Name: דור יעיל ועריכה של נטול מזין IPSCs מתאי הלבלב האנושי באמצעות מערכת CRISPR-Cas9 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: למד לייצר תאי גזע iPSCs ללא עקבות מתאי לבלב אנושיים ולערוך אותם באמצעות CRISPR-Cas9. השיטה מאפשרת יצירת שורות תאים ערוכות באמינות גבוהה ללא מוזאיקה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה במעבדה נתמך על ידי מענק בתר Nandal ד ר דני פחימה, וגראנט גישוש קרן מחקר תאי הגזע מרילנד ל BT (TEDCO).

<ol><li>Malik, N., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+methods+for+human+iPSC+derivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A review of the methods for human iPSC derivation.</a> Methods Mol. Biol. 997, 23-33 (2013).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+generation+using+a+single+lentiviral+stem+cell+cassette%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette.</a> Stem cells. 27, 543-549 (2009).</li>
<li>Macarthur, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+by+a+nonintegrating+RNA+Sendai+virus+vector+in+feeder-free+or+xeno-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+Int%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells by a nonintegrating RNA Sendai virus vector in feeder-free or xeno-free conditions.</a> Stem cells Int. , 564612(2012).</li>
<li>Li, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytoplasmic+RNA+vector+derived+from+nontransmissible+Sendai+virus+with+efficient+gene+transfer+and+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression.</a> J Virol. 74, 6564-6569 (2000).</li>
<li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus%2C+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Jpn.+Acad.+Ser.+B%2C+PhysBiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proc. Jpn. Acad. Ser. B, PhysBiol. Sci. 85, 348-362 (2009).</li>
<li>Nakagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+efficient+feeder-free+culture+system+for+the+derivation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells.</a> Sci. Rep. 4, 3594(2014).</li>
<li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Cell stem cell. 18, 573-586 (2016).</li>
<li>Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Based+Technologies+for+the+Manipulation+of+Eukaryotic+Genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes.</a> Cell. 169, 559(2017).</li>
<li>Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Based+Technologies+for+the+Manipulation+of+Eukaryotic+Genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes.</a> Cell. 168, 20-36 (2017).</li>
<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat. Biotech. 32, 347-355 (2014).</li>
<li>McElroy, S. L., Reijo Pera, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+feeder+cells+for+human+embryonic+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of mouse embryonic fibroblast feeder cells for human embryonic stem cell culture.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E1848-E1857 (2012).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotech. 32, 1121-1133 (2014).</li>
<li>Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+technology%3A+a+decade+of+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 16, 115-130 (2017).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+CRISPR%2FHDR-mediated+knock-in+for+mouse+embryonic+stem+cells+and+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes.</a> BioTechniques. 59, (2015).</li>
<li>Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+CRISPR%2FCas9-mediated+precise+genome+editing+by+improved+design+and+delivery+of+gRNA%2C+Cas9+nuclease%2C+and+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotech%22%5BJournal%5D)">Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA.</a> J Biotech. 241, 136-146 (2017).</li>
</ol>

BT הוא חבר מייסד של לשפץ החיים בע מ

תכנות מחדש של תאים סומטיים האנושי iPSCs סיפקה דחיפה גדולה בתחומי מחקר בסיסי ביולוגיה, רפואה אישית, מידול המחלה, פיתוח תרופות, רפואה רגנרטיבית16. שיטות רבות הנוכחי והשימוש בהם נפוץ דור אנוש iPSC דורשים שימוש וירוס עם הסיכון של אינטגרציה לתוך הגנום מארח או וקטורים episomal עם נמוך התכנות יעילות. כאן, אנו מציגים דרך יעילה ליצירת iPSCs נטולת מזין מתאי הלבלב האנושי עם סנדאי-וירוס, מה שמוביל ' חינם ' וטביעת התכנות יעיל. IPSCs האנושית וכתוצאה מכך הן ללא transgenes ויראלי, לשמור על pluripotency, להימנע מש...

