Name: הדמיה סופר-ברזולוציה המחסור בקרקע בתאים בתרבית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-05T08:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: למד את פרוטוקול הדמיית GSD לזיהוי חלבוני ממברנה בתאים יונקים בשיטת מיקרוסקופיית סופר-רזולוציה. שיטה זו מאפשרת שיפור פי עשרה ברזולוציה לעומת שיטות קונבנציונליות ומסייעת בחקר ביולוגיית התא וביופיזיקת ממברנות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק של AHA כדי R.E.D. (15SDG25560035). מחברים רוצה להכיר ד ר סנטנה פרננדו לשימוש של מיקרוסקופ 3D שלו לייקה SR GSD. ולעזאזל ד ר יוהנס בחביבות לספק הנוגדן FP1.

<ol><li>Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+microscopy+reveals+that+synaptotagmin+remains+clustered+after+synaptic+vesicle+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis.</a> Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).</li>
<li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+structured-illumination+microscopy%3A+wide-field+fluorescence+imaging+with+theoretically+unlimited+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13081-13086 (2005).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hell, S. W., Kroug, M. <a target="_blank" href="http://www3.mpibpc.mpg.de/groups/hell/publications/pdf/Appl._Phys._B._60_495_497.pdf">Ground-state-depletion fluorscence microscopy: A concept for breaking the diffraction resolution limit.</a> JAppl Phys B. 60 (5), 495-497 (1995).</li>
<li>Bretschneider, S., Eggeling, C., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+diffraction+barrier+in+fluorescence+microscopy+by+optical+shelving%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy by optical shelving.</a> Phys Rev Lett. 98 (21), 218103(2007).</li>
<li>Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+transcriptional+profiling+of+adult+mouse+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes.</a> J Vis Exp. (58), e3302(2011).</li>
<li>Davare, M. A., Horne, M. C., Hell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatase+2A+is+associated+with+class+C+L-type+calcium+channels+%28Cav1.2%29+and+antagonizes+channel+phosphorylation+by+cAMP-dependent+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatase 2A is associated with class C L-type calcium channels (Cav1.2) and antagonizes channel phosphorylation by cAMP-dependent protein kinase.</a> J Biol Chem. 275 (50), 39710-39717 (2000).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li>
<li>Chozinski, T. J., Gagnon, L. A., Vaughan, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twinkle%2C+twinkle+little+star%3A+photoswitchable+fluorophores+for+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Twinkle, twinkle little star: photoswitchable fluorophores for super-resolution imaging.</a> FEBS Lett. 588 (19), 3603-3612 (2014).</li>
<li>Dempsey, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja904588g">Photoswitching mechanism of cyanine dyes.</a> J Am Chem Soc. 131 (51), 18192-18193 (2009).</li>
<li>Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+Imaging+Conditions+for+Demanding+Multi-Color+Super+Resolution+Localization+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy.</a> PLoS One. 11 (7), e0158884(2016).</li>
<li>Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ThunderSTORM%3A+a+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li>
<li>Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+optical+reconstruction+microscopy-based+relative+localization+analysis+%28STORM-RLA%29+for+quantitative+nanoscale+assessment+of+spatial+protein+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization.</a> Mol Biol Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).</li>
<li>Ries, J., Kaplan, C., Platonova, E., Eghlidi, H., Ewers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+versatile+method+for+GFP-based+super-resolution+microscopy+via+nanobodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple, versatile method for GFP-based super-resolution microscopy via nanobodies.</a> Nat Methods. 9 (6), 582-584 (2012).</li>
<li>Dixon, R. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4360655/">Graded Ca2+/calmodulin-dependent coupling of voltage-gated CaV1.2 channels.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat Methods. 8 (7), 527-528 (2011).</li>
<li>Nan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+superresolution+imaging+allows+quantitative+analysis+of+RAF+multimer+formation+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18519-18524 (2013).</li>
<li>Fricke, F., Beaudouin, J., Eils, R., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One%2C+two+or+three%3F+Probing+the+stoichiometry+of+membrane+proteins+by+single-molecule+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">One, two or three? Probing the stoichiometry of membrane proteins by single-molecule localization microscopy.</a> Sci Rep. 5, 14072(2015).</li>
</ol>

המחברים יש אינטרסים מתחרים לא לחשוף.

