דור יעיל ועריכה של נטול מזין IPSCs מתאי הלבלב האנושי באמצעות מערכת CRISPR-Cas9

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לייצר תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים (iPSCs) נטולי עקבות (footprint-free) מתאי לבלב אנושיים בתנאים ללא תאי מאכילה (feeder-free), לאחר מכן לערוך את התאים באמצעות ריבונוקלאו-פרוטאינים של CRISPR-Cas9 ולבסוף לאפיין את השיבוטים (clones) של התאים הערוכים הבודדים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום עריכת הגנום של תאי גזע אנושיים, כגון יצירת iPSCs נטולי עקבות ועריכה באמצעות ריבונוקלאו-פרוטאינים של CRISPR-Cas9. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לייצר שורות שיבוטיות של iPSCs ערוכים באמינות גבוהה, ללא עדות לפסיפסיות (mosaicism).

לאחר ציפוי של פלטת שש בארות בקולגן קר, זרע תאי לבלב ראשוניים של בני אדם במעבר מוקדם במצע Prigrow III ביום השני, כדי להשיג כ-2.5 x 10⁵ תאים או לפחות 60% התמסרות (confluency) לכל בארה ביום התעתוק או ביום אפס. ביום התעתוק, לאחר קציר וספירה של התאים בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הפשר על קרח סט אחד של מבחנות וקטור Sendai והוסף בזהירות את הנפחים המחושבים מכל מבחנה ל-1 mL של מצע Prigrow III שחומם מראש. ערבב את התמיסה בעזרת פיפוט עדין.

שאבו את ה-Prigrow III מהתאים והוסיפו באיטיות את תערובת נגיפי התכנות מחדש לבארות. לאחר מכן, דגרו את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 degree Celsius למשך הלילה. עשרים וארבע שעות לאחר התעתוק, השליכו בזהירות את תערובת הנגיפים מהתאים והחליפו אותה במצע Prigrow III טרי.

ביום השישי, הוסיפו 1 mL של תמיסה לניתוק תאים לתאים והדגרישם למשך 10 דקות. לאחר מכן, באמצעות Prigrow III עם מעכב ROCK, זרעו את כל התאים על צלחות של MEFs שהוכנו ביום הקודם. הדגרישו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך הלילה.

יש להשגיח על הפלטות באופן סדיר כדי לזהות הופעת גושי תאים או מושבות המעידות על תאים שעברו תכנות מחדש, אשר יצרו אגרגטים קלונאליים בעלי מורפולוגיית "cobblestone" (ריצוף), גרעין גדול ונוקלאוֹלי. יש לסמן את מושבות ה-iPSC הפוטנציאליות ולבדוק את צמיחתן באופן סדיר. כמעט ארבעה שבועות לאחר ההעברה (transduction), לאחר הכנת פלטות MEF של 24 בארות, יש להכין ממבקת מטריקס על ידי חלוקה למנות (aliquoting) בהתאם למקדם הדילול המופיע בתעודת האנליזה.

בחרו 24–48 מושבות והעבירו אותן לפלטות בעלות 24 בארות, מצופות בממברנת מטריקס (matrix membrane) ועם mTeSR1. דגרו את הפלטות למשך 24 שעות והחליפו את המצע מדי יום. לעיון בפרטים נוספים, ראו את הפרוטוקול הכתוב.

הוסיפו 500 mcL של dispase כדי לנתק את המושבות החסונות שנשתלו על ממבנה הממברנה. לאחר דגירה של התאים למשך 20 דקות, שתלו אותם שוב בלוחות 12 בארות מצופים בממברנת מטריקס. הרחיבו ואפיינו את השיבטים באמצעות צביעת alkaline phosphatase, צביעה אימונואלקטורית ואנליזת FACS בהתאם לפרוטוקול הכתוב.

כדי לבצע טרנספקציה לתאי HIPSCs לאחר סינתזה של SGRNAs לפי הפרוטוקול הכתוב, הכין תערובת מאסטר לנוקלאופקציה עבור כל דגימה על ידי שילוב של 0.5 mcg של חלבון Cas9 ו-0.5 mcg מכל SGRNA בנפח תגובה של 22 mcL. לאחר שאיבת המדיום המכיל מעכב ROCK, השתמש ב-2 mL של RTPBS לשטיפת כל באר של ISPCs. לאחר מכן, שאב את ה-PBS והוסף 1 mL של תמיסה לניתוק תאים.

דגרו את הפלטה בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 דקות. השעיקו מחדש את התאים ב-3 mL של מצע mTeSR1 ובצעו פיפטינג עדין למעלה ולמטה כדי ליצור סספנסיה של תאים בודדים. העבירו את התאים המופרדים לפ menutup של צנטריפוגה בנפח 15 mL המכיל 5 mL של מצע mTeSR1.

