Name: הייצור של מהונדסים אוגרים סוריים הזהב באמצעות הזרקת Pronuclear של המתחם CRISPR/Cas9 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: חקור את פרוטוקול ההזרקה הפרונוקליארית לייצור אוגרים סוריים מהונדסים גנטית באמצעות CRISPR/Cas9. השיטה מאפשרת יצירת מודלים חדשים למחלות אנושיות במחקר ביורפואי מתקדם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר דיווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIAID) של מכוני הבריאות הלאומיים תחת 1R41OD021979 מספר פרס (כדי ZW) ועל -ידי מענק מחקר של 21 BioGreen הדור הבא התוכנית, הרפובליקה של קוריאה, להעניק. לא. PJ01107704 (כדי ZW) ולהעניק לא. PJ01107703 (כדי IK). התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את נוף הרשמי של מכוני הבריאות הלאומיים או BioGreen 21. אנו מודים ד ר ניקולס Robl על עריכת כתב היד.

בהליכים המתוארים תחת פרוטוקול זה אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת יוטה (פרוטוקול IACUC: 2484). אוגרים המשמשים פרוטוקול זה הם מבוגרים (מגיל 6-10 שבועות) LVG זן הזהב אוגרים סוריים. אוגרים כל מלון את ביבר במרכז Bioinnovation, אוניברסיטת מדינת יוטה. בטמפרטורת החדר מוגדר ב 23 ° C, לחות מוגדרת ב- 40-50%, ולכן מחזור אור מוגדר 14L: 10D (בהירה: כהה). במידת האפשר, שגרות מניפולציה ו- surugical העובר צריכה להתבצע עם טכניקות סטרילי.
1. sgRNA והכנות Ribonucleoproteins (RNP) Cas9/sgRNA
<ol><li>לסנתז sgRNAs ביצוע במבחנה שעתוק הפרוצדורות המתוארות במדריך של ערכת סינתזה (חומרים לטבלה, נספח 1).</li>
	<li>להרכיב ribonucleoproteins, לערבב 2 µg של Cas9 עם µg 1 של sgRNA, דגירה המיקס בטמפרטורת החדר למשך 10-15 דקות. להזרקה PN, הופך הפתרון עובד-הריכוז של 100 ng/µL Cas9 ו 50 ng/µL sgRNA עם 10 מ מ טה מאגר (RNase חינם, חומרים טבלה).</li>
</ol>2. אופן ההכנה של עיקור
הערה: הניתוח מתבצע על אוגרים זכר רוב בגיל 6-8 שבועות. הניתוח צריך להתבצע 10-14 ימים לפני ההזדווגות הראשונה. עקרות אושר על ידי הריונות כושל מ להזדווג עם נקבות פורייה. עיקור זכרים ניתן בדרך כלל במשך שנה לפני שהם הופכים פעילים מינית פחות.
<ol><li>עזים ומתנגד זכרים באמצעות הזרקת בקרום הבטן (i.p.) של קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים מנה של 40 מ"ג/ק"ג (קטמין) ו- 10 מ"ג/ק"ג (חריגות השירותים הווטרינריים). לאשר הרדמה על ידי חוסר רפלקס פדלים (הבוהן צביטה).</li>
	<li>נעוץ האוגר מסומם הגבי recumbency על נייר טישו יבש. יש לשטוף הבטן עם שלושה סבבי הטיפולים חיטוי, לסירוגין כירורגי לקרצף פתרונות בין 70% אלכוהול povidone יוד.</li>
	<li>עושים חתך אנכי עם מספריים כירורגיים החל 1.5 ס מ הגולגולת כדי ערלה הארכת 1 ס מ מכל צד של קו אמצע (איור 1 א'). תחתכי את העור עורית, לינאה אלבה כדי לגשת אל החלל הצפק (איור 1b).</li>
	<li>הפעילו לחץ עדין ההיבט סימטרית של שק האשכים כדי לאלץ את האשכים ואת רקמת השומן החוצה. לתפוס את צינור הזרע בעדינות עם מלקחיים, הפרד בזהירות את כלי הדם מן vas עם עוד זוג מלקחיים (איור 1 c).</li>
	<li>להחזיק את צינור הזרע עם מלקחיים ליצירת לולאה. מחממים את קצה מלקחיים נוספת בלהבה עד שזה אדום ולאחר מכן להשתמש בו כדי להסיר את הלולאה של הזרע הזרע. הכנס רקמת שומן ועל האשכים אל הבטן. הסר את צינור הזרע על הצד היריב עם אותם הליכים.</li>
