתן למדוד גם את הפעילות הכוללת של האנזים (סעיף 2.1) או למדוד את הפרמטרים קינטיקת מיכאליס-מנטן של צעדים בודדים (שים לב בעקבות צעד 2.1). המעבדה שלנו לאחרונה שימש את שניהם לאפיין אנזימים בעבר מפותחת9 וכן באופן רציונלי מה...

ה-DNA polymerases לבצע לסינתזת DNA מדויק ויעיל, חיוני לשמירה על תקינות הגנום. היכולת שהמנגנון מאות נוקלאוטידים בשנייה ובלי שגיאות גם עושה כלים חיוניים polymerases DNA ביולוגיה מולקולרית וביוטכנולוגיה. עם זאת, מאפיינים אלה גם להגביל את היישומים של סובסטרטים M-DNA; באופן כללי, polymerases DNA טבעי אינו יכול לסנתז סובסטרטים רבים מ- DNA ערך פוטנציאלי, ככל הנראה בשל כדי לחץ סלקטיבי גבוה נגד שימוש תקני מצעים ויוו. קבוצות רבות פיתחו גישות אבולוציה מכוונת ליצירת מוטציה polymerases DNA מסוגל M-DNA סינתזה1,2,3,4,5; מאמצים אלה הרחיבו את התועלת ביוטכנולוגי של ה-DNA-6,-7,-8.
כדי להעריך את היכולת של מוטציה polymerases DNA לסנתז M-DNA, אנחנו9,10, ועוד11,12,13 בדרך כלל להשתמש במבחנה מדידות של דנ א פעילות פולימראז, אשר מתוארים בכתב היד. בניסויים אלה, DNA polymerases הם incubated משותפת עם תוויות פריימר/תבנית דופלקס ותערובות טריפוספט nucleoside; המוצרים מוערכים על ידי אלקטרופורזה בג'ל. בהתאם ספציפי השאלה ניסיוני, מוטציה DNA polymerases, תחל ששונה, תבניות ששונו או ששונה nucleoside triphosphates יכול לשמש, הפעלת האבחון הביוכימי שיטתית של פעילות האנזים מוטציה.
מבחינה היסטורית, מבחני האלה צריכים לסמוך על 5' רדיואקטיבי בתווית כדי לעקוב אחר לסינתזת DNA; בדרך כלל, היו בשימוש 32P ו- 33P; בדרך כלל, תיוג מושגת באמצעות T4 polynucleotide קינאז11. עם זאת, עקב סופיים שלמים עלות גבוהה יחסית רדיואקטיבי תוויות וסילוק בטוח שלהם, הקבוצה שלנו משתמש במקום זאת סינתטי 5'-סגול fluorophore הנקרא DNA. שימוש של imager ג'ל-סגול בעלות נמוכה יחסית, הבחנו דומה זיהוי גבולות. מחקרים קודמים באמצעות תוויות רדיואקטיבי (שלא פורסמו תוצאות). אנחנו בהצלחה שפירטתי בעבר תצפיות9, לא הבחנו הבדל כמותי גדול עם קצב בעבר נמדד קבועים (שלא פורסמו תוצאות).
כדי לנתח את הגודל של ה-DNA, וכך, היקף לסינתזת DNA, אנו מסתמכים על לזיהוי ג'ל אלקטרופורזה שיטות שפותחו במקור עבור רצף סנגר14 לפני כניסתו של נימי אלקטרופורזה15. המרחק של ההפרדה או ניידות יכול לשמש יחידת מידה משקל מולקולרי; פורמט גדול, ג'לים לזיהוי אנכי ניתן להשיג רזולוציה נוקלאוטיד יחיד, המאפשרים תצפית כמותית של ה-DNA oligonucleotides באורכים משתנים.
באופן קולקטיבי, הניסויים האלה הם שיטה חזקה אפיון פולימראז. לאור הזמן הרגיש של תגובות, הכנה וטיפול הכרחי להשגת תוצאות לשחזור. עוד יותר, ואילו הג'ל אקרילאמיד היא דרך יעילה מאוד למדוד לסינתזת DNA, כמו גם רבים אחרים DNA שינוי תגובות, עם רזולוציה נוקלאוטיד יחיד, זה יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית. פרוטוקול כאן בתקווה תאפשר למשתמשים לבצע ניסויים אלה תוך הימנעות הטעויות הנפוצות ביותר.