תכנות מחדש של תאים סומטיים האנושי המדינה pluripotent על ידי ביטוי של התכנות גורמים יש מהפכה מחקר תאי גזע עם יישומים מידול המחלה, רפואה רגנרטיבית ו פיתוח תרופות. מספר שיטות התיכנות נגיפי זמינים עבור משלוח של התכנות גורמים ותפיק iPSCs, אבל התהליך עבודה אינטנסיבית, לא יעיל מאוד1. השיטות ויראלי, אבל יעיל, הם קשורים לבעיות של נגיף אינטגרציה ו- tumorigenicity-2,-3,-4. כתב יד זה, אנו מדווחים על השימוש של וירוס סנדאי cytoplasmic התכנות גורמים מתן ו הקמת קווי ללא טביעת רגל iPSC חוסר אינטגרציה של כל רצפי וקטור ויראלי לתוך הגנום שלהם5. סנדאי וירוס הוא וירוס רנ א הוא מדולל מחוץ לתא הציטופלסמה ~ 10 קטעים לאחר הזיהום ומייצרת גורמים התיכנות בשפע, שמוביל מהיר ויעיל התכנות6,7. IPSCs הוקמה יכול ואז ניתן בקלות לקביעת נטולת מזין בינוני כדי למנוע את השימוש בעכבר מתחלקים fibroblasts (MEFs) כ מזין תאים8.
בפרסום זה, בנוסף חלוקה לרמות את הוירוס סנדאי מתווכת התכנות, אנו מתארים גם פרוטוקול משופרת עבור עריכת iPSCs, אשר יש הפוטנציאל לספק תאים אנושיים ללא הגבלה עם שינויים גנטיים הרצוי למחקר. השתמשנו בטכנולוגיה CRISPR/Cas9 עבור השינוי של iPSCs, אשר נמצא כעת בשימוש עבור מגוון רחב של יישומים כולל תוספות לדפוק על הדלת, הסתרה, מחיקות גנומית רחבת היקף, במאגר הספרייה הקרנת לגילוי גנים, הנדסה גנטית של מודל אורגניזמים רבים, ו ג'ין טיפול9,10,11. טכניקה זו כוללת הקמת מתחמי של סטרפטוקוקוס הפישחה ינפל תומימת-נגזר נוקלאז Cas9 20-מר מדריך RNAs להשיג זיהוי המטרה באמצעות בסיס תיאום עם רצף גנומית היעד הסמוכים סמוכים ב נוקלאוטיד protospacer 3' רצף מוטיב (פאם). נוקלאז Cas9 המניע של נוקלאוטידים הפסקה נטושים זוגי ~ 3 מאתר פאם, אשר לאחר מכן תוקן בעיקר עד סוף שאינם הומולוגיים להצטרף (NHEJ) לשביל המוביל שהתוספות או המחיקות מסגרת קריאה פתוחה, ובכך פונקציונלי הסתרה של הגנים12.
פרוטוקול משופר שלנו כוללת את הפרטים עבור התרבות של תאים בלבלב האנושי, שלהם התכנות על mitotically לא פעיל העכבר מתחלקים fibroblasts (MEFs) כדי להשיג יעילות גבוהה יותר של התכנות, עיבוד עוקבות לתרבות נטולת מזין על Matrigel, אפיון הוקמה iPSCs, CRISPR מודרכת RNA עיצוב ו הכנה, משלוח לתוך iPSCs כמו מתחמי RNP, תא בודד מיון כדי ליצור שורות המשובטים iPSCs הערוך, קל הקרנת זיהוי של עריכות, ואפיון של תא בודד שיבוטים. מחיקות גנומית נוצרו ביעילות במחקר זה המבוא של חלבונים Cas9, שני CRISPR sgRNA RNP מתחמי לזירוז מעברי זוגי נטוש (DSBs), מחיקה של ההתערבות קטע. שיטה זו הופך לרישית על השימוש של שני מדריכים ליצירת מחיקות מסגרת קריאה פתוחה, יעילות גבוהה של NHEJ שמוביל מספר נמוך של שיבוטים הזה צריך להתאפיין ולאחר סינון ראשוני קל של שיבוטים מאת נימי אוטומטית יחידת אלקטרופורזה, פרגמנט מנתח. אלה הגנום יעיל עריכה שיטות ליצירת מודלים מבוססי תאי גזע מחלות אנושיות תהפוך בקרוב גישה סטנדרטי, לא שגרתית במעבדה תאי גזע כלשהו. לבסוף הגנום מדויק עריכה יהפוך את זה אפשרי ללכת מעבר לתאי גזע המחלה דוגמנות, פוטנציאלי יכול לעזור לעודד טיפולים מבוססי תאים.