	<li>תפר מערכת השרירים הראשון ואחריהם תפירת העור. במקום החיה על כרית חמה בכלוב במשך 30 דקות עד החיה יחלים. להתבונן החיה עד מהפעולה מפעילות רגילה.</li>
</ol>3. תורם/נמען אוגר הכנת לוח זמנים
<ol><li>צג ולהקליט מחזורים estrous. הערה: אוגרים הנקבה יש 4 יציב-ימים של ייחום המתוחזק מיד לאחר parturition. ניתן לזהות נקבות ביום הראשון של estrous על ידי אטום, צהבהב, דביק הפרשות מהנרתיק (איור 2 א). נקבות ביום הרביעי של estrous ניתן לזהות באמצעות ריר שקוף, דביק (איור 2b).</li>
	<li>עבור superovulation של התורם אוגר, superovulate הנקבות בגרו (> 6 שבועות) ביום הראשון של ייחום בזריקה ה-IP של גונדוטרופין סרום של סוסה הרה (PMSG; מומס ב- PBS כמו 50 IU/mL) (טבלה 1) בין 9-12 AM. הערה: PMSG הוא עבור גרימת superovulation אך לא עבור סינכרון-ייחום.</li>
	<li>80 - h 84 לאחר הזרקה של PMSG (היום 4, 6-8 PM), מקום הנקבות בכלובים עם הזכרים להזדווגות. כמו אוגר matings התוצאה אינה הזדווגות מחבר, ודא matings מוצלחת על-ידי צפייה של matings.</li>
	<li>להכין נשים pseudopregnant על ידי הזדווגות הנקבות בגרו ביום הרביעי של estrous עם זכרים עיקור. לוח הזמנים של הכנת נקבות התורם וחתן מוצגות בטבלה מס ' 2. הערה: נקבות בהריון אמיתי יכול לשמש גם נמענים, קרי, נשים עם צבע הפרווה להבדיל בין צבע זהוב מעוצבת עם הזכרים פורה באותו צבע. הגורים נגזר השתלת ניתן לזהות המבוססת על צבעי סמל. יתרון פוטנציאליים באמצעות נקבות בהריון אמיתי הוא עוברי endogenously המיוצר להבטיח הריונות מוצלחים ולעזור PN מוזרק עוברי להשתיל; חיסרון פוטנציאליים באמצעות נקבות בהריון אמיתי כמו נמענים היא PN מוזרק עוברי צורך להתחרות עם endogenously המיוצר העוברים להשתלה.</li>
</ol>4. זיגוטה בידוד
<ol><li>להכין תרבות בינוני (HECM-9; מתכון מתוארת תוספת 2), כפי שתואר לעיל McKiernan ו- Bavister12.</li>
	<li>יום אחד לפני זריקה PN, להכין זיגוטה טיפול מנות (µL 25/טיפה) ויש ירידה הזרקת PN (100 µL) במכסה של מאכל 35 מ מ עם HECM-9. לאחר מכן מכסים את הטיפות בינוני עם שמן מינרלי. שיווי משקל בינוני באינקובטור ללון בתנאים הבאים: 37.5 ° C, 10% CO2, 85% N 5% או2, 2 , ו- 100% לחות.</li>
	<li>יום המתוזמנת עבור הזרקה PN, להכין מאכלים שטיפה העובר (אוגר צלחת/תורם 1) עם HECM-9 ולאחסן כל המנות בחממה עד השימוש.</li>
	<li>המתת חסד עם CO2אוגרים superovulated.</li>
	<li>בידוד oviduct<ol>
<li>הכנס אוגר נקבה לאללה recumbency הגבי מאסו כירורגי או ממחטת נייר ולהכין את הבטן עם תרסיס אתנול 70%.</li>
		<li>להחזיק העור, שכבת שריר הבטן בקו האמצע וביציבות בחתך. פצעים וחתכים של הצפק לחשוף את אברי הבטן.</li>
		<li>לאחוז באחד הקרניים הרחם עם מלקחיים בסדר ומשכו את הרקמה מהבטן. להפריד בין הרחם לבין הרקמה mesometrium ושומן. לעשות חתך בין של oviduct ו השחלה ואת חתך השני סמוך לצומת של oviduct ואת הרחם (כולל חלק קטן של הרחם). מקם את שני oviducts בצלחת ריקון אותו.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להוריד ולאסוף מופרות<ol>
<li>תחת המיקרוסקופ לנתיחה, תופס את הצד של קרן הרחם עם מלקחיים דומונט #5 להכניס מחט תוצרת בית (איור 3) לתוך לומן של oviduct אנד infundibular, לרוקן את oviduct עם 300-400 µL בינוני HECM-9.</li>
