הערכת בדרכי השתן צומת פגמים חסימה על ידי הזרקת מתילן כחול צבע
12 באוקטובר 2017
הזרקת מתילן כחול צבע לתוך האגן הכליה מקלה את הערכת ליקויי חסימה בדרכי השתן צומת במהלך התפתחות דלקת בדרכי השתן עובריים בעכבר. . הנה, עבור הזרקת מתילן כחול צבע לתוך אגן הכליה פרוטוקול המתואר.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבוע את החסימות של צמתים בדרכי השתן באמצעות הזרקת צבע מתילן לכליות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום התפתחות הכליות ודרכי השתן התחתונות, כגון חיבור שלפוחית השתן. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת שיטה פשוטה להמחשת מבנה דרכי השתן במקרה הגרוע ביותר התפתחות מסה המאפשרת ניתוח התפתחות דרכי השתן.
כדי להתחיל בניסוי יש למדוד 0.1 גרם של אבקת מתילן כחולה. ממיסים את המתילן הכחול ב -10 מיליליטר של מי מלח 1x פוספט או PBS ומערבלת את התערובת. לאחר מכן סנן את תמיסת המתילן הכחולה של 10 מיליגרם למיליליטר עם מסנן מזרק כדי למנוע סתימה במהלך ההזרקה.
לאחר מכן הרכיבו סט ורידים סטרילי לקרקפת עם מזרק חד פעמי של שלושה מיליליטר ומלאו את המזרק בשלושה מיליליטר של תמיסת מתילן כחולה מסוננת. נקו מספריים ומלקחיים עם 70% אתנול. כדי לאסוף עוברים סביב הלידה ב-E18.5 או E19.5 יש להמית תחילה עכברים בהריון באמצעות שאיפת פחמן דו חמצני.
לאחר מכן בצע פריקת צוואר הרחם בהתאם להנחיות ה-NIH. לאחר מכן ריססו 70% אתנול על פני הבטן הגחונית של החיה. לאחר מכן, בעזרת המספריים והמלקחיים הסטריליים, פתח את חלל הבטן בגחון.
הרם את כל הרחם והפריד אותו מהגוף בקצות קרני הרחם. לאחר מכן שטפו את כל הרחם עם 1x PBS בצלחת פטרי. חותכים את הרחם בצורה מקטעת בעזרת מספריים מנתחים ומסירים את דצידואת השליה בעזרת מלקחיים מנתחים כדי לחשוף את העוברים ושקי החלמון.
הסר תחילה את שק החלמון ולאחר מכן הסר את קרום מי השפיר בעזרת מלקחיים מנתחים כדי לשחרר את העוברים סביב הלידה. ערפו את ראש העובר בעזרת מספריים לניתוח. הצמידו את העובר כלפי מטה עם פני הגחון שלו כלפי מעלה על מיקרוסקופ מנתח המצויד במצלמה דיגיטלית להדמיה.
אסוף את הזנב שלו לגנוטיפ. בעזרת מלקחיים קורעים בזהירות את העור כדי לפתוח את חלל הבטן של העובר. לאחר מכן הסר בזהירות עודפי איברים ורקמות כמו כבד, קיבה ומעיים בעזרת מלקחיים על ידי חיתוך או משיכתם החוצה כדי לחשוף את הכליות, השופכנים ושלפוחית השתן הממוקמים בגב.
ספוג עודפי דם מהעובר המנותח בעזרת רפידות גזה סטריליות ולאחר מכן המשך בהזרקת צבע. הסר בועות במחט ובצינורות על ידי הוצאת תמיסת מתילן כחולה מקצה המחט בלחץ הידרוסטטי. הרם את המזרק המכיל את תמיסת הצבע מעל גובה קצה המחט כדי להתחיל בזרימה.
ואז הורד את המזרק כדי לעצור את הזרימה. לאחר מכן, הכנס את המחט לאגן הכליה ליד השופכן הפרוקסימלי והקפיד לא להפריע לה לאחר הנחתה. בצע הזרקת צבע לכליה כדי לקבוע את חסימת דרכי השתן שלה.