<table><tbody><tr><td>וקטורים נגיפיים של סנדאי - CytoTune-iPS 2.0 Kit</td><td>Invitrogen</td><td>A16517</td><td>הפשרה על קרח; S מס': 1</td></tr><tr><td>טריפסין EDTA</td><td>Gibco Life Tech</td><td>25300-054</td><td>0.05%, 100 מ"ל; S מס': 2</td></tr><tr><td>מעכב סלעים (Y-27632)</td><td>Milipore</td><td>SCM075</td><td>השתמש ב-10 &mu; M; מס' S: 3</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 בינוני</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td>S מס': 4</td></tr><tr><td>החלפת סרום (KSR)</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td>S מס': 5</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11960069</td><td>1X; S No: 6</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30071.03</td><td>Aliquot; S No: 7</td></tr><tr><td>L-גלוטמין (Glutamax, 100X), נוזלי</td><td>Thermo Scientific</td><td>35050061</td><td>1/100; S No: 8</td></tr><tr><td>חומצות אמינו לא חיוניות</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td>1/100; S מס': 9</td></tr><tr><td>2-מרקפטואתנול</td><td>גיבקו</td><td>21985023</td><td>55 מ"מ, 1/1,000; S מס': 10</td></tr><tr><td>Hausser Hemacytometers</td><td>Hausser Scientific</td><td>02-671-54</td><td>S No: 11</td></tr><tr><td>0.1% תמיסת ג'לטין</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7903</td><td>Incubate at 37&ordm; C למשך שעה; S מס': 12</td></tr><tr><td>נוגדן SSEA-4</td><td>Santacruz</td><td>sc-21704</td><td>1/100; S מס': 13</td></tr><tr><td>TRA-1-81 נוגדנים</td><td>איתות תאי</td><td>4745S</td><td>1/200; S No: 14</td></tr><tr><td>OCT4 נוגדן</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc-5279</td><td>1/1,000; S מס': 15</td></tr><tr><td>קולגן I, Rat Tail</td><td>Life Technologies</td><td>A10483-01</td><td>שמור על קור; S מס': 16</td></tr><tr><td>Alexa Fluor פלואורסצנטי 488/568 (נוגדנים משניים)</td><td>Invitrogen</td><td>A21202/A10042</td><td>1/2,000; מס' S: 17</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30028LS</td><td>1X; S מס': 18</td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמה 100 מ"מ</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td>S מס': 20</td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמה 96 בארות</td><td>Falcon</td><td>353078</td><td>S מס': 21</td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות 6 בארות</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td>S מס': 22</td></tr><tr><td>היקף ניתוח&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>S מס': 23</td></tr><tr><td>קולט אדים</td><td>NuAire</td><td>NU-301</td><td>S מס': 24</td></tr><tr><td>15&nbsp; צינור צנטריפוגה מ"ל</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>188271</td><td>S מס': 25</td></tr><tr><td>50&nbsp; מ"ל צינור צנטריפוגה</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>227261</td><td>S מס': 26</td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>Invitrogen</td><td>11360</td><td>S מס': 28</td></tr><tr><td>&בטא;-מרקפטואתנול</td><td>סיגמא</td><td>M7522</td><td>S מס': 29</td></tr><tr><td>Prigrow III בינוני</td><td>ABM</td><td>TM003</td><td>S מס': 31</td></tr><tr><td>רוזנות וסחר; Cell Counter</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td>S No: 32</td></tr><tr><td>מערכת רנטגן Faxitron</td><td></td><td>CellRad</td><td>S מס': 33</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative cell Technologies</td><td>AT-104</td><td>S מס': 34</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Life Technologies</td><td>17104019</td><td>מלאי 1 מ"ג/מ"ל; S No: 35</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7923</td><td>S No: 36</td></tr><tr><td>hESC מוסמך מטריג'ל</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td>לדילול, השתמש ב-DMEM/F-12 קר; מס' S: 37</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R & D</td><td>233-FB</td><td>מלאי 10 ug/ml; מס' S: 38</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>EMS</td><td>15710</td><td>4% מניות