חידוש ערוכים Microelectrodes זהב מצויד מנתח תא בזמן אמת

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להנשיר ולהחזיר לתפקוד (regenerate) פלטות אלקטרוניות מסחריות המיועדות למערכת Real-Time Cell Analyzer, או RTCA. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום השחזור של שבבים חד-פעמיים מבוססי זהב, כולל שחזור של פלטות אלקטרוניות המשמשות ב-RTCA. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לבצע את הליך השחזור באמצעות ריאגנטים מעבדתיים עדינים, נגישים ובעלי רעילות נמוכה.

הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר התחלנו להשתמש ב-Real-Time Cell Analyzer, שמשתמש בשבבים מבוססי זהב. התחילו את הפרוצדורה באינקובציה והתרבייה של תאי A549 בצלחת תרבית תאים כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. הוסיפו 150 µL של מצע תרבית תאים לכל באר אינקובציה בלוח האלקטרוני L8. השאירו את הלוח למשך 30 דקות במCב בטיחות ביולוגית לצורך התאמה של הטמפרטורה.

לאחר 30 דקות, הכניסו ידנית את הפלטה האלקטרונית L8 לתוך ה-Real-Time Cell Analyzer בתוך דגירת ה-CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הפעילו את תוכנת ההפעלה של ה-Real-Time Cell Analyzer במחשב. בדף הגדרת תבנית הניסוי כברירת מחדל, בחרו ב-Experiment Model ותנו שם לבדיקה המבוצעת.

בעמוד פריסת הלוח, בחרו את הבארות המתאימות הנכללות בניסוי, והזינו מידע כגון סוג התא, מספר ושמות התרופות בתיבות העריכה. בעמוד לוח הזמנים, הוסיפו את שלבי הניסוי, ולאחר מכן בחרו את זמן ההרצה של כל שלב ואת מרווחי רכישת הנתונים בזמן אמת. לחצו על start כדי למדוד את עכבה (impedance) הרקע של המצע.

קובץ הניסוי יישמר. הנתונים שיתקבלו יופחתו באופן אוטומטי. בעמוד הגרף, יש להוסיף בארות, ואז יוצג הגרף של מדד התא (cell index) כפונקציה של הזמן.

עבור ניסוי השגחה על התרבות תאים, ראשית לחצו על כפתור ההפסקה כדי להשהות את התוכנית. לאחר מכן הוציאו את הפלטה האלקטרונית, והוסיפו 100 µL של תמיסת בופר של תאי A549 לכל באר בטמפרטורת החדר. השאירו את הפלטה למשך 30 דקות במנדף הביולוגי כדי לאפשר לתאים לשקוע לתחתית בארי האינקובציה.

הכנס ידנית את הפלטה האלקטרונית לתחנת ניתוח התאים בזמן אמת. לאחר מכן, לחץ על כפתור ההפעלה (start) כדי להמשיך בניסוי. בדף הגרף, המנתח מקליט באופן רציף ערכי מדד תאים (cell index), או עקומות, לאורך כל הניסוי.

עם סיום הניסוי, היכנסו לדף התרשימים ופתחו את קובץ הניסוי. לאחר מכן, בחרו את כל בארות הדגירה שנבדקו ואת עקומות מדד התאים (cell index) הנובעות מהן, שניתן להביא לממוצע או לנרמל בפעם האחרונה לפני הוספת תרופות פרמצבטיות או החלפת המצע, כדי להפחית שונות בין הבדיקות. בדף ניתוח הנתונים, ניתן לחשב את ה-EC50 או ה-IC50.

לאחר ביצוע הערכת ציטוטוקסיות של התרופה האנטי-סרטנית כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט, הוצא את הפלטה האלקטרונית המכילה את התאים מתחנת ה-Real-Time Cell Analyzer. הנח את הפלטה האלקטרונית המשומשת במבתר בטיחות ביולוגית סטרילי בטמפרטורת החדר, וערבב את מצע התרבית היטב באמצעות פיפטה. לאחר מכן, השתמש בפיפטה כדי לשאוב את כל המצע.

שטפו את הפלטות האלקטרוניות עם 200 µL של מים דה-יוניים שלוש פעמים בטמפרטורת החדר. עיכלו את התאים שנותרו על הפלטות האלקטרוניות באמצעות trypsin בריכוז 0.25% שהוכן טרי, למשך שעה אחת עד שעתיים באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C. עם השלמת העיכול, עבדו תחת מapay של בטיחות ביולוגית בטמפרטורת החדר כדי לערבב את תמיסת ההדגרה חמש עד 10 פעמים באמצעות פיפטה, ולאחר מכן הסירו את התמיסה.

שטפו את הפלטות האלקטרוניות עם 200 µL של מים דה-יונזים פעמיים. לאחר מכן, שטפו עם 200 µL של 100% ethanol פעמיים, ולאחר מכן עם אותו נפח של 75% ethanol פעמיים. לבסוף, שטפו שוב עם 200 µL של מים דה-יונזים פעמיים.

הפוך את הפלטה האלקטרונית על גבי גזה סטרילית או נייר סופג כדי לנקז את שאריות המים בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, בצע עיקור בעזרת קרינת ultraviolet לפלטה האלקטרונית המשוקמת למשך שעה עד שעתיים במCב תחת מシャレב בטיחות ביולוגית בטמפרטורת החדר. לאחר שימוש בפלטות להחדרת תרופות באמצעות חומר מזופורי כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט, עשה עיכול לתאים שנותרו באמצעות trypsin כפי שבוצע קודם לכן.

