RGB והדמיה ספקטרלי שורש הצמח Phenotyping ומחקר פיזיולוגיים: הגדרת הניסוי והדמיה פרוטוקולים
8 באוגוסט 2017
פרוטוקול ניסיוני מוצג להערכת מערכות שורשי צמחים שגדלו באדמה עם RGB והדמיה היפר-ספקטרלית. שילוב של סדרות זמן של תמונות RGB עם מידע כימומטרי מסריקות היפרספקטרליות מייעל תובנות לגבי דינמיקת שורשי הצמח.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להשיג מידע מקיף על שורשי צמחים הגדלים בריזובוקסים (rhizoboxes) מלאים באדמה, באמצעות שילוב של שיטות דימות שונות. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחומי הפנוטיפיקה וההכלאה של צמחים, כגון התרומה של ארכיטקטורות שורשים שונות לעמידות טובה יותר למעמדים אביוטיים. היתרון העיקרי של גישה זו הוא השילוב בין דימויי RGB לאפיון ארכיטקטורת השורשים לבין דימוי היפר-ספקטרלי לבחינת התפקוד של השורשים.
הפוטנציאל של שימוש בדימות היפר-ספקטרלי לשורשים נשען על מגוון רחב של פרמטרים של הריזוספירה, מכיוון שהמידע הספקטרלי יכול לחשוף שינויים פיזיקו-כימיים בקנה מידה קטן שנגרמו על ידי שורשי הצמח. הדגמה ויזואלית של שיטה זו היא קריטית, שכן יש לבצע את שלבי מילוי הריזובוקס בזהירות. אחרת, צמיחת השורשים ונראותם ייפגעו לרעה.
התחילו את הפרוצדורה בהכנת הריזובוקסים למילוי התשתית, כפי שפורט בפרוטוקול הטקסט. הרטיבו מראש את האדמה היבשה עד לתכולת מים גרבימטרית של 0.108 גרם לגרם, על ידי הוספת 400 גרם מים ל-3,705 גרם אדמה יבשה. ערבבו בעדינות את האדמה והמים כדי להשיג פיזור מים הומוגני.
יש לפרק ידנית צברים גדולים כדי לשמור על גודל חלקיקים שקטן או שווה לשני מילימטרים. קריטי להשיג שכבת קרקע הומוגנית לצד חלון התצפית של הגז תוך הימנעות מכיסי אוויר. קצות השורשים של צמחים מתייבשים במהירות כאשר הם גדלים לתוך כיסי אוויר.
כמו כן, איכות התמונה הספקטרלית למיפוי מים נפגעת לרעה. מלאו את הקרקע שהורטבה מראש לתוך הריזובוקסים הפתוחים ודחסו אותה בעדינות באמצעות לוח פוליסטירן המכסה את הנפח הפנימי של התיבה, ובכך תשיגו צפיפות נפחית הומוגנית של 1.3 grams per cubic centimeter. הוסיפו את כמות המים הנותרת כדי להגיע לתכולת המים המטרה של 0.31 cubic centimeters per cubic centimeter על ידי התזה על פני השטח באמצעות בקבוק התזה.
הבטיחו גודל טיפה קטן כדי למנוע פגיעה במבנה הפני והבטיחו הרטבה הומוגנית. השאירו את הקופסה על מאזניים במהלך הריסוס כדי לנטר את כמות המים שהתווספה בפועל למצע. המתינו 10 דקות לאפשר למים להתפזר מחדש, ולאחר מכן הצמידו את הזכוכית לפני השטח וקבעו אותה באמצעות המסילות המתכתיות שבצדים.
המשקל הסופי הממוצע של תיבות השורשים (rhizoboxes) עם מצע רטוב היה 17,818 פלוס או מינוס 68 גרם. ציידו את חדר האקלים בשמונה נורות LED המספקות תאורה הומוגנית של 450 micromoles per square meter per second עם שיאי ספקטרום ב-440 ו-660 nanometers לצמיחה אופטימלית של הצמח. לאחר קביעת הפרמטרים הסביבתיים בהתאם לצורכי הצמח והניסוי, כסו את חלון הזכוכית בלוח עץ כדי לשמור על אזור השורשים בחשיכה ולמנוע צמיחת אצות עקב חדירת אור דרך משטח הזכוכית.