<table><tbody><tr><td>Tris HCl</td><td>Promega</td><td>H5123</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Promega</td><td>H5131</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>אצטילציה BSA</td><td>Promega</td><td>PR-R3961</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (כלומר DTT)</td><td>מוצרי מחקר בינלאומיים</td><td>D11000</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (כלומר EDTA) (תמיסה של 0.5M)</td><td>Sigma</td><td>03690-100mL</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Acros</td><td>AC42374-5000</td><td></td></tr><tr><td>Orange G</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O3756</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-701-6973</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>FERR0191</td><td></td></tr><tr><td>M-dNTPs (riboNTPs)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>45-001-341 (343, 345, 347)</td><td></td></tr><tr><td>M-dNTPs (כל שאר NTPs ששונו)</td><td>TriLink Biotechnologies</td><td>פריימר מגוון</td><td></td></tr><tr><td>1</td><td>IDT DNA / TriLink Biotechnologies</td><td>סינתזות מותאמות</td> <td>אישיתאנו משתמשים בצבע IR700 שניתן לרכוש כסינתזה מותאמת אישית. בדרך כלל אנו רוכשים את האוליגונוקלאוטידים HPLC מטוהרים. הרצף הוא תבנית 5'-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA</td></tr><tr><td>1</td><td>IDT DNA / TriLink Biotechnologies</td><td>סינתזות מותאמות אישית</td><td>אנו בדרך כלל רוכשים את האוליגונוקלאוטידים HPLC מטוהרים. הרצף הוא 5'-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCTATAGTGAGTCGTCGTATTA</td></tr><tr><td>אקרילאמיד</td><td>מוצרי מחקר בינלאומיים</td><td>A11405</td><td>38.67% אקרילאמיד ו-1.33% ביס-אקרילאמיד</td></tr><tr><td>Tris/Borate/EDTA (TBE) מוצק</td><td>מוצרי מחקר בינלאומי</td><td>T22020</td><td></td></tr><tr><td>אוריאה אולטרה-טהורה</td><td>מוצרי מחקר בינלאומיים</td><td>U20200</td><td></td></tr><tr><td>סרט ג'ל</td><td>CBS מדעי</td><td>GT-72-10</td><td></td></tr><tr><td>מהדק קפיץ לבן גדול פוליפרופילן</td><td>CBS Scientific</td><td>GPC-0001</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום פרסולפט (APS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP179</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP15020</td><td></td></tr><tr><td>מרווחים 0.75 מ"מ</td><td>CBS Scientific</td><td>SGS-20-0740A</td><td></td></tr><tr><td>33x42 סט צלחות זכוכית מחורצות</td><td>CBS Scientific</td><td>SGP33-040A</td><td></td></tr><tr><td>מפריד צלחות טריז</td><td>CBS Scientific</td><td>WPS-100</td><td></td></tr><tr><td>מסרק לאלקטרופורזה ג'ל</td><td>CBS Scientific</td><td>SG33-0734</td><td></td></tr><tr><td>אסדת אלקטרופורזה ג'ל</td><td>CBS Scientific</td><td>SG-400-33</td><td></td></tr><tr><td>מים</td><td></td><td></td> טהורים <td>במיוחד אנו משתמשים במערכת Milli-Q</td></tr><tr><td>מפולימראזות</td><td></td><td></td> <td>DNA של Milliporeאנו מכינים אותם במעבדה שלנו באמצעות פרוטוקולים שפורסמו.</td></tr></tbody></table>

dna פולימראז פעילות assay באמצעות dna שכותרתו פלורסנט-סגול, דמיינו ידי אקרילאמיד אלקטרופורזה בג'ל