		<li>לאסוף את מופרות באופן מיידי ולשטוף אותם פעמיים עם HECM-9 במדיום הצלחת הטיפול. בשלב זה של התפתחות, כולן מופרות צריכה שברציונליות מתאי קומולוס.</li>
		<li>מקם את מופרות בתוך אינקובטור (37.5 ° C, 10% CO2, 5% או2, 85% N2 ו- 100% לחות) מיד לאחר איסוף כדי למזער את החשיפה לאור.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. PN הזרקה
<ol><li>להפשיר את RNP Cas9/sgRNA על הקרח ולשמור על המתחם על קרח במהלך התהליך הזרקת PN.</li>
	<li>לטעון את המחטים הזרקת Cas9/sgRNA RNP פתרון מיד לפני הניסויים הזרקה. מניחים על חלקו האחורי של המחטים הזרקה לתוך הצינור המכיל את הפתרון Cas9/sgRNA RNP ולאפשר הפתרון RNP Cas9/sgRNA כדי למלא את המחט על ידי נימיות.</li>
	<li>להכין את המנה הזרקת מחטים. למלא את פיפטה מחזיק שמן מינרלי כדי בתוך ~ 3 מ מ של העיקול של המחט למחזיק. למקם את המחזיק microinjector עם קצה המחט האופקי לתחתית של המנה ולמלא את קצה המחט בינונית ביניקה. הגדר את המחט זריקה בזווית של 10-15° מול בעל.</li>
	<li>הזרקת PN<ol>
<li>לזהות זיגוטה ולהחיל יניקה בסדר עם המחט למחזיק. באופן אידיאלי, pronuclei זכר ונקבה הם בתוך אותו טווח מוקד, במקביל מיושר למחזיק.</li>
		<li>לחדור את zona ואת זכר pronuclei (בשעה 3 עמדה) עם מחט ההזרקה.</li>
		<li>תיסוג המחט הזרקת במהירות ברגע pronucleus מתנפח כדי למנוע את הגרעין של הקפדה על המחט, כדי למנוע נזק של pronucleus.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. מופרות להעביר אוגרים Pseudopregnant
<ol><li>עזים ומתנגד אוגר pseudopregnant (באותה דרך בה המתוארות בסעיף הניתוח לעיל), תניח אותם על מאסו כירורגי או נייר טישו יבש recumbency הגחון.</li>
	<li>חומרי סיכה העין חלות על העיניים של החיה כדי למנוע יובש בעין, לכסות את הראש עם בד או נייר כדי להגן על העיניים מפני אור. הכן את הפן הלטראלי של הגוף על ידי גילוח שטח העור 4 ס"מ על 4 ס"מ על כל הצדדים של הגוף ולאחר מכן על-ידי החלת 3 פעמים של פי 3 70% אתנול קרצוף והחלוקים povidone יוד. לבצע חתך אנכי 2 ס מ 2 ס מ סימטרית הצלע האחרונה (כפי שמוצג דמויות 4a, 4b) בכל צד של החלק האחורי של החיה.</li>
	<li>משטח שמן עם מלקחיים ומשוך בעדינות עד oviduct של הרחם גלויים. תהדק את משטח שמן עם. טוב ומשקפים את משטח שמן dorsally מעל עמוד השדרה (איור 4 c). מקם את באיברי הרבייה כזה יכול להיות שחדר הצינור הרחם עם מחט מד 30 להעברת העובר (איור 4 d).</li>
	<li>לשטוף את מופרות מוזרק עם HECM-9 בתבשיל חדש. להשתמש על פיפטה מזכוכית חדש (קוטר: ~ 150-200 מיקרומטר) כדי לטעון מופרות 10-15. לארגן את מופרות כשרשרת פנינים ואחריו מספר בועות אוויר. להוסיף על פיפטה לתוך הצינור אף פתוח משלב 6.3, נשוף בעדינות לתוך פיפטה כדי להעביר את מופרות oviduct. המשיכו לנשוף עד בועת האוויר הראשון הוא שוחרר לתוך מערכת oviduct (איור 4e).</li>
	<li>לשחרר את משטח שמן ולחזור הרקמה אל הבטן. העברה בקירוב אותו מספר (10-15) של העוברים מוזרק עוד בדרכי oviduct על ידי התהליכים.</li>
	<li>תפר את מערכת השרירים והעור ב 2 שכבות. לנהל הבופרנורפין-HCL (0.5 מ ג/ק ג) subcutaneously כמו נגד כאבים לאחר הניתוח. לחזור האוגר בכלוב ולמקם את הכלוב על משטח חם להתאוששות. להחזיר את הכלוב לחדר בעלי חיים כאשר החיה הוא התאושש לחלוטין מן ההרדמה. משככי כאבים לאחר הניתוח מקבלים שוב כעבור 6 שעות.</li>
</ol>