הפיצוץ האחרונות של טכנולוגיות המאפשרות הדמיה מעבר למגבלת עקיפה הציעו חלונות חדשים לתוך המורכבות של בתרבית של תאים איתות במרחב ובזמן. טכנולוגיות אלה כוללים סערה, STED, דקל, GSD, SIM, גרסאות שונות (למשל, dSTORM, FPALM). החכמה של המדענים מאחורי טכניקות אלה אפשרה לנו לעקוף את המגבלות שהוטלו על ידי חוקי הפיסיקה המסדירים בשבירת קרני האור. למרות זה הישג ענק, כל אחת מהטכניקות הללו סוג של פשרה כדי להשיג סופר- רזולוציה הנסיעה, וככזה, יש מגבלות משלו. המצב האידיאלי זה תא ביולוגים, biophysicists שואפים הוא רגישות אופטימלית ב...

תגובות איתות סלולרי לתרגם שינוי סביבות פנימיים וחיצוניים ליזום תגובה תאית. הם לווסת את כל ההיבטים של פיזיולוגיה אנושית, הגשה הקרן הורמון שחרור נוירוטרנסמיטר, פעימות הלב, חזון, הפריה, ואת התפקוד הקוגניטיבי. שיבוש cascades איתות אלה יכולות להיות השלכות חמורות בצורה של תנאים הקשורים pathophysiological כולל סרטן, פרקינסון, אלצהיימר. במשך עשורים, ביולוגי ורפואי החוקרים השתמשו בהצלחה חלבונים פלורסנט הגששים, ביולוגיים בשילוב עם פלורסצנטיות מיקרוסקופ כמו הכלים הראשי כדי להבין את ארגון יכולות מדויקות מאלה הסלולר אותות.
נקודות החוזק של טכניקות אופטית כגון epifluorescence, וידאו, או מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (TIRF) גמורה הם שלהם רגישות, מהירות ותאימות עם תא חי הדמיה, אמנם המגבלה העיקרית שלהם רזולוציה מוגבלת עקיפה, משמעות מבנים או חלבון מתחמי קטן מ- 200-250 ננומטר לא יכול להיפתר. עם התפתחות דטרמיניסטית סופר-רזולוציה עיוני ומעשי (תאורה מיקרוסקופ (SIM2) או רזולוציה סופר סטוכסטי מובניםלמשלמיקרוסקופ דלדול פליטה מאולצת (STED1), (למשל , photoactivated לוקליזציה מיקרוסקופ (דקל3), או מצב הקרקע דלדול (GSD4,5)), רזולוציית לרוחב ו צירית במיקרוסקופ פלורסצנטיות הוארך מעבר למכשול עקיפה, על מנת של עשרות ננומטר. לכן, חוקרים עכשיו יש את היכולת לדמיין ולהבין איך חלבון הדינמיקה והארגון מתרגמת לתפקד ברמה ליד-המולקולרית ללא תחרות.
בקרקע דלדול מיקרוסקופ ואחריו החזרה בודדים מולקולה (GSDIM), או פשוט GSD כפי שהיא מכונה, עוקף את מגבלת עקיפה על-ידי הפחתת מספר בו זמנית פליטת4,fluorophores5. אור לייזר באנרגיה גבוהה משמש כדי לרגש המדגם מתויג fluorophore, להפגיז אלקטרונים עם פוטונים, להגדיל את ההסתברות הם עוברים 'ספין-סלטה', הזן את שלישיה או "כהה-המדינה" מ- עירור4. זה יעיל מכלה את מצב הקרקע, ומכאן השם 'קרקע המדינה דלדול'. המדינה שלישיה, fluorophores פולט פוטונים, הדוגמה מופיעה דימר. עם זאת, אלה fluorophores stochastically להחזיר למצב קרקע, יכול לעבור מספר הפוטונים פולטות מעברים למצב נרגש-קרקע לפני החזרה למצב שלישיה. עם פחות fluorophores פולטות בכל זמן נתון, הנפלטים פוטון התפרצויות בודדות fluorophores להיות במרחב של חנותם ברורים ממחוז fluorophores. פרץ זה של פוטונים יכול להיות בכושר עם פונקציה לפי עקומת גאוס, centroid מחושב אשר מתאים למיקום של fluorophore עם דיוק לוקליזציה התלויים מספרי הצמצם (NA) של העדשה, אורך הגל של האור משמש עירור, ויותר חשוב, המספר של פוטונים הנפלט fluorophore. מגבלה אחת של GSD היא כי, מאז רק ערכת משנה של fluorophores פולט באופן פעיל בכל עת, אלפי תמונות יש לאסוף במשך מספר דקות כדי לבנות את מפת לוקליזציה מלאה. בזמן רכישת זמן בשילוב עם הדרישה כוח לייזר גבוהה, המשמעות GSD היא יותר מתאימה לתקן במקום דגימות בשידור חי.
מאמר זה, מתאר את הכנת דוגמאות קבועות עבור הדמיה סופר-ברזולוציה מיקרוסקופיה של הממברנה, תוך-פלזמית (ER)-תושב חלבונים (לקבלת רשימה של מתכלים הדרושים ולראות ריאגנטים טבלה של חומרים). דוגמאות איך פרוטוקול זה ניתן בקלות הותאם לכמת את גודל ואת מידת קיבוץ באשכולות של L-סוג ממותגת מתח Ca2 + ערוצים (Cav1.2) sarcolemma של תאי שריר הלב, או להשתמש כדי להמחיש את ההפצה הסלולר של חדר המיון, הם הפגינו. הבנת את התפלגות וארגון מרכיבים אלה הסלולר היא חשובה ביותר בהבנת הקבלה, תרגום, ובסופו של דבר את הפונקציה של Ca רבים2 +-מפלי איתות התלויים. לדוגמה, Cav1.2 ערוצי חשובים באופן מהותי עבור צימוד, בעוד קולטן בתיווך Ca2 + השחרור מחדר המיון הוא אולי המפל איתות ביותר בכל מקום בתאים בתרבית של עירור-התכווצות.