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

עבור כל אנזים, שיטות חזקות, כמותיים נדרשים עבור אפיון של אנזימים הן מקומיים והן מהונדסים. עבור ה-DNA polymerases, לסינתזת DNA ניתן לאפיין באמצעות של במבחנה DNA סינתזה assay ואחריו לזיהוי בג'ל. המטרה של זה וזמינותו היא לכמת סינתזה של דנ א טבעי והן שהשתנו דנ א (M-DNA). גישות אלה שימושיים במיוחד ליישוב oligonucleotides עם רזולוציה נוקלאוטיד יחיד, המאפשרים תצפית של צעדים בודדים במהלך סינתזה oligonucleotide אנזימטיות. שיטות אלה הוחלו על ההערכה של מערך של ומאפייני הביוכימי biophysical כגון מדידת מצב יציב קצב קבועים של צעדים בודדים של סינתזת ה-DNA, שיעור שגיאה לסינתזת DNA, זיקה מחייבת את הדנ א. באמצעות שינוי רכיבים כולל, אך לא מוגבל, ששונה nucleoside triphosphates (NTP), מ- DNA ו/או מוטציה DNA polymerases, התועלת היחסית של המצע-DNA פולימראז זוגות ניתן להעריך בצורה יעילה. כאן, אנו מפרטים את הבדיקה עצמה, כולל השינויים חייבים להיעשות כדי להכיל את הדנ א תחל אנרגטיקה תיוג אסטרטגיות כגון-סגול fluorescently הנקרא DNA. בנוסף, שתוארו הצעדים הטכניים מכריע עבור ג'ל אקרילאמיד מוזג, פועל, אשר לעתים קרובות ניתן טכנית מאתגר.

ניתוח מוצלח לזיהוי ג'ל של אפיון איכותי של פעילות הכוללת (המתוארת בסעיף 2.1, איור 1) ושל קינטיקה מצב יציב (המתואר בפתק המסקנה של סעיף 2.1, איור 2) מוצגים. ניתוח לא מוצלח לזיהוי ג'ל מוצג גם (איור 3).
שימו לב כי אין סולם זמין מסחרית או סמן מולקולרי משמש. לעיתים, אנו נשתמש בשילוב פולימראז ידוע-המצע ליצירת סמן מולקולרי; עם זאת, חשוב לציין שיש נו...

פרוטוקול זה מתאר את האפיון של ה-DNA פולימראז סינתזה של דנ א שונה דרך התבוננות שינויים-סגול fluorescently שכותרתו הדנ א באמצעות אלקטרופורזה בג'ל ג'ל הדמיה. ג'לים אקרילאמיד משמשים עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של ההפרדה של חומצות גרעין קצר, אשר נודדים בקצב שונה בהתאם לגודל.

DNA פולימראז פעילות Assay באמצעות DNA שכותרתו פלורסנט-סגול, דמיינו ידי אקרילאמיד אלקטרופורזה בג'ל