<ol><li>Takahashi, M., Hori, M., Mutoh, M., Wakabayashi, K., Nakagama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+animal+models+of+pancreatic+carcinogenesis+for+prevention+studies+and+their+relevance+to+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Experimental animal models of pancreatic carcinogenesis for prevention studies and their relevance to human disease.</a> Cancers (Basel). 3 (1), 582-602 (2011).</li>
<li>Wold, W. S., Toth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+three--Syrian+hamster+as+an+animal+model+to+study+oncolytic+adenoviruses+and+to+evaluate+the+efficacy+of+antiviral+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Chapter three--Syrian hamster as an animal model to study oncolytic adenoviruses and to evaluate the efficacy of antiviral compounds.</a> Adv Cancer Res. , 69-92 (2012).</li>
<li>Thomas, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syrian+hamster+as+a+permissive+immunocompetent+animal+model+for+the+study+of+oncolytic+adenovirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Syrian hamster as a permissive immunocompetent animal model for the study of oncolytic adenovirus vectors.</a> Cancer Res. 66 (3), 1270-1276 (2006).</li>
<li>Thomas, M. A., Spencer, J. F., Wold, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+Syrian+hamster+as+an+animal+model+for+oncolytic+adenovirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Use of the Syrian hamster as an animal model for oncolytic adenovirus vectors.</a> Methods Mol Med. , 169-183 (2007).</li>
<li>Hogarth, C. A., Roy, A., Ebert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+evidence+for+the+absence+of+a+functional+cholesteryl+ester+transfer+protein+gene+in+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol+B+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genomic evidence for the absence of a functional cholesteryl ester transfer protein gene in mice and rats.</a> Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 135 (2), 219-229 (2003).</li>
<li>Ebihara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Syrian+golden+hamster+model+recapitulating+ebola+hemorrhagic+fever%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">A Syrian golden hamster model recapitulating ebola hemorrhagic fever.</a> J Infect Dis. 207 (2), 306-318 (2013).</li>
<li>Jove, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidomic+and+metabolomic+analyses+reveal+potential+plasma+biomarkers+of+early+atheromatous+plaque+formation+in+hamsters%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Lipidomic and metabolomic analyses reveal potential plasma biomarkers of early atheromatous plaque formation in hamsters.</a> Cardiovasc Res. 97 (4), 642-652 (2013).</li>
<li>Vairaktaris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hamster+model+of+sequential+oral+oncogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Oncol%22%5BJournal%5D)">The hamster model of sequential oral oncogenesis.</a> Oral Oncol. 44 (4), 315-324 (2008).</li>
<li>Paciello, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syrian+hamster+infected+with+Leishmania+infantum%3A+a+new+experimental+model+for+inflammatory+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Syrian hamster infected with Leishmania infantum: a new experimental model for inflammatory myopathies.</a> Muscle Nerve. 41 (3), 355-361 (2010).</li>
<li>Safronetz, D., Ebihara, H., Feldmann, H., Hooper, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Syrian+hamster+model+of+hantavirus+pulmonary+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">The Syrian hamster model of hantavirus pulmonary syndrome.</a> Antiviral Res. 95 (3), 282-292 (2012).</li>
<li>Fan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+targeting+in+golden+Syrian+hamsters+by+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient gene targeting in golden Syrian hamsters by the CRISPR/Cas9 system.</a> PLoS One. 9 (10), e109755(2014).</li>
<li>McKiernan, S. H., Bavister, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+one-cell+hamster+embryos+with+water+soluble+vitamins%3A+pantothenate+stimulates+blastocyst+production%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Culture of one-cell hamster embryos with water soluble vitamins: pantothenate stimulates blastocyst production.</a> Hum Reprod. 15 (1), 157-164 (2000).</li>
<li>Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+light+on+development+of+mammalian+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Effects of light on development of mammalian zygotes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (36), 14289-14293 (2007).</li>
</ol>