מאחר שהפיפטה נמצאת בשימוש תכוף בניסויים, על המבצע להקפיד להימנע משריטות של הטיפ ושל פני השבבים המיקרוניים. שטפו את השבבים המיקרוניים פעם אחת עם 200 µL של מים דה-יוניים בתוך מ schönen מ SFC (מגש בטיחות ביולוגית) בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את השבבים המיקרוניים פעמיים עם 200 µL של אתנול מוחלט בטמפרטורת החדר.

בשלב הבא, שטפו את השבבים המיקרוסקופיים פעם אחת עם 200 µL של 75% ethanol בטמפרטורת החדר. הוסיפו 250 µL של 75% ethanol לכל באער, ואטמו את הפלטה האלקטרונית באמצעות סרט איטום בטמפרטורת החדר. לאחר סבב של הפלטה האלקטרונית ב-114 ×g למשך שתי דקות, רוקנו את הפלטה.

הפוך את הפלטה האלקטרונית על גבי גזה סטרילית או נייר סופג כדי לנקז את הנוזל הנותר בטמפרטורת החדר. חזור על שטיפות ה-75% ethanol ולאחריהן סבב צנטריפוגה. לאחר מכן, בצע עיקור באמצעות קרינת ultraviolet לפלטה האלקטרונית המחוברת מחדש למשך שעה עד שעתיים במכסה הביטחון הביולוגי בטמפרטורת החדר.

העריכו את המאפיינים האופטיים של פני השטח של הלוח האלקטרוני המשוחזר על ידי פירוק תחילה של החלק התחתון של באר הדגירה כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי להעריך את חיוניות התאים ההיצמדים לאחר ספיגת תרופה נגד סרטן בלוחות אלקטרוניים טריים ומשוחזרים, השתמשו במיקרוסקופ סריקה קונפוקלי בלייזר כדי לנטר את הפלואורסצנציה הספונטנית של מולקולות DOX שנספגו על ידי תאי A549. כדי לתעד את הפלואורסצנציה הספונטנית של DOX שנספג על ידי התאים, השתמשו בעדשה שמנית עם שמן בעוצמה של 63-פעמים ובאורך גל עירור של 485 nanometers.

בשלב הבא, העריכו את ההתנהגות האלקטרוכימית של האלקטרודות המחודשות על ידי ליטוש של אלקטרודת הזהב ואלקטרודת הפחמן הזכוכיתית עד להשגת משטח דמוי מראה, באמצעות illuminoslurry על בד ליטוש. לאחר מכן, בצעו סוניקציה לאלקטרודות במים כדי להסיר חלקיקים. לבסוף, הפעילו את אלקטרודת הזהב בחומצה גופרית בריכוז 0.5-molar.

השג נתוני ספקטרוסקופיית עכבה אלקטרוכימית, או נתוני EIS, של אלקטרודת הזהב הנקייה ואלקטרודת הפחמן הזכוכיתי בתמיסת אלקטרוליט של potassium-chloride בריכוז 10 millimolar, המכילה potassium pheracyanide בריכוז one millimolar. כעת, טפטף 10 µL של תרחיף תאים על פני השטח של אלקטרודת הזהב ב-GCE. לאחר הוספת התאים, הדגר את אלקטרודת הזהב ב-GCE באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך שלוש שעות לפני השגת נתוני EIS של האלקטרודות המשופרות בתאים, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.

כדי לחדש את האלקטרודות, טבול את אלקטרודת הזהב ואת ה-GCE ששופרה בתאים ב-0.25% trypsin למשך 0.5 עד שתי שעות. שטוף את שתי האלקטרודות בעדינות במים ארבע פעמים. לאחר מכן, שטוף את האלקטרודות בעדינות באתנול מוחלט ארבע פעמים.

בשלב הבא, טבל את אלקטרודת הזהב ב-GCE בתוך אתנול 75% למשך כחמש דקות. לאחר חמש דקות, שטוף את השבב בעדינות באתנול 75% ארבע פעמים לפני קבלת נתוני EIS של האלקטרודות המחויה, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי להעריך את יעילות החייאת לוח האלקטרוני מזהב במערך, בוצעו תצפיות מיקרוסקופיות הן עבור לוחות אלקטרוניים טריים והן עבור לוחות שעברו טיפול.

לא נמצא הבדל מובהק בתכונות האופטיות של פני השטח של השבב המיקרוסקופי. פלואורסצנציה של מולקולות doxorubicin משמשת להערכת מצב התאים על שבבי הזהב לפני ואחרי רגנרציה. הומוגניות דומה ומורפולוגיה תאית מוגדרת היטב הדגימו את יכולת השימוש החוזר בשבבים.

פרוטוקול ההתחדשות מיושם עבור הבדיקה הממשית של שגשוג תאים. עקומות הגדילה שהתקבלו ממספר בארות דגירה של לוח אלקטרוני שנבדק מראות עקביות טובה, המעידה על התחדשות מוצלחת של השבב המסחרי. מוצג כאן הלוח האלקטרוני L8 המחודש, שנבדק להערכת ציטוטוקסיות באמצעות חומרי סיליקה מזופוריים.

מדד התאים של הדגימה שעברה טיפול בחומרים מזוכיים (mesoporous) ירד בהשוואה לקבוצת הביקורת, דבר המעיד על רעילות תאית קלה של החומרים. כימוס ושחרור נוספים של התרופה נוגדת הסרטן doxorubicin על ידי החומרים המזוכיים גרמו לירידה דרמטית בעקומת הגדילה של תאי A549. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בארבע שעות, במידה והיא מבוצעת כהלכה.

בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור שזמן העיכול של ה-type sink עשוי להשתנות משבב לשבב. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון מיקרוסקופיית סריקה לייזר קונפוקאלית, או אפילו ספקטרוסקופיה וספקטרוסקופיית עכבה אלקטרוכימית, כדי להשיב על שאלות נוספות, כגון הערכת אפקט הרגנרציה.