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לנתח את פעילות ה-DNA polymerase ברמה של נוקלאוטיד בודד. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום ה-DNA polymerase, כגון אילו שלבים ספציפיים של סינתזת DNA מוגבלים על ידי מודיפיקציות ב-DNA. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היכולת לצפות בשינויים של נוקלאוטיד בודד, מה שמאפשר תצפית מדויקת על פעילות ה-polymerase.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לתכנן את העבודה מראש. רבים מהשלבים הם תלויי זמן. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, הכינו תחילה את התמיסות (buffers), את תערובת ה-DNA duplex ואת דילול החלבון כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.בשלב הבא, הגדירו את הטמפרטורה של בן-מארח יבש (dry bath) ל-50 °C. הוסיפו 24 µL של תערובת הדופלקס המ annealed למבחנה של מיקרו-צנטריפוגה המכילה 25 µL של 2X dNTPs. לאחר מכן, העבירו 9.8 µL מתערובת זו למבחנה של מיקרו-צנטריפוגה המכילה 20 µL של quenching buffer orange כדי להכין את בקרת העדמות האנזים (no enzyme control).לאחר מכן, הוסיפו 0.8 µL של אנזים בריכוז 50X לתערובת ה-dNTP הכפולה (duplexed). השתמשו בפיפט לנפח גדול כדי לערבב את התמיסה ביסודיות. הדגירו במקלחת יבשה (dry bath).עצרו את התגובה על ידי הסרה של 10 µL מכל תערובת תגובה והוספתה למבחנת מיקרו-צנטריפוגה המכילה 20 µL של תמיסת עצירה (quenching buffer) כתום. הכינו את תערובת האקרילאמיד לאלקטרופורזה של ג'ל כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, רחצו היטב שתי פלטות ג'ל בגודל 33 סנטימטר על 42 סנטימטר בעזרת סבון ומים.ייבשו כל פני פלטה בעזרת נייר סופג ולאחר מכן השתמשו במטייות עדינות (delicate task wipers) כדי לייבש את השטחים שנותרו. שטפו את הפלטות המיובשות ב-70% ethanol ונגבו כל אחת מהן שוב בעזרת מטייות. לאחר מכן, העבירו יד עם כפפה תחת מים דה-יוניים (deionized water) והרטיבו בעדינות מספר ספייסרים (spacers) של 0.75 millimeter בעזרת האצבעות הרטובות.מקמו את המרווחים לאורך קצה הפלטה עם החריצים. השתמשו בנייר סופג כדי לנקות מים שעשויים להיות נשפכים על הפלטות. הצמידו את הפלטות זו לזו ולאחר מכן השתמשו בסרט ג'ל כדי לכסות את התחתית והדפנות, והשאירו את החלק העליון ללא סרט.וודאו שהסרט מיושר באופן אחיד ואטום היטב. בעזרת תער, חתכו את קצות הסרט. לאחר מכן, הוסיפו שכבת סרט נוספת לתחתית הג'ל.לאחר הכנת الريאגנטים, קבלו בקבוק נטף והסירו את המשפך המחודד. בעזרת משורה, הוסיפו 125 milliliters של מים. לאחר מכן, השתמשו בטוש קבוע כדי לסמן את גובה המים על הדופן החיצונית של הבקבוק.שפכו את המים. לאחר מכן, הכינו את טבעות השמיכה וה"סנדוויץ'" של הפלטה לצד כיור כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. הניחו את בקבוק הריסוס הריק ואת תמיסות ה-APS וה-TEMED שהוכנו בצדו השני של הכיור.הניחו בסביבה מסרק באר עם מספר הבארים הרצוי וארבעה תפסנים. לאחר מכן, מלאו בקבוק נטף בתמיסת ג'ל acrylamide 20% עד להגעה לרמה המסומנת. בו-זמנית, הוסיפו 120 microliters של TEMED ו-600 microliters של APS לתמיסת ג'ל הפוליאקרילאמיד.הוסיפו במהירות 600 µL נוספים של APS. סגרו במהירות את בקבוק הריסוס וערבבו על ידי סיבוב. לאחר מכן, הניחו את ה"סנדוויץ'" של הפלטה בתוך הכיור.התחילו במזיגה, תוך הפעלת לחץ איטי ועקבי על הבקבוק כדי להבטיח זרימה רציפה של תמיסת הג'ל. מזגו עד שהג'ל יגיע לאזור השקע ויגלוש מעט מקצה השקע. היטו את הפלטות כדי להוציא בועות אוויר.לאחר מכן, הוסיפו את מסרק הבארות למבנה הסנדוויץ' של הפלטה. הניחו את התופסנים על המסרק כך שילחצו למטה כדי להבטיח פיזור אחיד של הבארות. השליכו במהירות את שאריות תמיסת הג'ל בבקבוק התזית למכל פסולת מתאים.שטפו שלוש פעמים עם מים דה-יוניים באמצעות פיית הזרקה כדי לנקות את הבקבוק. כדי להתחיל, הסירו את כל תפסני הנייר מהסנדוויץ' של הפלטה. בעזרת סכין גילוח, חתכו והסירו את סרט הג'ל מהקצוות.נגבו את משטחי הזכוכית בעזרת נייר סופג ומים כדי לנקות כמה שיותר משאריות של ג'ל פולימרי. השתמשו בסכין גילוח לאורך הקצוות כדי לגרד שאריות ג'ל שנותרו. לאחר מכן, דחפו את מסרק הבארים באופן אחיד משני הצדדים כדי להוציאו.בעזרת תער, הסיר כל שארית ג'ל במישור העליון של מבנה הסנדוויץ'. לאחר מכן, חתוך לאורך השוליים החרוצים של הפלטה. בעזרת מזרק ומים דה-יונזיים, שטוף את הבארות כדי להסיר שאריות.וודאו שניתן למלא כל באר במים ושהיא אינה חסומה על ידי ג'ל פולמרי עודף. לאחר מכן, הניחו את כריכת הפלטות בתוך המכשיר כך שהפלטה הארוכה יותר פונה כלפי חוץ והחריץ פונה פנימה. חברו את כריכת הפלטות ואת פלטת האלומיניום יחד למכשיר באמצעות תפסים.הוסיפו תפסים נוספים לחלק החיצוני של הלוחית כדי לקדם הרצה אחידה. הוסיפו תמיסת TBE buffer בכמות המספיקה בדיוק כדי לכסות את החריצים בבסיס ואת הבארות בחלק העליון. הרצו את האלקטרופורזה של הג'ל בהספק של 50 watts למשך 20 דקות כדי לחמם את הלוחיות.לאחר מכן, השתמש במזרק ובבופר TBE כדי לנקות את הבארות. חזור על השטיפה במזרק מספר פעמים כדי להבטיח שכל מלחים השאריות של הבופר הוסרו מהבארות. לאחר מכן, הגדר את הנתיבים החיצוניים ביותר בכל צד כפי שפורט בפרוטוקול הטקסט.הוסיפו שלושה µL של 95% formamide עם bromophenol blue לבארים המתאימות בג'ל. טענו את כל הדגימות והמתינו דקה עד להשקעתן. לאחר חיבור המכשיר ומקור המתח, הגדירו את ההספק לבין 50 ל-55 watts.הריצו את הג'ל למשך כשלוש שעות או עד שחזית צבע הברומופנול כחול תגיע לפחות לשני שלישים מאורך הג'ל. לאחר מכן, דגמו את הג'ל כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. במחקר זה פותחה בדיקה לאפיון סינתזה של DNA מושנה המתווכת על ידי DNA polymerase.אפיון איכותני מוצלח של הפעילות הכוללת מראה פסים בודדים המוגדרים היטב וסדירים. הפעילות נקבעת הן על פי אורך התוצרים והן על פי החלק מהפריימר המסומן שהומר לתוצרים גדולים יותר. כפי שניתן לראות, E6 ו-E5 הם האנזימים הפעילים ביותר, בעוד ש-E4 ו-E1 הם הפעילים פחות.ניתן לבצע ניתוח כמותי באמצעות קינטיקה במצב יציב (steady-state kinetics) גם באמצעות שיטות אלו. מכיוון שרק מוצרי ה-N וה-N+1 מסונתזים, ניתן לכמת את האירוע הבודד בהצלחה. ניתן להשתמש במתודולוגיה הבסיסית הזו גם כדי לחקור מספר אנזימים אחרים המשנים DNA או RNA, מלבד פולימרזים.