ב-PBS; מס' S: 39</td></tr><tr><td>TRA-1-60</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc-21705</td><td>1/100; מס' S: 40</td></tr><tr><td>NANOG</td><td>ReproCELL</td><td>RCAB0004P-F</td><td>1/100; S No: 41</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416-100ML</td><td>S No: 42</td></tr><tr><td>ערכת פוספטאז אלקליין</td><td>Stemgent</td><td>00-0055</td><td>S מס': 43</td></tr><tr><td>חלבון Cas9</td><td>PNA Bio</td><td>CP01-50</td><td>הפשרה ועליון; S No: 44</td></tr><tr><td>סרום עז או חמור</td><td>Sigma</td><td>D9663/G9023</td><td>S No: 45</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-100ML</td><td>S No: 46</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Scientific</td><td>D1306</td><td>S No: 47</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>9285-100ML</td><td>S No: 48</td></tr><tr><td>NaCL</td><td>Sigma</td><td>S7653-250G</td><td>S No: 49</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>BP2482-500</td><td>S No: 50</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>NEB</td><td>M0202T</td><td>S No: 51</td></tr><tr><td>Mega Shortscript T7 kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM1354</td><td>S No: 52</td></tr><tr><td>Mega Clear kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM1908</td><td>S No: 53</td></tr><tr><td>SMC4</td><td>BD Biosciences</td><td>354357</td><td>S No: 54</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7159</td><td>S No: 55</td></tr><tr><td>CloneJET ערכת שיבוט</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1232</td><td>S No: 56</td></tr><tr><td>מנתח שברים TM</td><td>Advanced אנליטי</td><td></td><td>S מס': 57</td></tr><tr><td>mTeSR1 ערכה בינונית</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5850</td><td>חם לטמפרטורת החדר; S מס': 58</td></tr><tr><td>הקפאה בינונית mFreSR&trade;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5855</td><td>S No: 59</td></tr><tr><td>מדיום הקפאה CryoStor&reg;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7930</td><td>S No: 60</td></tr><tr><td>MEFs</td><td>Globalstem</td><td>GSC-6301G</td><td>S No: 61</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td>S No: 62</td></tr><tr><td>תאי לבלב אנושיים</td><td>ABM</td><td>T0159</td><td>S מס': 63</td></tr><tr><td>STEMdiff&trade; אינדוקציה עצבית</td><td>טכנולוגיות תאי גזע</td> בינוניות <td>5835</td><td>S מס': 64</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Thermofisher</td><td>11875-093</td><td>S מס': 65</td></tr><tr><td>2% B27-אינסולין</td><td>Thermofisher</td><td>A1895601</td><td>S מס': 66</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemcell Technologies</td><td>72052</td><td>S No: 67</td></tr><tr><td>IWP4</td><td>Stemcell Technologies</td><td>72552</td><td>S No: 68</td></tr><tr><td>2% B27</td><td>Thermofisher</td><td>17504044</td><td>S מס': 69</td></tr><tr><td>MCDB 131</td><td>Life Technologies</td><td>10372019</td><td>S מס': 70</td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S8761-100ML</td><td>S מס': 71</td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G8270-100G</td><td>S מס': 72</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Proliant</td><td>68700</td><td>S מס': 73</td></tr><tr><td>GDF8</td><td>Pepro-Tech</td><td>120-00</td><td>S מס': 74</td></tr><tr><td>TUJ1 נוגדן</td><td>EMD Milipore</td><td>AB9354</td><td>S מס': 75</td></tr><tr><td>NKX2-5 נוגדן</td><td>סנטה קרוז</td><td>SC-14033</td><td>S מס': 76</td></tr><tr><td>SOX17 נוגדן</td><td>R & D מערכות</td><td>AF1924</td><td>S מס': 77</td></tr><tr><td>Propidium iodide</td><td>Thermo Scientific</td><td>P3566</td><td>S No: 78</td></tr><tr><td>Amaxa 4D-nucleofector&trade;</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002</td><td>S מס': 79</td></tr><tr><td>FACSAria II (סדרן תאים)</td><td>BD מדעי הביולוגיה</td><td>SORP UV</td><td>S מס': 80</td></tr></tbody></table>