<table><tbody><tr><td>KOH</td><td>Thermo Scientific</td><td>P250-500</td><td>לניקוי כיסוי</td></tr><tr><td>#1.5 כיסוי זכוכית כיסוי 18 x 18 מ"מ</td><td>Marienfeld Superior</td><td>0107032)</td> <td>לגידול/עיבוד/הדמיית תאים</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>BP3994</td><td>לדלל ל-1x עם מים נטולי יונים</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td>מסייע בהדבקת תאים לכיסוי</td></tr><tr><td>למינין</td> <td>זכוכיתSigma</td><td>114956-81-9</td><td>מסייע בהדבקת תאים לכיסוי זכוכית</td></tr><tr><td>בינוני 199</td><td>Thermo Scientific</td><td>11150-059</td><td>מדיה לתרבית מיוציטים חדריים</td></tr><tr><td>DMEM 11995</td><td>Gibco</td><td>11995</td><td>מדיה לתרבית תאים</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td> <td>Thermo Scientific</td><td></td><td>10437028 תוסף מדיה</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>סיגמא</td><td>P4333</td><td>מדיה תוסף</td></tr><tr><td>0.05% טריפסין-EDTA</td><td>קורנינג</td><td>25-052-CL</td><td>תמיסת תרבית תאים</td></tr><tr><td>ליפופקטמין 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>מגיב טרנספקציה חולף</td></tr><tr><td>Ca2+ ללא PBS</td><td>Gibco</td><td>1419-144</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>100% מתנול</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>A414-4</td><td>קיבוע תאים</td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד</td><td>אלקטרון מדעי המיקרוסקופיה</td><td>15710</td><td>קיבוע תאים</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SLBR6504V</td><td>קיבוע תאים</td></tr><tr><td>SEAblock</td><td>Thermo Scientific</td><td>37527</td><td>BSA או חלופות אחרות לפתרון חסימה קיימות</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>חומר ניקוי לחדירת תאים</td></tr><tr><td>ארנב אנטי-CaV1.2 (FP1)</td><td>מתנה</td><td>N/A</td><td>קיימים נוגדנים מסחריים נגד CaV1.2 כגון Alomone Labs Rb anti-CaV1.2 (ACC-003)</td></tr> <tr><td>עכבר חד שבטי נגד RFP</td><td>Rockland Inc.</td><td>200-301-379</td><td>נוגדן ראשוני</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 donket anti-rabbit IgG (H+L)</td> <td>Invitrogen (Thermo Scientific)</td> <td>A31573</td><td>נוגדן משני</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 עז נגד עכבר IgG (H+L)</td> <td>Invitrogen (Thermo Scientific)</td> <td>A11031</td><td>נוגדן משני</td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>מונע צמיחה מיקרוביאלית לאחסון לטווח ארוך של דגימות</td></tr><tr><td>קטלאז</td><td>סיגמא</td><td>C40</td><td>מרכיב מאגר מיתוג פוטו</td></tr><tr><td>גלוקוז אוקסידאז</td><td>סיגמא</td><td>G2133</td><td>מרכיב מאגר מיתוג פוטו</td></tr><tr><td>טריס</td><td>סיגמא</td><td>T6066</td><td>מרכיב מאגר מיתוג פוטו</td></tr><tr><td>בטא-מרקפטואתילאמין הידרוכלוריד</td><td>פישר</td><td>BP2664100</td><td>מרכיב מאגר מיתוג פוטו-בטא</td></tr><tr><td>;-מרקפטואתנול</td><td>סיגמא</td><td>63689</td><td>מרכיב מאגר מיתוג תמונות</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-3</td><td>מרכיב מאגר מיתוג פוטו</td></tr><tr><td>דקסטרוז</td><td>פישר</td><td>D14-212</td><td>מרכיב מאגר מיתוג תמונות</td></tr><tr><td>זכוכית שקיות</td><td>שקע Neolab</td><td>1 &ndash; 6293</td><td>להרכבת דגימות</td></tr><tr><td>Twinsil</td><td>Picodent</td><td>13001000</td><td>לאיטום זכוכית כיסוי</td></tr><tr><td>sec61&beta;- mCherry פלסמיד</td><td>Addgene</td><td>49155</td><td></td></tr><tr><td>Leica SR GSD מיקרוסקופ תלת מימד</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תמיסת</td><td></td><td></td> בלוק כביסה <td>20% SEAblock ב-PBS</td></tr><tr><td>תמיסת</td><td></td><td></td> דגירה ראשונית של נוגדנים <td>0.5% Triton-X100, 20% SEAblock, ב-PBS</td></tr><tr><td>תמיסת</td><td></td><td></td> <td>דגירה משנית של נוגדנים1:1000 ב-PBS</td></tr></tbody></table>