dna-polymerase-activity-assay-using-near-infrared-fluorescent-labeled

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

Exonucleases ממלאים תפקידים קריטיים בהבטחת יציבות הגנום. אובדן תפקוד האקסונוקלאז של WRN גורם להזדקנות מוקדמת. חקר מצעים ודרישות אחרות של הנוקלאז במבחנה יכול לעזור להבהיר את תפקידו in vivo. כאן אנו מדגימים בדיקה מבוססת פלואורסצנטית מהירה וניתנת לשחזור כדי למדוד את פעילות הנוקלאז שלו.

Assay exonuclease הקרינה מבוסס לאפיין DmWRNexo, Orthologue של האדם Progeroid WRN exonuclease, ויישומו nucleases אחר

אנו מציגים תוכנית אסטרטגית ופרוטוקול לזיהוי וריאנטים גנטיים לא מקודדים המשפיעים על קשירת ה-DNA של גורם השעתוק (TF). פרוטוקול ניסיוני מפורט מסופק לבדיקת משמרת ניידות אלקטרופורטית (EMSA) וניתוח משקעים של זיקה ל-DNA (DAPA) של קשירת TF DNA תלויה בגנוטיפ.

הקרנה עבור וריאנטים גנטיים ללא קידוד תפקודיים באמצעות ניידות Electrophoretic Shift Assay (Emsa) ו Assay משקע זיקת DNA (DAPA)

אנו מתארים כאן פרוטוקול אופטימיזציה של מבחני Electrophoretic פלורסנט Shift הניידות (fEMSA) באמצעות חלבוני SOX-2 מטוהר יחד עם בדיקות DNA שכותרתו צבע פלואורסצנטי אינפרא אדומות כמקרה מבחן כדי להתמודד עם שאלה ביולוגית חשובה.

