דור יעיל ועריכה של נטול מזין IPSCs מתאי הלבלב האנושי באמצעות מערכת CRISPR-Cas9

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים ללא טביעת רגל או IPSCs מתאי לבלב אנושיים בתנאים נטולי מזין, לאחר מכן לערוך את התאים באמצעות ריבונוקלאופרוטאינים CRISPR-Cas9 ולבסוף לאפיין את שיבוטי התא הבודד ששונו. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום עריכת הגנום של תאי גזע אנושיים כגון יצירת IPSCs ללא טביעת רגל ועריכה עם ריבונוקלאופרוטאינים CRISPR-Cas9. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן ליצור קווים משובטים של IPSCs ערוכים באמינות גבוהה ואין עדות לפסיפס.

לאחר ציפוי צלחת שש בארות בקולגן קר, צלחת מעבר מוקדם של תאי לבלב ראשוניים אנושיים במדיום Prigrow III ביום השני כדי להשיג כ-2.5 x 10 ל-5 התאים או לפחות 60% מפגש לבאר ביום ההתמרה או יום האפס. ביום ההתמרה לאחר קציר וספירת התאים לפי פרוטוקול הטקסט, יש להפשיר על קרח סט אחד של צינורות וקטור סנדאי ולהוסיף בזהירות את הנפחים המחושבים של כל שפופרת ל-1 מ"ל של מדיום Prigrow III שחומם מראש. פיפטה בעדינות כדי לערבב את התמיסה.

שאפו את ה-Prigrow III מהתאים והוסיפו לאט לאט את תערובת הנגיפים המתכנתים מחדש לבארות. לאחר מכן דגרו על התאים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. עשרים וארבע שעות לאחר ההעברה, השליכו בזהירות את תערובת הנגיפים על התאים והחליפו אותה במדיום פריגרו III טרי.

ביום השישי, הוסף 1 מ"ל של תמיסת ניתוק תאים לתאים ודגר אותם למשך 10 דקות. לאחר מכן, באמצעות Prigrow III עם מעכב סלע, צלחו את כל התאים על צלחות של MEFs שהוכנו יום קודם. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

התבונן בלוחות באופן קבוע להופעתם של גושי תאים או מושבות המעידים על תאים מתוכנתים מחדש אשר ייצרו אגרגטים משובטים עם מורפולוגיה מרוצפת אבן וגרעין גדול וגרעינים. סמן את מושבות ה-IPSC הסבירות ובדוק אותן באופן קבוע אם הן גדלות. כמעט ארבעה שבועות לאחר הטרנסדוקציה לאחר הכנת 24 לוחות MEF באר, הכינו את קרום המטריצה על ידי ציטוט על סמך גורם הדילול בתעודת הניתוח.

בחר 24-48 מושבות והעביר אותן לקרום מטריצה מצופה 24 צלחות באר עם mTeSR1. דגרו את הצלחות למשך 24 שעות והחליפו את המדיום מדי יום. עיין בפרוטוקול הטקסט לפרטים נוספים.

הוסיפו 500 מק"ל של דיספאז כדי לנתק את המושבות החזקות המצופות על קרום המטריצה. לאחר דגירה של התאים למשך 20 דקות, צלחו אותם שוב על קרום מטריצה מצופה 12 צלחות באר. הרחב ואפיין את השיבוטים באמצעות צביעת פוספטאז אלקליין, צביעה חיסונית וניתוח FACS בהתאם לפרוטוקול הטקסט.

כדי להעביר HIPSCs לאחר סינתזה של SGRNAs על פי פרוטוקול הטקסט, הכינו תערובת מאסטר של nucleofaction עבור כל דגימה על ידי שילוב של 0.5 מק"ג של חלבון Cas9 ו-0.5 מק"ג של כל SGRNA בנפח תגובה של 22 מק"ל. לאחר שאיבת המדיום המכיל מעכב סלעים, השתמש ב-2 מ"ל של RTPBS כדי לשטוף כל באר של ISPCs. לאחר מכן שאפו את ה-PBS והוסיפו 1 מ"ל של תמיסת ניתוק תאים.

דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. השעו מחדש את התאים ב-3 מ"ל של מדיום mTeSR1 והעבירו בעדינות פיפטה למעלה ולמטה כדי ליצור תרחיף תא בודד. העבירו את התאים המנותקים לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של מדיום mTeSR1.

