חידוש ערוכים Microelectrodes זהב מצויד מנתח תא בזמן אמת

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחדש לוחות אלקטרוניים מסחריים המצוידים במנתח תאים בזמן אמת, או RTCA. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בהתחדשות של שבבים חד פעמיים מבוססי זהב, כולל חידוש תוכניות אלקטרוניות המשמשות ב-RTCA. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבצע את הליך ההתחדשות באמצעות ריאגנטים מעבדתיים עדינים וזמינים עם רעילות נמוכה.

הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כשהתחלנו להשתמש ב-Real-Time Cell Analyzer שעלה שבבים מבוססי זהב. התחל הליך זה עם דגירה והתפשטות של תאי A549 בצלחת תרבית תאים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הוסף 150 מיקרוליטר של מדיום תא לכל באר דגירה של הצלחת האלקטרונית L8. השאירו את הצלחת למשך 30 דקות במכסה המנוע לשיווי משקל.

לאחר 30 דקות, הכנס ידנית את הצלחת האלקטרונית L8 למנתח התאים בזמן אמת בחממת ה-CO2 ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הפעל את תוכנית הפעולה של מנתח תאים בזמן אמת במחשב. בדף הגדרת תבנית הניסוי המוגדרת כברירת מחדל, בחר מודל ניסוי ותן שם לבדיקה הפועלת.

בדף הפריסה שלו, בחר את הבארות המתאימות הכלולות בניסוי, והזן את המידע כגון סוג התא, המספר ושמות התרופות בתיבות העריכה. בדף לוח הזמנים שלו, הוסף את שלבי הניסוי ולאחר מכן בחר את זמן הריצה של כל שלב ומרווח של רכישת נתונים בזמן אמת. לחץ על התחל כדי למדוד את עכבת הרקע של המדיה.

קובץ הניסוי יישמר. הנתונים המתקבלים יופחתו אוטומטית. בדף העלילה, הוסף בארות, ויוצג הגרף של מדד תאי הזמן.

עבור ניסוי התפשטות התאים, לחץ תחילה על כפתור ההשהיה כדי להשהות את התוכנית. לאחר מכן הוציאו את הצלחת האלקטרונית, והוסיפו 100 מיקרוליטר של מאגר מתלה תאים A549 לכל באר בטמפרטורת החדר. השאירו את הצלחת למשך 30 דקות במכסה המנוע הביולוגי כדי לאפשר לתאים להתיישב בתחתית בארות הדגירה.

הכנס ידנית את הלוח האלקטרוני לתחנת מנתח התאים בזמן אמת. לאחר מכן לחץ על כפתור ההתחלה כדי להמשיך בניסוי. בדף העלילה, המנתח מתעד באופן רציף ערכי אינדקס תאים, או עקומות, לאורך כל הניסוי.

בסיום הניסוי, היכנסו לדף העלילה ופתחו את קובץ הניסוי. לאחר מכן בחר את כל בארות הדגירה שנבדקו ואת עקומות אינדקס התא המתקבלות שניתן לממוצע או לנרמל בפעם האחרונה לפני הוספת תרופות פרמצבטיות או שינוי מדיום כדי להפחית את השונות בין הבדיקות. בדף ניתוח הנתונים ניתן לחשב EC50 או IC50.

לאחר ביצוע הערכת ציטוטוקסיות של תרופה אנטי סרטנית כמתואר בפרוטוקול הטקסט, הוצא את הצלחת האלקטרונית המכילה תאים מתחנת מנתח התאים בזמן אמת. הנח את הצלחת האלקטרונית המשומשת בקולט אדים סטרילי בטמפרטורת החדר, וערבב היטב את מדיום התרבות בעזרת פיפטה. לאחר מכן השתמש בפיפטה כדי לשאוף את כל המדיום.

שוטפים את הלוחות האלקטרוניים עם 200 מיקרוליטר מים דה-יונים שלוש פעמים בטמפרטורת החדר. עכל את התאים הנותרים על הצלחות האלקטרוניות עם טריפסין טרי של 0.25% למשך שעה עד שעתיים בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר השלמת העיכול, עבדו במכסה המנוע הביולוגי בטמפרטורת החדר כדי לערבב את תמיסת הדגירה חמש עד 10 פעמים באמצעות פיפטה, ולאחר מכן הסירו את התמיסה.

שוטפים את הלוחות האלקטרוניים עם 200 מיקרוליטר מים דה-יונים פעמיים. לאחר מכן יש לשטוף עם 200 מיקרוליטר של 100% אתנול פעמיים, ואחריו אותו נפח של 75% אתנול פעמיים. לבסוף, יש לשטוף עם עוד 200 מיקרוליטר מים נטולי יונים פעמיים.

הפוך את הצלחת האלקטרונית על גזה סטרילית או נייר טישו כדי לשפוך את שארית המים בטמפרטורת החדר. לאחר מכן בצע עיקור אולטרה סגול על הצלחת האלקטרונית המחודשת למשך שעה עד שעתיים במכסה המנוע הביולוגי בטמפרטורת החדר. לאחר השימוש בצלחות להעברת תרופות באמצעות חומר מזופורי כמתואר בפרוטוקול הטקסט, עכל את התאים הנותרים עם טריפסין כמו קודם.