פרוטוקול אופטימיזציה עבור Assay Shift ניידות Electrophoretic שימוש פלורסנט אינפרא אדום Oligonucleotides דיי שכותרתו

פולימרים semiflexible להציג תכונות מכניות ייחודי המוחלות בהרחבה על ידי מערכות החיים. עם זאת, מחקרים שיטתיים על biopolymers מוגבלות מאז מאפיינים כגון הפולימר קשיחות אינם נגישים. כתב יד זה מתאר איך מגבלה זו הוא מצויין לתכנות צינוריות דנ א, הפעלת ניסיוני מחקרים על ההשפעה של פילמנט קשיחות.

ה-DNA צינוריות כמו כלי רב-תכליתי ללמוד פולימרים Semiflexible

שיטה זו מאפשרת מכתים סלקטיבית, כימות של ה-DNA של ג'לים למסמס את הג'ל ירוקה SYBR אני / ניטרו Tetrazolium כחול פתרון וחשיפת אז זה אור שמש או מקור אור כחול. זה מייצר את התמיסה גלוי ודורשת כמעט ללא ציוד, שהופך אותו אידיאלי לשימוש שדה.

DNA מכתים שיטה המבוססת על משקעים Formazan הנגרם על ידי חשיפה אור כחול

פרוטוקול זה מתאר תסה לא רדיואקטיבית כדי למדוד פעילות קינאז של קינאז פולינוקלאוטיד (PNKs) על מצעי DNA ו RNA קטנים.

תרגום לא רדיואקטיבי למדוד פוספורילציה פולינוקלאוטיד של מצעי נוקלאוטיד קטנים

ננו-מכונות מבוססות DNAzyme יכולות לשמש לזיהוי סלקטיבי ורגיש ביותר של חומצות גרעין. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט לתכנון ננו-מכונות מבוססות DNAzyme עם ליבה של 10-23 המשתמשות בתוכנה חופשית ויישומן בזיהוי מקטע וירוס אפשטיין-בר כדוגמה.

DNAzyme 10-23 - ננו-מכונות מבוססות לזיהוי חומצות גרעין

כאן מוצג פרוטוקול לבדיקת אנזימים לחילוף חומרים של חומצות גרעין, תוך שימוש בדוגמאות של אנזימי ליגאז, נוקלאז ופולימראז. הבדיקה משתמשת באוליגונוקלאוטידים מסומנים פלואורסצנטית ולא מסומנים שניתן לשלב ליצירת דופלקסים המחקים נזקי RNA ו/או DNA או מתווכי מסלול, ומאפשרים אפיון התנהגות אנזימים.

שימוש באוליגונוקלאוטידים סינתטיים שעברו שינוי כדי להעריך אנזימים לחילוף חומרים של חומצות גרעין

מחקר זה מציג בדיקת FRET רציומטרית פשוטה וידידותית למשתמש לאיתור והערכה כמותית של פעילות DNase, ומדגים את יישומו בניתוח נוקלאז חלש.

הערכת פעילות DNase על ידי העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית רציומטרית

פרוטוקול זה מדגים ביצוע בדיקת מולקולה בודדת להדמיה חיה של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG. הוא מתאר (1) הכנת מצע דנ"א, (2) טיהור פלואורסצנטי המסומן כמנחת מסוקים Drosophila melanogaster CMG, (3) הכנת תא זרימה מיקרופלואידי למיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRF), ו-(4) בדיקת שחרור DNA של מולקולה יחידה.

הדמיה בזמן אמת של מולקולה בודדת של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG

פרוטוקול זה מתאר בדיקת שכפול DNA חד-מולקולה מבוססת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, המאפשרת הדמיה בזמן אמת של אינטראקציות בין פולימראזות DNA ומכשולים כגון מבני G-quadruplex.

הדמיה פלואורסצנטית של מולקולה אחת של דינמיקת DNA פולימראז ב-G-quadruplexes

חקור פעילות DNA פולימראז ברמת נוקלאוטיד בודד באמצעות אלקטרופורזה בג'ל אקרילאמיד ודמיינו פלורסצנטי. שיטה זו מאפשרת תצפית מדויקת של שינויים ב-DNA ומסייעת לזהות מגבלות בסינתזת DNA.

DNA פולימראז פעילות Assay באמצעות DNA שכותרתו פלורסנט-סגול, דמיינו ידי אקרילאמיד אלקטרופורזה בג'ל

גלה סרטונים נוספים