דור יעיל ועריכה של נטול מזין ipscs מתאי הלבלב האנושי באמצעות מערכת crispr-cas9

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

תאי גזע עובריים, המושרה pluripotent ניתן לחדש את עצמי, להבדיל לתוך מספר סוגי תאים של הגוף. תאים pluripotent הם לפיכך חמד לחקר רפואה רגנרטיבית, נמצאים כיום ניסויים קליניים עבור מחלות עיניים, סוכרת, מחלות לב והפרעות אחרות. היכולת להתמיין סוגי תאים מיוחדים בשילוב עם ההתקדמות האחרונה הגנום עריכה טכנולוגיות כולל מערכת CRISPR/רשויות אישורים מספק הזדמנויות נוספות תפירת הגנום של iPSC ליישומים מגוונים כולל מחלת דוגמנות, טיפול, ממתח מסלולים של בידול, שם כמה. בין הטכנולוגיות העריכה זמינים, CRISPR/Cas9 מ הפישחה ינפל תומימת סטרפטוקוקוס התפתחה ככלי של בחירה עבור עריכת בייעודי לאתר של הגנום האיקריוטים. CRISPRs הינם נגישים בקלות, זול ויעיל מאוד של הנדסת עריכות יישוב. המערכת מחייבת של נוקלאז Cas9 מדריך רצף (20-mer) ספציפי אל המטרה גנומית סמוכים 3-נוקלאוטיד "הגולה" protospacer-צמוד-מוטיב (פאם) עבור המיקוד Cas9 מיקומה גנומית הרצוי, לצד מכשיר מעקב איגוד אוניברסלי Cas9 RNA ( יחד הנקראת RNA מדריך בודד או sgRNA). כאן אנו מציגים צעד אחר צעד פרוטוקול לדור יעיל של iPSC מזין-עצמאית, ללא טביעת רגל. ומתארות מתודולוגיות לעריכה הגנום של iPSC באמצעות את מתחמי ribonucleoprotein (RNP) Cas9. הגנום עריכת פרוטוקול יעיל, יכול להיות מרובב בקלות על-ידי sgRNAs טרום-complexing עבור יעד אחד או יותר עם החלבון Cas9 ואספקה בו זמנית לתוך התאים. לבסוף, אנו מתארים גישה פשוטה עבור זיהוי ואפיון של iPSCs בעריכה הרצוי. יחדיו, האסטרטגיות מחולקת לרמות צפויים כדי לייעל את הדור ועריכה של iPSC ליישומים סעפת.

בפרסום זה, אנו עוקבים אחריו פרוטוקול פשוט אך יעיל לדור של iPSC מתאי הלבלב האנושי באמצעות שילוב או ללא טביעת רגל וירוס סנדאי וקטורים. איור 1A מציג ייצוג סכמטי של פרוטוקול זה התיכנות. התאים בלבלב האנושי נרכשו מסחרית, תרבותי השלישי Prigrow בינוני, transduced עם וירוס סנדאי כפי שהוסבר לעיל. Transduced פלך בצורת בתאי הלבלב לא הראתה שינויים מורפולוגיים ~ 5 ימים לאחר התמרה חושית סנדאי וירוס ביום 0, אך אז להיות מעוגל עם גרעין גדול יותר, nucleoli. כמה מושבות הראשונים ...

זה הפרוטוקול מתאר בפירוט הדור של תאי גזע pluripotent המושרה ללא טביעת רגל (iPSCs) מתאי הלבלב האנושי בתנאים ללא מזין, ואחריו עריכה באמצעות ribonucleoproteins CRISPR/Cas9 ואפיון שונה תא בודד שיבוטים.