ZW יש אינטרסים כלכליים בביוגרפיה לדייק, LLC., חברה מתמחה ביצירת חיות מהונדס גנטית המחקר הביו-רפואי ויישומים חקלאיים.

כדאי לנצל את הפוטנציאל של אוגרים סוריים הזהב כמודלים של מחלות אנושיות, פיתחנו פרוטוקול הזרקת PN להעברת של CRISPR/Cas9 מורכבים כדי למקד את הגנום אוגר. פרוטוקול הזרקת PN מיטוב מספר משתני מפתח לרבות העובר תרבות בינוני, טמפרטורה, אורכי גל של אור13. ישנם גם מספר הליכים ספציפיים אוגר לטיפול בבעלי חיים צריך לעקוב בהצלחה המסויים ג'ין פילוח האוגר. לדוגמה, התבגר מינית אוגרים הנקבה יש יציבה מחזורים estrous 4 ימים שאין אפשרות לסנכרן עם הורמונים אקסוגני (למשל PMSG). לפיכך במדויק מעקב אחר שמחזורי estro...

האוגר הסורי הזהב (אם לדייק Mesocricetus) הוא אחד המכרסמים הנפוצה ביותר למחקר ביורפואי. על-פי מחלקת החקלאות של ארצות הברית, כ-100,000 אוגרים שימשו בארצות הברית בשנת 2015, המייצג 13% השימוש בבעלי חיים המעבדה הכולל בין המינים מכוסה על ידי חוק רווחת בעלי חיים (http://www.aphis.usda.gov; לגשת מרץ 10, 2017).
האוגר מציע כמה יתרונות על פני מכרסמים אחרים במחקר של מספר מחלות אנושיות. לדוגמה, אדנוקרצינומה בלבלב histopathology של N-nitrosobis(2-oxopropyl) אמין (BOP) המושרה ductal ב אוגר דומה גידולים בלבלב האנושי, בעוד הטיפול בופ מעוררת בעיקר גידולי בלוטת התריס חולדות, ריאות, גידולים בכבד עכברים1. בגלל אוגרים למכרסמים קטנים בלבד נמצאו כדי לתמוך את השכפול של adenoviruses, הם גם המודל של בחירה עבור בדיקות oncolytic המבוסס על אדנו וקטורים, אנטי-אדנו סמים-2,-3,-4. דוגמה נוספת שבה המודל אוגר מציע יתרון על עכברים וחולדות היא במחקר של היפרליפידמיה. אוגרים ובני להפגין קווי דמיון גדול בין משעולים חילוף החומרים של השומנים, בשני המינים הם נשאים של הגן קידוד cholesteryl אסתר העברה חלבון (CETP), אשר ממלא תפקיד מרכזי השומנים שיטות ההזנה, בעוד CETP הוא נעדר עכברים, חולדות5. בנוסף, אוגרים לפתח יותר נציג של הביטוי האנושי בעקבות חשיפה וירוס האבולה6hemorrhagic המחלה. אוגרים הם גם הדגמים של בחירה עבור הלומדים טרשת עורקים7, קרצינומות אוראלי8ו דלקתיים myopathies9. . לאחרונה, זה גם הוכח כי אוגרים הם רגישים מאוד זיהום בנגיף האנדים, לפתח מחלות כמו תסמונת ריאתי הנטא וירוס, מתן המודל מכרסמים רק Andes וירוס זיהום10.
כדי לענות על הצורך קיימים מודלים גנטי הרומן ללמוד את מחלות אנושיות איפה לא אמין דגם מכרסם קטן זמין, לאחרונה הצליחו החלה מערכת CRISPR/Cas9 על האוגר ואנו יצרו מספר שורות גנטית מתוכנן אוגרים11. אוגר מופרות רגישים מאוד milieus סביבתי כזה כי הפרוטוקולים הזרקת PN פותח במינים אחרים מתאימים למחייה. לכן, פיתחנו פרוטוקול הזרקת PN עבור אוגר התואם את דרישות מיוחדות לטיפול אוגר העוברים בתוך חוץ גופית. כאן, אנו מתארים את ההליך הזרקת PN מפורט באמצעות מערכת CRISPR/Cas9 והצעדים הנלווה, משלב הכנת מדריך בודד RNA (sgRNA) העברת העוברים מוזרק לתוך נקבות הנמען.

