פרוטוקול גנרי עבור אופטימיזציה של ייצור החלבון Heterologous באמצעות טכנולוגיית Microbioreactor אוטומטיות

המטרה הכוללת של זרימת עבודה איטרטיבית זו המשלבת תכנון ניסיוני מבוסס קרינגינג וטכנולוגיית מיקרוביו-ריאקטור לתפוקת גידול מספקת היא לתאר גישה גנרית לתכנון מותאם אישית של אמצעי גידול מיקרוביאליים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום פיתוח תהליכים ביולוגיים מיקרוביאליים, כגון אופטימיזציה של אמצעי גידול, תנאי תהליכים ביולוגיים, כמו גם פנוטיפ זנים. הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כששאלנו את עצמנו אם חומרי גידול המותאמים לייצור מטבוליטים קטנים מתאימים ביותר גם לייצור חלבון הטרולוגי.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מזרזת את זמני הפיתוח הכוללים על ידי שילוב חכם של ניסוי ומידול. מי שידגים את ההליך הזה יהיה רומן יאנסן, דוקטורנט מהמעבדה שלי. התחל הליך זה עם תפיסת המחקר והגדרת השיטות כמפורט בפרוטוקול הטקסט.

עקר צלחות באר עמוקות לאחסון תמיסת מלאי על שולחן עבודה על ידי ניגוב הצלחות ב-70 אחוז אתנול ולאחר מכן ייבושן במכסה זרימה למינרית. התחל את תרבית הזרעים על ידי חיסון 50 מיליליטר של מדיום BHI המכיל 25 מיליגרם לליטר קנמיצין עם אליקוט אחד מבנק התאים העובד. הנח את כל כלי המעבדה הדרושים על שולחן העבודה הרובוטי ושפך פתרונות מלאי בכלי המעבדה המתאימים.

לאחר מכן, התחל את זרימת העבודה הרובוטית להכנת המדיה כך שהשלב האחרון, שהוא החיסון, יגיע בזמן לתחילת תרבית הזרעים. דגמו את תרבית הזרעים לאחר כשעתיים כדי לעקוב אחר הגידול על ידי מדידת הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר או OD-600. המשך לעקוב אחר הגידול בכל שעה.

לאחר כחמש שעות, התרבית מגיעה ל-O-D-600 בין שלוש לארבע, ומשמשת לחיסון התרביות העיקריות. הנח את תרבית הזרעים על שולחן העבודה של המטפל בנוזלים והמשך בפרוטוקול הכנת המדיה. אטום את לוחות המיקרוטיטר של הגידול לאחר החיסון.

לאחר מכן, הנח את הגידול האטום M-T-P במכשיר הביולקטור. לאחר מכן, התחל את פרוטוקול הטיפוח המוגדר מראש. השלך את תמיסות המלאי הנותרות בהתאם לתקנות הבטיחות הביולוגית, במידת הצורך.

לאחר מכן, זרעו את התרבות משולחן העבודה הרובוטי נקה את כלי המעבדה לשימוש חוזר לפני שתתחיל בפרוטוקול טיהור המטפל בנוזלים. עצור את התרבית הראשית לאחר זמן ריצה של 17 שעות ועבד את הנתונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

כדי לכמת את טיטר ה-G-F-P, העבירו תחילה את תרחיפי התאים מכל בארות הגידול לצינורות תגובה מוכנים מראש. לאחר מכן, צנטריפוגה את מתלי התא למשך 10 דקות במהירות מקסימלית באמצעות צנטריפוגה עליונה על ספסל כדי להשיג את הסופרנטנט החופשי מהתא. לאחר מכן, העבירו 200 מיקרוליטר מכל סופרנטנט חופשי מתא לתוך באר שחורה של 96 בארות M-T-P עם תחתית שקופה.

קרא את הקרינה הספציפית של G-F-P ב-488 ננומטר לעירור ו-520 ננומטר לאורך גל פליטה באמצעות קורא מיקרו-פלטות מתאים. לאחר מדידת הקרינה של G-F-P, ניתן להשתמש ישירות במיקרו-לוח לקביעת תכולת החלבון של הסופרנטנטים החופשיים מהתאים עם פרוטוקולים סטנדרטיים כגון בדיקת ברדפורד או B-C-A. לבסוף, המשך לניתוח נתונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

ההליך המודגם מהווה סבב אחד של ניסויים, התוצאות משמשות לתכנון סבבים נוספים עם שיפור צפוי מקסימלי של אות ה-GF. ניסויי ייחוס ממוקמים בכל סבב לניתוח שונות הנתונים וזיהוי חריגים ניסיוניים. עלילת קווי מתאר זו נותנת סקירה כללית של הליך האופטימיזציה.

ניתוח מערך הנתונים שנאסף באמצעות איטרציה שלישית חשף מגבלה של ההשפעה החיובית של מגנזיום, וזיהה טווח ריכוז אופטימלי. לכן הוחלט להרחיב עוד יותר את טווח הריכוזים רק עבור סידן באיטרציה 4. ההליך חזר על עצמו פעמיים באיטרציה החמישית והשישית עד שנמצאה רוויה של אות ה-G-F-P.

רוויה זו מוסברת על ידי משקעים של מלח סידן לריכוזי הסידן המיושמים, שאינם זמינים לתא. האיטרציה השביעית שימשה לחקירת הגבולות ביתר פירוט. ניתן לזהות באופן אמין את טווחי הריכוז האופטימליים של רכיבי המדיה עבור אות ה-G-F הרווי באמצעות מבחן Z סטטיסטי.

הוא מציג את הרמה המזוהה כפי שנקבעה ומומחשת באמצעות ארגז הכלים של ערכת קרינגינג. ארגז הכלים של ערכת Kringing זמין בחינם ומגיע עם הדרכה מפורטת המסבירה כיצד להשתמש בתכונות שלו. האופי הגנרי של הפרוטוקול המוצג מאפשר התאמות שונות, כגון חקר מארחי ביטוי מיקרוביאליים אחרים או אופטימיזציה של תכונות אחרות של חלבון המטרה, כמו דפוס גליקוזילציה או קשרי דיסולפיד.

שילוב מערכת אמבריון מגדיל את תפוקת הניסוי, מה שמאפשר חיסכון רב בזמן בעת החלפת ביו-ריאקטורים נשלטים ומושפעים לחלוטין במערכות מי שפיר, יש לקחת בחשבון את מדרגיות התוצאות. מודלים מתמטיים ותכנון ניסויים עוזרים למקסם את תוכן המידע של נתוני המדידה ביחס למטרה הנחקרת.