דור יעיל ועריכה של נטול מזין IPSCs מתאי הלבלב האנושי באמצעות מערכת CRISPR-Cas9

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לייצר תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים (iPSCs) נטולי עקבות (footprint-free) מתאי לבלב אנושיים בתנאים ללא תאי מאכילה (feeder-free), לאחר מכן לערוך את התאים באמצעות ריבונוקלאו-פרוטאינים של CRISPR-Cas9 ולבסוף לאפיין את השיבוטים (clones) של התאים הערוכים הבודדים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום עריכת הגנום של תאי גזע אנושיים, כגון יצירת iPSCs נטולי עקבות ועריכה באמצעות ריבונוקלאו-פרוטאינים של CRISPR-Cas9. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לייצר שורות שיבוטיות של iPSCs ערוכים באמינות גבוהה, ללא עדות לפסיפסיות (mosaicism).לאחר ציפוי של פלטת שש בארות בקולגן קר, זרע תאי לבלב ראשוניים של בני אדם במעבר מוקדם במצע Prigrow III ביום השני, כדי להשיג כ-2.5 x 10⁵ תאים או לפחות 60% התמסרות (confluency) לכל בארה ביום התעתוק או ביום אפס. ביום התעתוק, לאחר קציר וספירה של התאים בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הפשר על קרח סט אחד של מבחנות וקטור Sendai והוסף בזהירות את הנפחים המחושבים מכל מבחנה ל-1 mL של מצע Prigrow III שחומם מראש. ערבב את התמיסה בעזרת פיפוט עדין.שאבו את ה-Prigrow III מהתאים והוסיפו באיטיות את תערובת נגיפי התכנות מחדש לבארות. לאחר מכן, דגרו את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 degree Celsius למשך הלילה. עשרים וארבע שעות לאחר התעתוק, השליכו בזהירות את תערובת הנגיפים מהתאים והחליפו אותה במצע Prigrow III טרי.ביום השישי, הוסיפו 1 mL של תמיסה לניתוק תאים לתאים והדגרישם למשך 10 דקות. לאחר מכן, באמצעות Prigrow III עם מעכב ROCK, זרעו את כל התאים על צלחות של MEFs שהוכנו ביום הקודם. הדגרישו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך הלילה.יש להשגיח על הפלטות באופן סדיר כדי לזהות הופעת גושי תאים או מושבות המעידות על תאים שעברו תכנות מחדש, אשר יצרו אגרגטים קלונאליים בעלי מורפולוגיית "cobblestone" (ריצוף), גרעין גדול ונוקלאוֹלי. יש לסמן את מושבות ה-iPSC הפוטנציאליות ולבדוק את צמיחתן באופן סדיר. כמעט ארבעה שבועות לאחר ההעברה (transduction), לאחר הכנת פלטות MEF של 24 בארות, יש להכין ממבקת מטריקס על ידי חלוקה למנות (aliquoting) בהתאם למקדם הדילול המופיע בתעודת האנליזה.בחרו 24–48 מושבות והעבירו אותן לפלטות בעלות 24 בארות, מצופות בממברנת מטריקס (matrix membrane) ועם mTeSR1. דגרו את הפלטות למשך 24 שעות והחליפו את המצע מדי יום. לעיון בפרטים נוספים, ראו את הפרוטוקול הכתוב.הוסיפו 500 mcL של dispase כדי לנתק את המושבות החסונות שנשתלו על ממבנה הממברנה. לאחר דגירה של התאים למשך 20 דקות, שתלו אותם שוב בלוחות 12 בארות מצופים בממברנת מטריקס. הרחיבו ואפיינו את השיבטים באמצעות צביעת alkaline phosphatase, צביעה אימונואלקטורית ואנליזת FACS בהתאם לפרוטוקול הכתוב.כדי לבצע טרנספקציה לתאי HIPSCs לאחר סינתזה של SGRNAs לפי הפרוטוקול הכתוב, הכין תערובת מאסטר לנוקלאופקציה עבור כל דגימה על ידי שילוב של 0.5 mcg של חלבון Cas9 ו-0.5 mcg מכל SGRNA בנפח תגובה של 22 mcL. לאחר שאיבת המדיום המכיל מעכב ROCK, השתמש ב-2 mL של RTPBS לשטיפת כל באר של ISPCs. לאחר מכן, שאב את ה-PBS והוסף 1 mL של תמיסה לניתוק תאים.דגרו את הפלטה בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 דקות. השעיקו מחדש את התאים ב-3 mL של מצע mTeSR1 ובצעו פיפטינג עדין למעלה ולמטה כדי ליצור סספנסיה של תאים בודדים. העבירו את התאים המופרדים לפ menutup של צנטריפוגה בנפח 15 mL המכיל 5 mL של מצע mTeSR1.