הדמיה סופר-ברזולוציה המחסור בקרקע בתאים בתרבית

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

ההתקדמות פלורסנט מיקרוסקופ ביולוגיה של התא הם אישית בקורלציה, עם משופרת היכולת לדמיין את הסלולר אירועים מובילים לעתים קרובות כדי קפיצות דרמטי בהבנתנו כיצד תאים פונקציה. פיתוח, הזמינות של מיקרוסקופ סופר-ברזולוציה במידה ניכרת האריך את הגבולות של רזולוציה אופטית מ ~ 250-20 ננומטר. ביולוגים מוגבלים יותר לתיאור אינטראקציות מולקולרית במונחים של colocalization בתוך אזור עקיפה מוגבלת, אלא זה עכשיו אפשר לדמיין את האינטראקציות דינמי של מולקולות בודדות. כאן, אנחנו חלוקה לרמות עבור ויזואליזציה של כימות של החלבונים פרוטוקול על ידי מיקרוסקופ הקרקע-מצב דלדול לדימות תא קבוע. אנו מספקים דוגמאות מתוך שני חלבונים ממברנה שונים, אבן יסוד של translocon רשתית תוך-פלזמית sec61β, מותאם לשפות אחרות קרום פלזמה ממותגת מתח Ca L-סוג2 + ערוץ (CaV1.2). דנו הם פרמטרים ספציפיים מיקרוסקופ, שיטות קיבוע, מיתוג צילום מאגר ניסוח, ואת החסרונות אתגרים של עיבוד תמונה.