לאחר מכן, הניחו את תיבות השורשים (rhizoboxes) בשיפוע של 45 מעלות באמצעות מסגרת מתכת מתאימה. פעולה זו ממקסמת את גדילת השורשים לכיוון משטח הזכוכית בשל גרביטרופיזם. לצורך דימוי שורשים ב-RGB, האירו את תיבת השורשים באמצעות ארבעה נורות פלורסנט של 24-watt המותקנות במרחק של 80 סנטימטרים מתיבת השורשים.
כמו כן, התקינו ארבעה נורות UV של 15-watt במרחק של 20 סנטימטרים מהריזובוקס (rhizobox) כתאורה חלופית, תוך שימוש באוטופלואורסצנציה של השורשים במקרה של ניגודיות נמוכה בין השורש לרקע בהיר של המצע. הדליקו את נורות ה-UV ולאחר מכן הצמידו את הריזובוקס המיועד להדמיה למחזיק של תיבת ההדמיה. לאחר מכן, צלמו שתי תמונות המכסות את החצי העליון והתחתון של הריזובוקס, עם חפיפה של כ-שלושה סנטימטרים.
רכשו ועבדו את תמונות ה-RBG כפי שפורט בפרוטוקול הטקסט. לבסוף, הריצו את הניתוח של תמונות השורשים ב-RBG שנקלטו ובדקו לאחר מכן האם קיימים אזורים שאינם תואמים. במקרה כזה, הגדירו אזור החרגה והפעילו מחדש את הניתוח.
עבור שורשים שלא סווגו, יש להוסיף מחלקות צבע נוספות ולהפעיל מחדש את הניתוח. עבור אלמנטים שסווגו בטעות כשורשים, הפעילו או הגבירו את אפשרויות הסינון של פסולת (debris) וקצוות מחוספסים. בצעו רכישת תמונות על ידי קביעה ראשונית של זמני האינטגרציה של המצלמה עבור סריקת הריזובוקס (rhizobox) והסטנדרט הלבן בתוכנת המצלמה.
כדי לעשות זאת, פתחו את ממשק המשתמש (GUI) של מערכת ההדמיה והזיזו את המצלמה למיקום בריזובוקס (rhizobox) שבו קיימים שורשים. כווננו את זמן האינטגרציה של המצלמה תוך התמקדות באובייקט בהיר, באופן שבו כ-85% מהטווח הדינמי המלא של המצלמה מנוצלים בהיסטוגרמה המוצגת בתוכנה. קביעה נכונה של זמן האינטגרציה עבור מצעים ורקמות שורש שונות היא קריטית לניצול מלא של הטווח הדינמי של מצלמת האינפרא-אדום, על ידי מניעת אובדן מידע כתוצאה מחריגה מהטווח שלה.
חזור על התהליך עבור הסטנדרט הלבן על ידי הזזת מערכת מיקום המצלמה אל הסטנדרט הלבן לפני סגירת תוכנת המצלמה. לאחר מכן, פתח את ממשק המשתמש (GUI) של Matlab לדימות והזן את כל ההגדרות מסריקת ה-rhizobox הנוכחית. רכוש את הסטנדרטים של החשיכה והלבן לפני כל הרצת דימות פעם ביום.
הסטנדרט האפל מייצג את רעש המצלמה, בעוד שהסטנדרט הלבן מספק את מקסימום המהלקיות. נתונים אלו נדרשים לצורך נורמליזציה של התמונות במהלך העיבוד המקדים. הגדירו האם נסרק הריזובוקס כולו או רק חלק ממנו.
במקרה הנוכחי, מבוצע הדמיה של תיבות השורשים (rhizoboxes) השלמות. לאחר מכן, התחל את הסריקה. לצורך מדידת תכולת מים מבוססת ספקטרום, נדרשת תיבת שורשים לכיול.
חלקו את הריזובוקס (rhizobox) לתאים של חמישה סנטימטרים באמצעות לוחות פוליסטירן כדי למלא אותם באדמה עם תכני לחות שונים. סרקו את ריזובוקס הכיול עם אותן הגדרות ששימשו עבור הריזובוקסים השתולים. כדוגמה, לשילוב של תכונות שורשים ותכונות עיליות, השתמשו בפורומטר לעלים למדידת מוליכות פיונית.