לתערובת המאסטר של הנוקלאופקציה (nucleofection master mix), הוסף 16.4 mcL של תוסף לתאי מקור P3 ו-3.6 mcL של תוסף מספר אחת מערכת ה-Nucleofector. לאחר ספירה וסבוב של התאים, השהה כל יחידה של 0.5 x 10 to the 6th תאים ב-22 mcL מתערובת המאסטר לטרנספקציה שהוכנה קודם לכן. העבר במהירות את התאים לתא המרכזי של באר אחת בפס Nucleocuvette.לאחר מכן, הכניסו את הפס אל מכשיר ה-Nucleofector ובצעו נוקליאפקציה לתאים באמצעות תוכנית CB150. מיד לאחר הנוקליאפקציה, הוסיפו במהירות 80 mcL של מצע mTeSR1 שחומם מראש ומכיל 10 micromolar של מעכב ROCK לכל באר של התאים שעברו נוקליאפקציה. ערבבו בעדינות באמצעות פיפוט למעלה ולמטה.העבירו בעדינות את התאים מהפס לתוך בארי של פלטה בעלת 12 בארי עם ממבנה ממברנה מצופה מראש, המכילה מצע mTeSR1 עם מעכב רוק (rock inhibitor). ביום השני של הדגירה לאחר הכנת פלטות ה-MEF, החליפו את המצע עבור ה-HIPSCs מ-mTeSR1 ל-mTeSR1 המועשר ב-1XSMC4 למשך שעתיים לפחות לפני מיון תאים בודדים. שאבו את המצע מה-HIPSCs והשתמשו ב-PBS כדי לשטוף בעדינות את התאים.לאחר מכן, הוסיפו 500 mcL של תמיסה לניתוק תאים לכל באר והדגירו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 דקות. צרו סספנסיות של תאים בודדים על ידי הוספת 1 mL של mTeSR1 לכל באר ושאיבה עדינה עם פיפט למעלה ולמטה מספר פעמים. מיינו תאים בודדים לבארי הפרדה של פלטת 96 באריים שהוכנה מראש.ארבעה ימים לאחר המיון, היווצרות מושבות צריכה להיות ניכרת. בנקודה זו, יש להחליף את מצע התרבית במצע HESC המועשר ב-1X SMC4. לאחר הפקת והרחבת ה-DNA של המטרה בהתאם לפרוטוקול הכתוב, השתמש בערכת fragment analyzer כדי להריץ את אזור הגנום של המטרה שהוגבר ב-PCR של כל השיבוטים דרך gel dye mix בהתאם להוראות היצרן.יש לאשר את שיבוטי ה-IPSC הפלוריפוטנטיים בהתאם לפרוטוקול הכתוב. לפני התעתוק של נגיף סנדאי (Sendai virus), תאי הלבלב מראים מורפולוגיה טיפוסית דמוית כישורים. מושבות קטנות וצפופות מופיעות על MEFs עד ליום ה-12, והן מזכירות מושבות של תאים פלוריפוטנטיים אנושיים.בדרך כלל, למושבות iPSC אנושיות שעברו תכנות מחדש מלא יש גבולות ברורים מאוד, וניתן להעביר אותן ביום 23 עד 30. כאן מוצגת מושבה מופרדת ביום 23. מוצגת כאן תמונת ניגודיות פאזה (phase contrast) טיפוסית של מושבת iPSC לאחר מעבר לתרבית בתנאים ללא תאי מאכיל (feeder-free), בעקבות תכנות מחדש של תאי לבלב באמצעות נגיף סנדאי (Sendai virus).מושבות IPSC שצבעו אדום בבדיקת פוספטאז אלקלי נמצאות מימין. ה-IPSCs אומתו באמצעות תסביג אימונוכימי עבור סמני הרב-פוטנציאליות OCT4 ו-NANOG, כפי שניתן לראות בלוחות אלו. בניסוי זה, ה-IPSCs צבעו באמצעות סמני שטח של התא ובסוף בוצע ניתוח FACS על תרחיף של תאים בודדים.הפסגה הירוקה מייצגת IPSCs לבלב, והפסגה הסגולה מכילה תאים שאינם IPSC. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמור על תנאים אספטיים או סטריליים עבור מיון תאים ותרבית תאים. לאחר פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון התמקדמות גנית (gene targeting) ב-iPSCs וב-ESCs, וניתן להשיב על שאלות נוספות על ידי ביצוע מודיפיקציות גנטיות מדויקות.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכישו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לייצר באופן מהימן IPSCs ללא עקבות (footprint-free) וללא תאי מאכילה (feeder-free), ולבצע עריכה גנומית באופן בי-אללי.