כפי שמתועד במבוא, ישנם רבים מיקרוסקופ סופר-ברזולוציה אחרת שיטות הדמיה. פרוטוקול זה, מתמקד GSD הדמיה ברזולוציה-העל. נציג תמונות ומפות לוקליזציה מוצגים באיור 2 , איור 3.
איור 2 מציג תא COS-7 transfected עם מיון חלבונים, mCherry-Sec61β, מעובד באמצעות השיטה המתוארת לעיל. איור 2A -2B לאפשר את ההשווא...

מאמר זה מתאר פרוטוקול איתור של אחד או יותר פלזמה ו/או חלבונים תאיים ממברנה בעזרת מיקרוסקופ סופר-ברזולוציה המחסור בקרקע (GSD) בתאי יונקים. כאן, אנו נדון את היתרונות ואת השיקולים של שימוש בגישות כאלה עבור ויזואליזציה של כימות של החלבונים.

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

המטרה הכללית של טכניקת הדמיה פלואורסצנטית זו היא להמחיש ולכמת חלבונים תאיים בתאים מקובעים ברזולוציה נמוכה מגבול הדיפרקציה, באמצעות סוג של מיקרוסקופיית רזולוציה-על הנקראת ground state depletion microscopy ו-individual molecule return. שיטה זו מסייעת במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה של התא והביופיזיקה של ממברנות, שכן היא עוקפת את הגבלת הרזולוציה של הדיפרקציה, דבר המסייע לחוקרים להגדיר, להמחיש ולכמת באופן מדויק יותר את התהלוּת של חלבונים תאיים. היתרון המרכזי של פרוטוקול זה הוא שהוא מאפשר רכישת תמונות עם שיפור של פי עשרה בקירוב ברזולוציה לעומת גישות המבוססות על הדמיה במיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונבנציונלית, כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית.את הפרוצדורה ידגימו אוסקר ויוואס, פוסט-דוקטור במעבדתי, וקארן האניגן, פוסט-דוקטור במעבדתה של רוז דיקסון. ראשית, הכינו את הזכוכיות המכסות ואת התאים כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף. לאחר מכן, קבעו את הדגימות ובצעו אימונוציטוכימיה כדי לסמן את חלבוני ממברנה הפלזמה ו/או חלבוני הממברנה התוך-תאיים הרלוונטיים.בשלב הבא, הכין את תמיסת ה-Glock לספיחת חמצן על ידי הוספה תחילה של 12.5 µL של תמיסת מקור של catalase, 3.5 mg של glucose oxidase, ו-0.5 µL של Tris בריכוז 1 M ל-49.5 µL של PBS בתוך פרוטובולת מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 mL. סגור את הפרוטובולת והעבר אותה במיקסר וורטקס (vortex) למשך זמן קצר כדי להמיס את הרכיבים. לאחר מכן, סבב את התמיסה בצנטריפוגה למשך שלוש דקות.כעת, הכינו את התמיסה המשרה החלפת תמונות (photo switching) על ידי המסה של תמיסת beta-mercaptoethylamine ב-PBS לריכוז של 100 millimolar וכוונון ה-pH ל-8.0. חלקו את תמיסת ה-thial למנות ושמרו אותן במקפיא למשך שבוע לכל היותר. מיד לפני הצילום, ערבבו את ה-thial ואת רכיבי ספיגת החמצן יחד עם בופר מלח ושמרו את התמיסה על קרח.השתמשו ב-100 microliters של תמיסת החיליף (buffer) לפוטו-סוויצ'ינג שהוכנה, כדי להרכיב כיסניות זכוכית המכילות תאים צבועים על גבי השקופיות השקועות. לאחר מכן, אטמו את שולי הכיסית בעזרת דבק סיליקון כדי למנוע חמצון מהיר של תמיסת ההדמיה. המתינו מספר דקות עד שהדבק הסיליקוני יתייבש לחלוטין, לפני ביצוע ההדמיה.אחרת, זכוכית המכסה תסתובב. ראשית, בחרו לייזר מתאים להארת הדגימה, בהתבסס על הפלואורופור שנבחר. עבור פלואורופור Alexa 647, השתמשו בלייזר של 642 ננומטר.