השגו את המכשיר לתנאי הסביבה למשך שעה אחת לפחות בתא האקלים. בצעו מדידות לפחות משלושה עלים לכל צמח. כאן מוצגת תמונה מייצגת של צמיחת שורשים של זן סלק סוכר, Ferrara, המבוססת על דימות RGB.
35 ימים לאחר הזריעה, שורשי הצמח התארכו עד להגעה לתחתית הריזובוקס (rhizobox). לא ניתן היה לבצע סגמנטציה של חלק מצירים השורשיים בחלקו העליון של הריזובוקס מתמונות RGB. נשירה של השורשים הבסיסליים המבוגרים יותר משנה את צבעם לחום.
לפיכך, הפרדה בין שורשים אלה לבין רקע הקרקע על בסיס סף צבע נכשלת. באמצעות דימות היפרספקטרלי, הסגמנטציה מתבססת על מאפיינים ספקטרליים שונים של השורשים (הקדמה) ושל רקע הקרקע. דבר זה משפר את תוצאת הסגמנטציה.
ההבדלים באורך השורש שנמדד לעומת תמונת ייחוס שעקב אחריה ידנית הם רק 1.5%. יתרה מכך, דימוי ספקטרלי מאפשר מיפוי מדויק של תכולת המים סביב השורש כדי להסיק מסקנות על ספיגת מים. כאן שלד השורש מוצג בשחור. האזורים הבהירים יותר מראים אזורים של דלדול מים גבוה יותר בקרבת צירי השורש.
בעוד ששטחים בכחול כהה יותר מייצגים אזורים עם תכולת מים גבוהה יותר בקרקע מחוץ להישג השורשים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו יש למלא נכון את הריזובוקסים (rhizoboxes) כדי להבטיח צמיחת שורשים ונראות מספקת. זהו הבסיס לדגימה גרפית מאוחרת יותר ולתוצאות ייצוגיות של פנוטיפיקה של שורשים.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות נוספות לסיווג ספקטרלי, כגון קיבץ K-means או מכונות וקטור תומך (support vector machines), כדי להשיג מידע מעמיק על תכונות השורש והריזוספירה, כגון נשירת שורשים ופירוק. ברגע שטכניקה זו מבוססת, היא מאפשרת לבצע פנוטיפ מקיף של מערכות שורשים ותגובה לעקה אביוטית. ניתן לאפיין קבוצה של 10 זנים במשך ניסוי כולל של פחות משלושה חודשים.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול להערכת מערכות שורשים של צמחים הגדלים באדמה באמצעות דימיון RGB ודימיון היפרספקטרלי. השילוב של שיטות דימיון אלו מספק תובנות לגבי הדינמיקה והארכיטקטורה של שורשי הצמח.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- פנוטיפיקה של צמחים
- ארכיטקטורת שורשים
- טכניקות דימות
רקע
- הבנת מערכות השורשים היא קריטית לשיפור ההכחרה של צמחים.
- ארכיטקטורות שורשים שונות תורמות לעמידות בפני עקה אביוטית.
- הדמיה היפרספקטרלית יכולה לחשוף שינויים פיזיקו-כימיים בריזוספירה.
- הכנה קפדנית של ריזובוקסים חיונית להדמיה מדויקת.
מטרת המחקר
- להשגת מידע מקיף על שורשי צמחים בריזובוקסים מלאים באדמה.
- לשילוב דימות RGB ודימות היפר-ספקטרלי לצורך ניתוח משופר.
- למענה על שאלות מפתח בפנוטיפיקה ובהכלאה של צמחים.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הכנת ריזובוקסים (rhizoboxes) עם קרקע שהורטבה מראש.
- דימות RGB להערכת ארכיטקטורת השורשים.
- דימות היפר-ספקטרלי לניתוח התפקוד של השורשים.
- כיול הגדרות הדימות לרכישת נתונים מדויקת.
תוצאות עיקריות
- דימיון מוצלח של מערכות שורשים באמצעות טכניקות משולבות.
- זיהוי התנאים האופטימליים לנראות השורשים.
- תובנות לגבי הקשר בין ארכיטקטורת השורשים לבין עמידות למסמיכים (stress resistance).
- הדגמת יעילות השיטה בסביבה מבוקרת.
מסקנות
- גישת הדימוג המשולבת משפרת את ההבנה של דינמיקת השורשים.