<table><tbody><tr><td>Cas9</td><td>Invitrogen</td><td>B25640</td><td>1 &mu; g/&mu; L (~6.1 &mu; M)</td></tr> <tr><td>ערכת סינתזה מדויקת של GeneArtTM</td><td>Invitrogen</td><td>A29377</td><td>לסינתזה sgRNA</td></tr><tr><td>אלבומין מסרום אנושי</td><td>Sigma</td><td>A1653</td><td>למדיום גידול</td></tr><tr><td>Illuminator</td><td>Nikon</td><td>NI-150</td><td>להעברת עוברים</td></tr><tr><td>אינקובטור</td><td>ניו ברונסוויק</td><td>גלקסי 14S</td><td>לגידול עוברים</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>PB-7</td><td>להכנת מחטי הזרקה</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE Ti-S</td><td>למיקרו-הזרקה</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>invitrogen</td><td>SMZ745T</td><td>להעברת עוברים</td></tr><tr><td>שמן מינרלי</td><td>Sigma</td><td>M1840</td><td>שמור בחושך</td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Sigma</td><td>G4877-2000IU</td><td>לביוץ</td></tr></tbody></table>

הייצור של מהונדסים אוגרים סוריים הזהב באמצעות הזרקת pronuclear של המתחם crispr/cas9

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

טכניקת ההזרקה (PN) pronuclear הוקם לראשונה בעכברים להציג חומרים גנטיים זרים לתוך pronuclei של שלב אחד-תא עוברי. החומר הגנטי הציג עשויים לשלב הגנום העוברי וצור הטרנסגניים חיות עם זרים מידע גנטי בעקבות העברת העוברים מוזרק לטפח אימהות. בעקבות ההצלחה בעכברים, הזרקת PN הוחל בהצלחה במינים בעלי חיים רבים אחרים. לאחרונה, הזרקת PN כבר בהצלחה מועסקים להציג ריאגנטים עם שינוי גנטי פעילויות, כגון מערכת CRISPR/Cas9, כדי להשיג שינויים בייעודי לאתר גנטית במעבדה מספר החווה מיני בעלי חיים. בנוסף מאסטרינג בערכה מיוחדת של מיומנויות microinjection כדי לייצר חיים מהונדסים בזריקה PN, חוקרים חייב להבין את הפיזיולוגיה של רבייה וההתנהגות של המין היעד, בגלל כל מיני מתנות ייחודיות אתגרים. לדוגמה, אוגר סורי זהוב עוברי יש ייחודי טיפול בדרישות במבחנה כזאת PN הזרקת טכניקות היו אפשריים במין זה עד פריצות דרך זה התבצעה על ידי הקבוצה שלנו. עם מינים-השתנה PN הזרקת הפרוטוקול שלנו הצלחנו לייצר מספר נוקאאוט גנטי (KO) ו knockin אוגרים (KI), אשר שימשו בהצלחה מודל מחלות אנושיות. כאן נתאר את הליך הזרקת PN מוסר את CRISPR/Cas9 מורכבים מופרות של האוגר, העובר טיפול בתנאים, נהלי ההעברה העובר ולאחר גידול הדרושה להפקת גנטית שונה אוגרים.

היעילות של הפרוטוקול המתואר בהפקת אוגרים מהונדסים תלוי התוצאות של שני קריטי בשלבים הבאים: live הילודה של נקבות הנמענים ואת מספר הגורים בשידור חי עם השינויים הגנטי המיועד. קצב הילודה live הוא של תוצאות ישירות של איכות העובר את המיומנות של הפרט מבצע את הזרקת PN העובר נהלי ההעברה. כדי להבטיח כי הפוטנציאל ההתפתחותי של עוברי מניפולציה לא נפגעת, נדרשת זהירות רבה במהלך הטיפול במבחנה של העוברים אוגר. אנחנו באופן קבוע להשיג שיעור הלידה live של 60-80% עם הנקבות הנמען pseudopregnant. <stron...