efficient-generation-editing-feeder-free-ipscs-from-human-pancreatic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

כלי עריכת גנום כגון מערכת CRISPR (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) שיפרו מאוד את יעילות מיקוד הגנים בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים (hiPSCs). כתב יד זה מתאר פרוטוקול ליצירת מדווח hiPSC ספציפי לשושלת באמצעות רקומבינציה הומולוגית בסיוע מערכת CRISPR/Cas.

דור יעיל של כתבים במכות ספציפיים Lineage hiPSC עצבי באמצעות CRISPR / Cas9 ומערכת Nickase זוגי Cas9

עריכת גנום של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) יכולה להיעשות במהירות וביעילות. מוצג כאן הליך ניסיוני חזק להנדסה גנטית של hPSCs כפי שמודגם על ידי עריכת מיקום נמל המבטחים AAVS1 כדי לבטא EGFP ולהציג עמידות לאנטיביוטיקה.

הקמת שורות תאי גזע pluripotent האדם בעריכה-הגנום: ממיקוד לבידוד

פרוטוקולים כדי ליצור קווים מוטנטים hPSC באמצעות פלטפורמת iCRISPR וכדי לבדל hPSCs לתאי β-כמו גלוקוז-תגובה מתוארת. שילוב של טכנולוגית עריכת הגנום עם בידול מכוון hPSC מספק פלטפורמה חזקה עבור הניתוח השיטתי של תפקיד גורמי שושלת בהתפתחות אנושית והתקדמות מחלה.

הגנום עריכה בימוי בידול של hPSCs עבור חקירת גורמים המשפיעים Lineage בהתפתחות האנושית הלבלב

עבור פרוטוקול מהיר CRISPR/Cas9-מתווכת ' שיבוש גנטי עכבר, התאים hematopoietic העיקרי של האדם מתואר במאמר זה. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins הם הציגו ויה אלקטרופורציה עם sgRNAs שנוצר דרך במבחנה שעתוק ו Cas9 מסחרי. יעילות העריכה גבוהה מושגות עם זמן מוגבל ועלות פיננסיים.

שיבוש גנטי יעילים ביותר מאתר ואנושי Hematopoietic ובתאים מאת CRISPR/Cas9

ניצול של Cas9 preassembled ribonucleoprotein מורכבים (RNP) היא שיטה חזקה לעריכת הגנום מדויק, יעיל. כאן, אנחנו להדגיש השירות שלה על פני מגוון רחב של תאים, אורגניזמים, כולל תאים אנושיים ראשי שני קלאסי והעתידיים דגם אורגניזמים.

הגנום משופרת עריכה עם Cas9 Ribonucleoprotein שונים תאים ואורגניזמים

המתוארים כאן הוא פרוטוקול עבור תיוג endogenously לידי ביטוי חלבונים עם תגי פלורסנט בתאי גזע pluripotent המושרה האנושי באמצעות CRISPR/Cas9. תאים putatively הערוך מועשרים ידי קרינה פלואורסצנטית מופעל מיון תא, שורות תאים המשובטים נוצרים.

חלבון אנדוגני תיוג-אנוש המושרה בתאי גזע Pluripotent באמצעות CRISPR/Cas9

המוצג כאן הוא פרוטוקול עבור CRISPR/Cas9 ריבונאנאופלפרוטאין מתווך יעיל עריכת גנים בתאי מיונקים באמצעות אלקטרופורציה שפופרת.

CRISPR/Cas9 ריבונואופפרוטאין-תיווך מדויק לעריכה גנטית על ידי אלקטרופורציה

פרוטוקול זה מספק שיטה כדי להקל על הדור של heterozygous או homozygous נוקלאוטיד שינויים באמצעות CRISPR-CAS9 בתאי גזע האדם pluripotent.

הדור של שינויים גנומית מוגדרים באמצעות CRISPR-CAS9 בתאי גזע האדם Pluripotent

כאן אנו מתארים שיטה מפורטת לעריכת גנים חלקה בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות פלסמיד תורם מבוסס piggyBac ומוטנט ניקאז Cas9. שתי מוטציות נקודתיות הוכנסו לאקסון 8 של לוקוס הגורם הגרעיני הפטוציטים 4 אלפא (HNF4α) בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs).

החדרת מוטציות נקודתיות לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות עריכת גנום חלקה

השיטה המוצגת מתארת את יצירתו של נוקאאוט גנטי בתיווך קריספר בקו תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) H9, המבטא ביציבות sgRNA המכוון לגן L2HGDH באמצעות מערכת העברת גנים בתיווך לנטיויראלי יעילה ביותר.

CRISPR-Cas9 תיווך מחיקת גנים בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שגודלו בתרבית בתנאים נטולי הזנה

למד לייצר תאי גזע iPSCs ללא עקבות מתאי לבלב אנושיים ולערוך אותם באמצעות CRISPR-Cas9. השיטה מאפשרת יצירת שורות תאים ערוכות באמינות גבוהה ללא מוזאיקה.

דור יעיל ועריכה של נטול מזין IPSCs מתאי הלבלב האנושי באמצעות מערכת CRISPR-Cas9

גלה סרטונים נוספים