לאחר החדרת מחט אחת לאגן הכליה, לאחר הצלחת בדיקה זו, יש להחדיר מחט לאגן הכליה לכיוון השופכן שאינו עובר דרך הכליה או לכיוון כלי הדם. הרם את המזרק כ-20 סנטימטרים כדי לספק לחץ הידרוסטטי ותן ל-15 עד 16 מיקרוליטר מתמיסת הצבע לזרום. לאחר מכן עקוב אחר הצבע הכחול של הצבע, החל תחילה באגן הכליה, לאחר מכן באורך השופכן ולבסוף בלומן שלפוחית השתן.
הנח את המזרק כלפי מטה כדי לעצור את זרימת הצבע והסר את המחט מהכליה. רשום את ההידרונפרוזיס של הכליה, ההידרואורטר והמיקום הסופי של תמיסת הצבע במחברת מעבדה. לבסוף בצע הזרקה של הכליה הנגדית ואפשר לצבע לזרום במשך 20 שניות בסך הכל.
צלם תמונות של הכליה, השופכן ושלפוחית השתן עם תמיסת צבע באמצעות המצלמה ותוכנת ההדמיה המחוברות למיקרוסקופ סטריאו. לאחר הזרקה לכליה אחת, צבע המתילן הכחול זורם מאגן הכליה דרך השופכן ואל שלפוחית השתן, וכתוצאה מכך צבע כחול גלוי בשופכן ובלומן שלפוחית השתן. כחול חזק יותר מופיע בלומן שלפוחית השתן עקב זרימה ארוכה יותר כ-20 שניות לאחר הזרקת שתי הכליות עם צבע המעיד על היעדר חסימת צומת דרכי השתן במערכת השתן השנייה.
בעת הזרקת הידרואורטר מורחב באופן חריג, המיקום הסופי של תמיסת הצבע אינו ברור. ולא ניתן לאמת חסימת צומת שופכה או UVJO למרות היעדר הצבע בלומן שלפוחית השתן מכיוון שההידרואורטר הלא תקין נפגע באמצע. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לחשב את שק הצבע של עוברים סביב הלידה כדי לקבל מערכת שתן שלמה.
והסר בועות כדי לא לחסום את זרימת הצבע.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול להזרקת צבע מethylene blue לאגן הכליות לצורך הערכת פגמים של חסימה במפגש דרכי השתן במהלך התפתחות עוברית של עכברים. טכניקה זו מסייעת בהדמיה של מבני דרכי השתן ובהבנת תהליכים התפתחותיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- אורולוגיה
רקע
- הבנת התפתחות דרכי השתן חיונית לטיפול במומים מולדים.
- צבע מתילן כחול משמש כעזר חזותי לזיהוי חסימות.
- שיטה זו יכולה לקדם את המחקר על התפתחות הכליות ודרכי השתן התחתונות.
- חיבורי דרכי השתן קריטיים לתפקוד תקין של הכליות.
מטרת המחקר
- להדמיית מבני דרכי השתן במהלך ההתפתחות העוברית.
- לזיהוי חסימות בצמתים של דרכי השתן.
- לספק שיטה פשוטה להערכת התפתחות דרכי השתן.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מדוד 0.1 גרם של אבקת מethylene blue.
- המס ב-10 מיליליטר של 1x phosphate buffered saline (PBS).
- ערבב את התמיסה באמצעות vortex להמסה מלאה.
- סנן את התמיסה באמצעות מסנן מזרק למניעת סתימות במהלך ההזרקה.
תוצאות עיקריות
- צבע המותילן כחול מדגיש ביעילות את מבני דרכי השתן.
- שיטה זו מאפשרת להעריך חסימות בחיבורים.
- הדמיות יכולות לסייע בהבנת anomalias התפתחותיות.
- התוצאות תומכות במחקרים נוספים על התפתחות דרכי השתן.
מסקנות
- הזרקת צבע מתילן כחול היא כלי בעל ערך לחקר התפתחות דרכי השתן.
- טכניקה זו יכולה לסייע בזיהוי פגמים התפתחותיים.