מכיוון שהפיפטה משמשת לעתים קרובות בניסויים, על האדם לשים לב כדי למנוע שריטות של הקצה ופני השטח של השבבים. שטפו את השבבים ב -200 מיקרוליטר מים נטולי יונים פעם אחת במכסה המנוע הביולוגי בטמפרטורת החדר. לאחר מכן העלו את השבבים עם 200 מיקרוליטר אתנול מוחלט פעמיים בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, שטפו את השבבים עם 200 מיקרוליטר של אתנול 75% פעם אחת בטמפרטורת החדר. הוסף 250 מיקרוליטר של 75% אתנול בכל באר, ואטום את הצלחת האלקטרונית עם סרט האיטום בטמפרטורת החדר. לאחר סיבוב הצלחת האלקטרונית ב -114 פעמים G למשך שתי דקות, רוקן את הצלחת.

הפוך את הצלחת האלקטרונית על גזה סטרילית או נייר טישו כדי לשפוך את הנוזל שנותר בטמפרטורת החדר. חזור על שטיפות האתנול של 75% ואחריו הסיבוב. לאחר מכן בצע עיקור אולטרה סגול על הצלחת האלקטרונית המחודשת למשך שעה עד שעתיים במכסה המנוע הביולוגי בטמפרטורת החדר.

הערך את המאפיינים האופטיים של משטח הלוח האלקטרוני המחודש על ידי פירוק תחילה של החלק התחתון של באר הדגירה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי להעריך את הכדאיות של תאים מחוברים לאחר ספיגת תרופות אנטי-סרטניות על הלוחות האלקטרוניים הטריים והמתחדשים, השתמש במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי כדי לנטר את הקרינה הספונטנית של מולקולות DOX הנספגות על ידי תאי A549. כדי לתעד את הקרינה הספונטנית של DOX הנספג על ידי התאים, השתמש במטרת שמן פי 63 ו-485 ננומטר כאורך גל העירור.

לאחר מכן, העריכו את ההתנהגויות האלקטרוכימיות של אלקטרודות מחודשות על ידי ליטוש תחילה של אלקטרודת הזהב ואלקטרודת הפחמן הזכוכית למשטח דמוי מראה עם תאורה על מטלית ליטוש. לאחר מכן סוניקציה של האלקטרודות במים כדי להסיר חלקיקים. לאחר מכן, הפעל את אלקטרודת הזהב בחומצה גופרתית 0.5 מולארית.

השג ספקטרוסקופיה של עכבה אלקטרוכימית, או נתוני EIS, של אלקטרודת הזהב החשופה ואלקטרודת הפחמן הזכוכית בתמיסת אשלגן-כלוריד-אלקטרוליט של 10 מילי-מולרי, המכילה מילי-מולרית אחת של אשלגן פרציאניד. כעת, זרוק 10 מיקרוליטר של תרחיף תאים על פני אלקטרודת הזהב ב-GCE. לאחר הוספת התאים, דגרו את אלקטרודת הזהב ב-GCE באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות לפני קבלת נתוני EIS של האלקטרודות ששונו עם תאים, כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

כדי לחדש את האלקטרודות, טבלו את אלקטרודת הזהב ב-GCE שהשתנתה עם תאים ב-0.25% טריפסין למשך 0.5 עד שעתיים. שטפו את שתי האלקטרודות בעדינות במים ארבע פעמים. לאחר מכן, שטפו את האלקטרודות ברכות עם אתנול מוחלט ארבע פעמים.

לאחר מכן, טבלו את אלקטרודת הזהב ב-GCE באתנול 75% למשך כחמש דקות. לאחר חמש דקות, שטפו את השבב ברכות עם אתנול 75% ארבע פעמים לפני קבלת נתוני EIS של האלקטרודות המתחדשות, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי להעריך את יעילות ההתחדשות של הלוח האלקטרוני הזהב המערך, נערכו תצפיות מיקרוסקופיות עבור לוחות אלקטרוניים טריים ומטופלים כאחד.

לא נמצא הבדל וירטואלי בתכונות האופטיות של משטח השבב. התחדשות של מולקולות דוקסורוביצין משמשת להערכת מצב התא על שבבי הזהב לפני ואחרי ההתחדשות. ההומוגניות הדומה והמורפולוגיה התאית המוגדרת היטב הדגימו את יכולת השימוש החוזר של השבבים.

פרוטוקול ההתחדשות מיושם למבחן האמיתי של התפשטות התאים. עקומות הצמיחה המתקבלות מבארות דגירה מרובות של צלחת אלקטרונית שנבדקה מראות עקביות טובה, מה שמעיד על התחדשות מוצלחת של השבב המסחרי. מוצג כאן, הלוח האלקטרוני המחודש L8 נבדק להערכת ציטוטוקסיות באמצעות חומרי סיליקה מזופוריים.

אינדקס התאים של הדגימה שטופלה בחומרים מזופוריים ירד בהשוואה לביקורת, מה שמעיד על ציטוטוקסיות קלה של החומרים. אנקפסולציה נוספת ושחרור של התרופה האנטי-סרטנית דוקסורוביצין על ידי חומרים מזופוריים גרמו לירידה דרמטית בעקומת הגדילה של תאי A549. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך ארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור שזמן העיכול של כיור הסוג עשוי להיות שונה משבב לשבב. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטה אחרת כמו מיקרוסקופיה סריקת לייזר קונפוקלית, או אפילו ספקטרוסקופיה, ספקטרוסקופיה עכבה אלקטרוכימית על מנת לענות על שאלות נוספות כמו הערכת אפקט ההתחדשות.