- ניתן להחיל את המתודולוגיה על מיני צמחים שונים לצורכי מחקר.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על ממצאים אלו כדי לשפר אסטרטגיות לביהוץ צמחים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית ניהולית
פנוטיפיקה של מערכת השורשים מספקת תובנות קריטיות עבור תוכניות לשיפור גידולים חקלאיים המכוונות לסבילות לעקה אביוטית וליעילות ניצול משאבים. שילוב של דימות RGB ודימות היפר-ספקטרלי מאפשר הערכה בו-זמנית של ארכיטקטורת השורשים ותכונות תפקודיות של הריזוספירה, ובכך תומך בתיקוף יעדים בשלבים מוקדמים בביוטכנולוגיה חקלאית. גישה משולבת זו מגבירה את הביטחון החזוי בקישור תכונות תת-קרקעיות לביצועים פנוטיפיים תחת תנאי עקה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות לגבי ארכיטקטורת השורשים הקשורות לעמידות לבש drought ויעילות ספיגת חומרים מזינים.
- ערך תפעולי: מספק מדדים כמותיים ולא פולשניים להתפתחות מערכת השורשים לאורך זמן במערכות מבוססות קרקע.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: נתונים היפר-ספקטרליים משפרים את דיוק הסגמנטציה של השורש והקרקע, ובכך מפחיתים את מספר השליליים המדוים בכימות תכונות השורש.
- ערך תפעולי: מאפשר פרוטוקולי דימות סטנדרטיים וניתנים לשחזור עבור פלטפורמות לפנוטיפיקה של שורשים בעוצמה גבוהה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך במתאם בין דפוסי ספיגת מים של השורשים לתגובות פיזיולוגיות מעל פני השטח תחת עקה מבוקרת.
- ערך תפעולי: מסייע ברצף תרגומי משלב פנוטיפיקה של גילוי למודלים של תגובה לעקה הרלוונטיים לשטח.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה תומכת בתהליכי עבודה של גילוי מוקדם באמצעות אספקת נתוני שורש מבניים ותפקודיים, המנחים את בחירת המטרה ואת הפחתת הסיכונים המכניסטיים בצינורות פיתוח של תכונות גידולים חקלאיים.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת השערות לגבי ארכיטקטורת מערכת השורשים ותרומתה לפנוטיפים של עמידות לעקה.
- סריקה: מספקת פלטים כמותיים וסטנדרטיים של מורפולוגיית השורשים וספקטרום, המתאימים לתיקוף בדיקות.
- אנליטיקה: מספקת נתונים כימومتריים ומיפוי תכולת מים לצורך קישור תכונות פונקציונליות וניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מקשרת פלטים של דימות שורשים לתגובות פיזיולוגיות של הצמח כולו, ובכך תומכת ברציפות לקראת תיקוף פרה-קליני.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמת דימות הניתנת לשימוש חוזר, הישימה על מיני גידולים שונים ותרחישי עקה מגוונים.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בקשר בין תכונות שורשים לעמידות לעקה אביוטית באמצעות פנוטיפויינג רב-מודאלי.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזוריות ויכולת הרחבה (scalability) של דימוי שורשים בין סדרות ניסויים ומעבדות שונות.
- ערך אסטרטגי: מפחית סיכון ביולוגי בקידום תכונות על ידי מתן אפשרות לגילוי מוקדם של פנוטיפים לא רצויים של השורשים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מבוסס נתונים של זני גידולים חקלאיים בהתבסס על ביצועים מאומתים של מערכת השורשים תחת עקה.
שיקולי יישום
- ביצוע הפרוטוקול דורש מומחיות בפיזיולוגיה של צמחים, מערכות דימוי וניתוח נתונים ספקטרליים.
- הציוד הנדרש כולל מצלמות RGB, חיישנים היפר-ספקטרליים, תאורה מבוקרת ותאי סביבה.
- סטנדרטיזציה בין צוותים מחייבת הכנה עקבית של הריזובוקס (rhizobox), הגדרות תאורה ופרמטרים אחידים של רכישת תמונות.
- התאמה לסוגי קרקע שונים או למבני שורשים שונים עשויה להצריך התאמות בספי סגמנטציה ובפרוטוקולי כיול.
- מגבלות מעשיות כוללות זמני רכישה ועיבוד ארוכים יותר עבור נתונים היפר-ספקטרליים בהשוואה לדימוי RGB.