Pronuclear (PN) הזרקה של באשכולות באופן קבוע interspaced חזרה palindromic קצר (CRISPR), מערכת CRISPR-הקשורים חלבון-9 נוקלאז (CRISPR/Cas9) היא שיטה יעילה במיוחד להפקת מהונדס גנטית אוגרים סוריים הזהב. במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט של הזרקת PN לייצור של אוגרים נוקאאוט גנטי עם מערכת CRISPR/Cas9.

הייצור של מהונדסים אוגרים סוריים הזהב באמצעות הזרקת Pronuclear של המתחם CRISPR/Cas9

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לספק לצופים נהלים מפורטים להפקת חמסטרים סוריים זהובים מהונדסים גנטית באמצעות הזרקה לפרונוקליאו של קומפלקס CRISPR/Cas9. פרוטוקול הזרקה זו לפרונוקליאו, שפיתחנו בחמסטר סורי זהוב, מאפשר הנדסה גנטית בדור זה. טכנולוגיה זו מהווה תרומה משמעותית לתחום פיתוח מודלים של בעלי חיים.בשל הרגישות קיצונית של עוברים של המסטר לסביבה, פיתחנו פרוטוקול ייחודי להזרקה לפרונוקליאו (pronuclear injection) שמותאם לנישה המיוחדת של עוברי המסטר. פיתוח טכניקה זו מהווה צעד משמעותי קדימה במידול מחלות אנושיות, שכן לראשונה ניתן לייצר מודלים של המסטר שעברו הנדסה גנטית. עבור ניסוי זה, יום אחד לפני ההזרקה לפרונוקליאו או הזרקת PN, הכינו צלחות לטיפול בזיגוטים וטיפת הזרקה של PN במכסה של צלחת 35 מילימטר עם מצע HECM-9.כסו את טיפות המצע בשמן מינרלי. כדי לאזן את הטיפות ואת מצע ה-HECM-9, דגרו אותן בטמפרטורה של 37.5 degrees celsius למשך לילה. ביום ההזרקה של ה-PN, הכינו צלחות לשטיפת עוברים באמצעות HECM-9.יש לאחסן אותם באינקובטור עד למועד השימוש. כדי לבודד את צינורות הביוץ, יש להניח נקבת המסטר שעברה סופראובולציה לאחר המתה במצב שכיבה על הגב על סדין ניתוח. יש לחרוץ את הבטן עם 70% ethanol.לאחר מכן, אחזו בחוזקה בעור ובשכבת שרירי הבטן בקו האמצע, ובצעו חתך לאורך קצה הבטן. כדי לחשוף את איברי הבטן, חתכו את הפריטונאום. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה עדינה כדי לתפוס את אחת קרני הרחם, והסיטו את הרקמה מהבטן.הפרידו את הרחם מהמזוmetrium ומרקמת השומן. בצעו את החתך הראשון בין חצוצרת הרחם לשחלה וחתך שני בסמוך לחיבור שבין חצוצרת הרחם לרחם, תוך הכללת חלק קטן מהרחם. הניחו את חצוצרות הרחם באותה צלחת בשר.לאיסוף זיגוטים תחת מיקרוסקופ דיסקציה, השתמשו בפינצטת Dumont מספר 5 כדי לתפוס את דופן קרן הרחם. הכניסו מחט בהכנה ביתית אל תוך הלומן שלו של חלבון הביצה מקצה האינפונדיבולום. לאחר מכן, שטפו את חלבון הביצה בעזרת 300 עד 400 µL של מצע HECM-9.מיד לאחר השטיפה, אספו את הזיגוטים ושטפו אותם פעמיים ב-HECM-9 בתוך צלחת הטיפול. כל הזיגוטים צריכים להיות נקיים מתאי הענן (cumulous cells) בשלב התפתחותי זה. מיד לאחר מכן, הניחו את הזיגוטים באינקובטור עד להזרקה כדי למנוע חשיפה לאור.כדי להתכונן להזרקה, הפשיתו את ה-Cas9-sgRNA RNPs על קרח. מיד לפני ההזרקה, טענו את מחט ההזרקה בתמיסת ה-RNP על ידי הנחת הקצה האחורי של המחט לתוך המבחנה המכילה את התמיסה, ובכך אפשרו לה למלא את המחט באמצעות פעולת נימיות. לאחר מכן, מלאו את פיפטת התמיכה בשמן מינרלי עד למרחק של כחמישה מילימטרים מהכיפוף של המחט. הניחו את התמיכה במיקרו-מזרק כך שקצה פיפטת התמיכה יהיה במצב אופקי ביחס לתחתית הצלחת.מלאו את קצה המחט במצע באמצעות שאיבה. לאחר מכן, מקמו את מחט ההזרקה בזווית של 10 עד 15 מעלות בכיוון הפוך למחזיק. לאחר מכן, זהו זיגוט, והשתמשו במחט המחזיק כדי להחיל שאיבה עדינה.מומלץ שגרעיני הפרו-נוקלאס הזכרי, הגדול מעט יותר, והנקבי יהיו במישור המיקוד (focal range) שבו ומיושרים במקביל למחזיק. באמצעות מחט ההזרקה במיקום של השעה שלוש, חדר דרך ה-zona pellucida ואל תוך הפרו-נוקלאס הזכרי. ברגע שהפרו-נוקלאס מתנפח, משוך את מחט ההזרקה במהירות כדי למנוע מהגרעין להידבק למחט וכדי להימנע מפגיעה בו.יעילות תכנון הגנים (gene targeting) עבור הגנים STAT2 ו-RAG1 באמצעות מערכת Cas9/sgRNA מוערכת על פי שיעור הלידות החיות של נקבות המקבלות ומספר הגוריים החיים עם המודיפיקציות הגנטיות המתוכננות. תוצאות הגנוטיפיקה מניסוי PCR restriction fragment length polymorphism, או PCR-RFLP, של הגוריים, מראות את יעילות תכנון הגנים. נתיב (Lane) מספר אחת מצביע על אללים שתוכננו באופן בי-אללי, ונתיבים שלושה ושבעה מראים אללים שתוכננו באופן מונו-אללי, או פסיפסי (mosaic).טכנולוגיה זו סללה את הדרך עבור חוקרים לפתח מודלים חדשים של מחלות אנוש באמסתרים שעברו הנדסה גנטית. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו מייצרים המסטרי סוריה זהובים (Golden Syria Hamsters) שעברו הנדסה גנטית באמצעות הזרקה לפרו-גרעין של קומפלקס CRISPR/Cas9.