לתערובת המאסטר של הנוקלאופקציה יש להוסיף 16.4 מק"ל של תוסף תאים ראשוניים P3 ו-3.6 מק"ל של תוסף אחד מערכת Nucleofector. לאחר ספירה וסיבוב התאים, השעו מחדש כל יחידה של 0.5 x 10 לתאים השישיים ב-22 מק"ל של תערובת המאסטר של הטרנספקציה שהוכנה קודם לכן. העבירו במהירות את התאים לתא המרכזי של באר אחת של רצועת נוקלאוקובט.

לאחר מכן, הנח את הרצועה במכשיר Nucleofector וגרעין את התאים באמצעות תוכנית CB150. לאחר נוקלאופקציה, הוסף במהירות 80 מק"ל של מדיום mTeSR1 מחומם מראש המכיל 10 מעכבי סלע מיקרו-מולאריים לכל באר של התאים הגרעיניים. מערבבים בעדינות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.

העבירו בעדינות את התאים מהרצועה לבארות של קרום המטריצה מצופה מראש 12 צלחת באר המכילה מדיום mTeSR1 עם מעכב סלע. ביום השני לדגירה לאחר הכנת לוחות MEF, החלף את המדיום ב-HIPSCs מ-mTeSR1 ל-mTeSR1 בתוספת 1XSMC4 למשך שעתיים לפחות לפני מיון תא בודד. שאפו את המדיום מ-HIPSCs והשתמשו ב-PBS כדי לשטוף בעדינות את התאים.

לאחר מכן הוסיפו 500 מק"ל של תמיסת ניתוק תאים לכל באר ודגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. צור תרחיף תא בודד על ידי הוספת 1 מ"ל של mTeSR1 לכל באר ופיפטה בעדינות למעלה ולמטה מספר פעמים. מיין תאים בודדים לבארות בודדות של צלחת 96 בארות שהוכנה בעבר.

ארבעה ימים לאחר המיון, היווצרות המושבה אמורה להיות ניכרת. בשלב זה, החלף את מדיום התרבית במדיום HESC בתוספת 1X SMC4. לאחר חילוץ והרחבת ה-DNA של היעד בהתאם לפרוטוקול הטקסט, השתמש בערכת מנתח שברים כדי להפעיל את אזור היעד הגנומי המוגבר של ה-PCR של כל השיבוטים דרך תערובת צבע הג'ל לפי הוראות היצרן.

אשר שיבוטי IPSC פלוריפוטנטיים בהתאם לפרוטוקול הטקסט. לפני התמרת נגיף סנדאי, תאי הלבלב מראים מורפולוגיה אופיינית דמוית ציר. מושבות קטנות והדוקות מופיעות על MEFs עד היום ה-12 הדומות למושבות תאים פלוריפוטנטיים אנושיים.

בדרך כלל, למושבות ה-IPSC האנושיות שתוכנתו מחדש יש גבולות ברורים מאוד וניתן לאסוף אותן בימים 23 עד 30. מושבה מנותקת ביום ה-23 מוצגת כאן. מוצגת כאן תמונת ניגוד פאזה טיפוסית של מושבת IPSC לאחר קטיף ותרבית בתנאים נטולי הזנה לאחר תכנות מחדש של נגיף סנדאי של תאי הלבלב.

מושבות IPSC אדומות מוכתמות בפוספטאז אלקליין נמצאות מימין. IPSCs אושרו על ידי צביעה חיסונית עבור סמני הפלוריפוטנטיות OCT4 ו-NANOG כפי שניתן לראות בפאנלים אלה. בניסוי זה, IPSCs נצבעו בסמני פני התא וניתוח FACS בוצע על תרחיף תא בודד.

הפסגה הירוקה מייצגת IPSCs בלבלב, והפסגה הסגולה מכילה תאים שליליים של IPSC. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על תנאים אספטיים או סטריליים למיון תאים ותרבית תאים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מיקוד גנים ב-IPSCs ו-ESCs, וניתן לענות על שאלות נוספות על ידי ביצוע שינויים גנטיים מדויקים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור באופן אמין IPSCs ללא טביעת רגל וללא מזין ולבצע עריכת גנום באופן ביאללי.