לתערובת המאסטר של הנוקלאופקציה (nucleofection master mix), הוסף 16.4 mcL של תוסף לתאי מקור P3 ו-3.6 mcL של תוסף מספר אחת מערכת ה-Nucleofector. לאחר ספירה וסבוב של התאים, השהה כל יחידה של 0.5 x 10 to the 6th תאים ב-22 mcL מתערובת המאסטר לטרנספקציה שהוכנה קודם לכן. העבר במהירות את התאים לתא המרכזי של באר אחת בפס Nucleocuvette.

לאחר מכן, הכניסו את הפס אל מכשיר ה-Nucleofector ובצעו נוקליאפקציה לתאים באמצעות תוכנית CB150. מיד לאחר הנוקליאפקציה, הוסיפו במהירות 80 mcL של מצע mTeSR1 שחומם מראש ומכיל 10 micromolar של מעכב ROCK לכל באר של התאים שעברו נוקליאפקציה. ערבבו בעדינות באמצעות פיפוט למעלה ולמטה.

העבירו בעדינות את התאים מהפס לתוך בארי של פלטה בעלת 12 בארי עם ממבנה ממברנה מצופה מראש, המכילה מצע mTeSR1 עם מעכב רוק (rock inhibitor). ביום השני של הדגירה לאחר הכנת פלטות ה-MEF, החליפו את המצע עבור ה-HIPSCs מ-mTeSR1 ל-mTeSR1 המועשר ב-1XSMC4 למשך שעתיים לפחות לפני מיון תאים בודדים. שאבו את המצע מה-HIPSCs והשתמשו ב-PBS כדי לשטוף בעדינות את התאים.

לאחר מכן, הוסיפו 500 mcL של תמיסה לניתוק תאים לכל באר והדגירו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 דקות. צרו סספנסיות של תאים בודדים על ידי הוספת 1 mL של mTeSR1 לכל באר ושאיבה עדינה עם פיפט למעלה ולמטה מספר פעמים. מיינו תאים בודדים לבארי הפרדה של פלטת 96 באריים שהוכנה מראש.

ארבעה ימים לאחר המיון, היווצרות מושבות צריכה להיות ניכרת. בנקודה זו, יש להחליף את מצע התרבית במצע HESC המועשר ב-1X SMC4. לאחר הפקת והרחבת ה-DNA של המטרה בהתאם לפרוטוקול הכתוב, השתמש בערכת fragment analyzer כדי להריץ את אזור הגנום של המטרה שהוגבר ב-PCR של כל השיבוטים דרך gel dye mix בהתאם להוראות היצרן.

יש לאשר את שיבוטי ה-IPSC הפלוריפוטנטיים בהתאם לפרוטוקול הכתוב. לפני התעתוק של נגיף סנדאי (Sendai virus), תאי הלבלב מראים מורפולוגיה טיפוסית דמוית כישורים. מושבות קטנות וצפופות מופיעות על MEFs עד ליום ה-12, והן מזכירות מושבות של תאים פלוריפוטנטיים אנושיים.

בדרך כלל, למושבות iPSC אנושיות שעברו תכנות מחדש מלא יש גבולות ברורים מאוד, וניתן להעביר אותן ביום 23 עד 30. כאן מוצגת מושבה מופרדת ביום 23. מוצגת כאן תמונת ניגודיות פאזה (phase contrast) טיפוסית של מושבת iPSC לאחר מעבר לתרבית בתנאים ללא תאי מאכיל (feeder-free), בעקבות תכנות מחדש של תאי לבלב באמצעות נגיף סנדאי (Sendai virus).

מושבות IPSC שצבעו אדום בבדיקת פוספטאז אלקלי נמצאות מימין. ה-IPSCs אומתו באמצעות תסביג אימונוכימי עבור סמני הרב-פוטנציאליות OCT4 ו-NANOG, כפי שניתן לראות בלוחות אלו. בניסוי זה, ה-IPSCs צבעו באמצעות סמני שטח של התא ובסוף בוצע ניתוח FACS על תרחיף של תאים בודדים.

הפסגה הירוקה מייצגת IPSCs לבלב, והפסגה הסגולה מכילה תאים שאינם IPSC. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמור על תנאים אספטיים או סטריליים עבור מיון תאים ותרבית תאים. לאחר פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון התמקדמות גנית (gene targeting) ב-iPSCs וב-ESCs, וניתן להשיב על שאלות נוספות על ידי ביצוע מודיפיקציות גנטיות מדויקות.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכישו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לייצר באופן מהימן IPSCs ללא עקבות (footprint-free) וללא תאי מאכילה (feeder-free), ולבצע עריכה גנומית באופן בי-אללי.