- מחקרים עתידיים יכולים להשתמש בשיטה זו כדי לבחון שאלות קשורות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
זיהוי מהימן של חסימות בחיבורי דרכי השתן במודלים פרה-קליניים הוא קריטי להבנת anomlies מולדת המשפיעות על תפקוד הכליות ועל מחקרי בטיחות של תרופות. פרוטוקול הזרקת צבע מתילן כחול (methylene blue) מאפשר ויזואליזציה ישירה של זרימת השתן ושל נקודות החסימה, ובכך תומך בהסרת סיכונים מכניסטיים ובתיקוף מטרות (target validation) במחקר התפתחותי ואורולוגי. גישה זו מחזקת את הביטחון החזוי במודלים של עכברים הרלוונטיים למחלה, ומספקת מידע למחקר תרגומי ולהחלטות בשלבים מוקדמים של פיתוח תיקי מוצרים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר הערכה תפקודית של קישוריות ומחסומים בדרכי השתן במודלים עובריים.
- תומך בהסרת סיכונים מכניסטיים באמצעות ויזואליזציה ישירה של הידרונפרוזיס (hydronephrosis) והידרואורטר (hydroureter).
- מסייע בתיקוף של התערבויות גנטיות או פרמקולוגיות המכוונות להתפתחות דרכי השתן.
- מספק מדד בר-שחזור לאישור נקודות סיום אנטומיות ותפקודיות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מבסס בדיקה ויזואלית סטנדרטית לזיהוי פתוחות או חסימה של דרכי השתן.
- מספק פלטים כמותיים ואיכותיים לצורך סריקה פנוטיפית בהמשך.
- מאפשר הערכה הדירה של השפעות התערבות על מורפולוגיית דרכי השתן.
- תומך ביכולת הרחבה (scalability) למחקרים השוואתיים על פני גנוטיפים או טיפולים מרובים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה פנוטיפים עכבריים למומים מולדים במערכת השתן אצל בני אדם לצורך רציפות תרגומית.
- מספקת פלטפורמה להערכת טיפולים מועמדים במערכות רלוונטיות למחלה.
- תומכת בקידום מותאם-סיכונים של מטרות המעורבות בהתפתחות מערכת השתן.
- מאפשרת פיתוח של סממנים ביולוגיים מבוססי דימות לצורך תיקוף פרה-קליני.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
פרוטוקול זה משתלב ברצף הגילוי המוקדם והתיקוף הפרה-קליני, ומגשר בין אפיון מודלים גנטיים למחקר תרגומי של הפרעות כלייתיות ואורולוגיות.
- ביולוגיה של הגילוי: מסייע בבדיקת השערות על מנגנוני התפתחות וחסימה של דרכי השתן.
- סריקה: מספק בדיקה ויזואלית וכמותית להערכת השפעת התערבות על זרימת השתן.
- אנליטיקה: מייצר נתוני דימות ומיקום להשוואה סטטיסטית בין פנוטיפים תקינים לחסומים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים בעכברים למודלים של מחלות בבני אדם לצורך פיתוח סמני ביולוגים (biomarkers) וטיפולים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פרוטוקול שניתן להשתמש בו שוב עבור רקעים גנטיים מגוונים ומחקרי התערבות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות התפתחותיות ואורולוגיות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של הערכת פתוחות דרכי השתן באמצעות תוצרי הדמיה הניתנים לשחזור.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) עבור מטרות כליתיות ואורולוגיות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעוד ותיעדוף מותאם סיכונים של מועמדים המשפיעים על התפתחות דרכי השתן.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטכניקות של דיסקציה של עוברי עכברים והזרקה מיקרוסקופית.
- נדרשת גישה לתשתית הדמיה לצורך ויזואליזציה ותיעוד בזמן אמת.
- נדרשת סטנדרטיזציה קפדנית בין הצוותים כדי להבטיח הדירות של הערכת זרימת הצבע.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור שלבי התפתחות שונים או רקעים גנטיים שונים.
- טיפול זהיר הוא חיוני כדי למנוע נזק לרקמות ותוצאות שגויות של חסימה (false-negative).