בשלב הבא, בחרו את קוביית הדיכרואיקה המתאימה לצילום ואת העדשה. פתחו את תוכנת הצילום. בחרו במצב רכישה דו-ממדי (2D) ולאחר מכן הגדירו את זמן החשיפה ל-11 milliseconds.בנוסף, הגדירו את ה-EM Gain ל-300 ובחרו סף זיהוי (detection threshold) מתאים. לאחר מכן, הפעילו את ה-Auto Event Control והגדירו את מספר האירועים לתמונה (Events Per Images) לשמונה. הזינו את גודל הפיקסל (Pixel Size) כ-20 nanometers.בלשונית GSD Tools, עברו לאפשרויות High Resolution Image Calculation וודאו ש-Histogram Mode נבחר. כדי לדמות חלבונים בממברנה הפלסמית, בחרו במצב TIRF ושנו את זווית הפגיעה כדי לקבוע את עומק החדירה. לאחר מכן, הגדירו את עוצמת הלייזר ל-100% כדי להעביר אלקטרונים למצב האפל.בשלב הבא, בחרו ב-Single Molecule Detection בזמן השאיבה והגדירו רכישה אוטומטית כאשר המתאם בין הפריים (frame correlation) הוא 0.20. עבור הרכישה, הגדירו עוצמת לייזר של 50% ומספר פרימי רכישה של 60,000. לאחר מכן התחילו בצילום התמונות.כדי לכמת את גודל צברי החלבון, פתח ב-ImageJ את קובץ התמונה של מפת מיקום מולקולה בודדת בהיסטוגרמה של 10 ננומטר. בתפריט Image, עבור ל-Adjust והשתמש באפשרות Auto כדי למטב את הבהירות והניגודיות של התמונה. לאחר מכן, בתפריט Type, בחר ב-8-bit.בשלב הבא, פתחו את תפריט Analyze, לחצו על Set Scale והזינו את הערכים המוצגים כאן. לאחר מכן, בתפריט Analyze, בחרו ב-Set Measurements וסמנו את התיבה לצד אפשרות ה-Area. חזרו לתפריט Image, בחרו ב-Adjust, לאחר מכן ב-Threshold, ובסוף בחרו ב-Over/Under.העבירו את הערך המקסימלי ל-255, את הערך המינימלי ל-1 ולחצו על Apply. לבסוף, פתחו את תפריט Analyze ובחרו ב-Analyze Particles. סמנו ב-V את האפשרויות Pixel units, Display results ו-Summarize.לאחר מכן, הגדירו את הגודל מארבע עד אינסוף, בחרו באפשרות Bare Outlines ולחצו על OK. התא המצולם כאן עבר טרנספקציה עם חלבון הרשת האנדופלזמית, mCherry-Sec61 beta, וצולל באמצעות מיקרוסקופיית TIRF המוגבלת על ידי דיפרקציה ומיקרוסקופיית GSD ברזולוציה-על במצב TIRF. עקומים אלה מייצגים את קוטרן של צינורות ה-ER. התמונה מימין מראה שיפור ברזולוציה הלטראלית ומהווה ייצוג מדויק יותר של מבנה צינורות ה-ER.השיפור ברזולוציה המוצע על ידי דימות GSD ברזולוציה-על מודגם עוד יותר בתמונות אלו, המציגות מיוציט לבבי מסומן עם נוגדן anti-CAV 1.2. בשימוש במצב GSD, השיפור ברזולוציה הלטראלית הוא בולט וקל יותר לזהות אשכולות נפרדים של תעלים. לאחר השליטה בשיטה, ניתן להשלים פרוטוקול זה בפחות משלושה ימים.דימות ברזולוציה גבוהה (super-resolution) של תא בודד אורך בין 10 ל-30 דקות, בהתאם למספר הפריימים הנדרשים. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות נוספות כגון מיקרוסקופיה אלקטרונית כדי לענות על שאלות נוספות, כגון האופן שבו החלבון הפלואורסצנטי הנבדק מקיים אינטראקציה עם הסביבה התאית המורכבת. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן ההכנה, הרכישה והניתוח של דגימות לצורך ויזואליזציה של חלבון תאי אחד או יותר במיקרוסקופיית super-resolution באמצעות דילול מצב יסוד (ground state depletion) ואחריו החזרה של מולקולות בודדות.

ground-state-depletion-super-resolution-imaging-in-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים רזולוצית סופר שיטת הדמיה כדי לבחון את המבנה הארגוני של FtsZ טבעת החיידקים, מנגנון חיוני לחלוקת תא. שיטה זו מבוססת על ניתוחים כמותיים של מיקרוסקופיה תמונות לוקליזציה photoactivated (PALM) ויכולה להיות מיושמת על חלבוני cytoskeletal חיידקים אחרים.

הדמית סופר רזולוציה של מכונות אגף קטריאלי

מידע מרחבי-זמני על חלבונים דינמיים בתוך תאים חיים הוא חיוני להבנת הביולוגיה. סוג של מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה הנקראת מיקרוסקופ תאורה תלת-ממדי מהיר (f3D-SIM) חושף מידע ייחודי על טבעת Z הציטוקינטית בחיידקים: הן המראה דמוי החרוז והן הדינמיקה המהירה של FtsZ בתוך הטבעת.

הדמיה ברזולוציה סופר של Cytokinetic Z הטבעת בחיידקים חיים באמצעות-Structured 3D מהיר תאורה מיקרוסקופית (f3D-SIM)

אנו מתארים כאן שילוב של טכניקת דו-שכבת השומנים הנתמכת בזכוכית ליצירת סינפסות אימונולוגיות עם טכניקת הדמיה ברזולוציה גבוהה של מיקרוסקופיה של דלדול פליטה מגורה (STED). מטרת פרוטוקול זה היא לספק למשתמשים את ההוראות הדרושות לביצוע מוצלח של שתי טכניקות אלה.

הדמיה ברזולוציה סופר של תא הרוצח הטבעי החיסונית סינפסה על מישורי שומנים bilayer נתמך-זכוכית

PI (4,5) P 2 מסדיר פונקציות סלולריות שונות, אך הארגון ננו שלה בקרום פלזמת התא הוא הבין היטב. על ידי PI תיוג (4,5) P 2 עם בדיקה ניאון כפול צבע התמזגו תחום Pleckstrin הומולוגיה, אנו מתארים גישה חדשנית ללמוד את PI (4,5) P 2 הפריסה המרחבית בקרום פלזמה ב ננומטר סולם .

הדמיה סופר-רזולוציה מולקולה בודדת של 4,5-bisphosphate phosphatidylinositol בקרום פלזמה עם רומן פלורסנט בדיקות

שערי מעלה קונבנציונאלי BODIPY ניתן להשתמש עבור מיקרוסקופ לוקליזציה של תא לחיות בודד (SMLM) באמצעות ניצול של היווצרות הארעיות שלהם, אדום העביר המדינה הקרקע. אנו מציגים פרוטוקול SMLM אופטימיזציה כדי לעקוב ולפתור ליפידים ניטרליים שומנים וחומצות שומן בתאי היונקים החיים בקנה מידה nanoscopic באורך.

קונבנציונלי BODIPY מעלה שערים עבור מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה ומעקב יחיד מולקולה

מוצג כאן פרוטוקול להדמיית תאים חיים ברזולוציית-על ברקמה שלמה. התקנו את התנאים להדמיית אוכלוסיית תאי גזע בוגרים רגישים מאוד בסביבת הרקמה הטבעית שלה. טכניקה זו כרוכה באיזון רזולוציה זמנית ומרחבית כדי לאפשר תצפית ישירה של תופעות ביולוגיות ברקמה חיה.

הדמיית תאים חיים ברזולוציה סופר-רזולוציה של מבנים תת-תאיים

קרום המרתף חיוני למורפוגנזה של רקמות ואיברים במהלך ההתפתחות. כדי להבין טוב יותר את המנגנונים המובילים למיקום נכון של מבנה זה, הפרוטוקול שהוצג מתאר שיטות להמחשה ואפיון של הסחר התוך-תאי וההפרשה של חלבוני קרום המרתף בתאי אפיתל באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה.

הדמיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה של סחר תוך-תאי מקוטב והפרשת חלבוני ממברנת מרתף במהלך Drosophila Oogenesis

מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה יכולה לספק תובנה מפורטת על ארגון הרכיבים בתוך קומפלקס סינפטונמלי במיוזיס. כאן אנו מדגימים פרוטוקול לפתרון חלבונים בודדים של קומפלקס סינפטונמלי Caenorhabditis elegans .

מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה במיוחד של קומפלקס סינפטונמלי בתוך נבט Caenorhabditis elegans

מאמר זה מספק פרוטוקול פשוט וברור לסימון אפקטורים המופרשים בסלמונלה באמצעות אתר הרחבת קוד גנטי (GCE) ספציפי ותמונה של לוקליזציה תת-תאית של חלבונים המופרשים בתאי HeLa באמצעות מיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי ישיר (dSTORM)...

הדמיה ברזולוציית על של חלבונים המופרשים על ידי חיידקים באמצעות הרחבת קוד גנטי

פרוטוקול זה מפרט את ההליך לביצוע מיקרוסקופ לוקליזציה עמוק של תא שלם, עם מולקולה בודדת (SMLM) באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי בדיסק מסתובב עם הקצאת פוטונים אופטית, ובכך מאפשר הדמיית DNA-PAINT ללא צורך באופטיקה מותאמת אישית או תאורה מורכבת.

דימות סופר-רזולוציה של תא שלם באמצעות DNA-PAINT על דיסק מסתובב עם הקצאת פוטונים אופטית

פרוטוקול זה מפרט את יישומי ההדמיה המתקדמים ואת ניהול המשאבים המשותפים של מערכת מיקרוסקופ קונפוקלי סורקת לייזר, המשולבת עם גלאי מערך מרובה לעיבוד ברזולוציה גבוהה להדמיה תאית ותת-תאית ברזולוציה גבוהה. תהליך העבודה מאפשר הדמיה מולטימודלית מקונפוקלי לרזולוציה סופר (~120 ננומטר) בתוך פלטפורמה אחת, מה שמקל על הדמיה בקנה מידה ננומטר.

דימות ברזולוציה גבוהה וניהול משותף: פרוטוקול למיקרוסקופיה קונפוקלית עם זיהוי מולטיפלקס

למד את פרוטוקול הדמיית GSD לזיהוי חלבוני ממברנה בתאים יונקים בשיטת מיקרוסקופיית סופר-רזולוציה. שיטה זו מאפשרת שיפור פי עשרה ברזולוציה לעומת שיטות קונבנציונליות ומסייעת בחקר ביולוגיית התא וביופיזיקת ממברנות.

הדמיה סופר-ברזולוציה המחסור בקרקע בתאים בתרבית

גלה סרטונים נוספים