production-genetically-engineered-golden-syrian-hamsters-pronuclear

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

CRISPR/Cas9 היא מערכת חזקה ליצירת שיבוש של גנים ואלמנטים גנטיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול ליצירה יעילה של מחיקות גנומיות בשורות תאים של יונקים באמצעות CRISPR/Cas9.

דור של מחיקות הגנומי בשורות תאים יונקים באמצעות CRISPR / Cas9

Microinjection של ביציות העכבר משמש בדרך כלל עבור transgenesis קלאסי ( כלומר, שילוב אקראי של transgenes) ו CRISPR בתיווך גישור המיקוד. פרוטוקול זה סוקר את ההתפתחויות האחרונות microinjection, עם דגש מיוחד על בקרת איכות אסטרטגיות genotyping.

הדור של עכברים השתנה גנטית דרך Microinjection של ביציות

נתאר כאן טכניקה המשלבת מוטגנזה מכוונת transposon עם תפוקה גבוהה רצף כדי לזהות ולכמת transposon מוטציות leptospiral ברקמות לאחר אתגר של אוגרים. פרוטוקול זה יכול לשמש המוטנטים מסך עבור הישרדות והפצה בבעלי חיים, ניתן להחיל גם על מחקרים במבחנה .

רצף מקביל בתפוקה גבוהה כדי כושר מדד לזיהום Leptospira interrogans Transposon ההכנסה מוטציות במהלך הזהב הסורי אוגר

באופן קבוע באשכולות interspaced חלבון קצר palindromic חזרה/CRISPR הקשורים 9 (CRISPR/Cas9) מערכת מספקת כלי מבטיח עבור הנדסה גנטית, ופותחת לו את האפשרות של שילוב יישוב של transgenes. אנו מתארים קצה בתיווך הומולוגיה להצטרף (HMEJ)-המבוססת על אסטרטגיה עבור DNA יעיל ממוקד אינטגרציה ויוו , ממוקד ג'ין טיפולים באמצעות CRISPR/Cas9.

CRISPR/Cas9-מתווכת אינטגרציה יישוב In Vivo באמצעות אסטרטגיה מבוסס על הצטרפות סוף בתיווך הומולוגיה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקדם אינטגרציה transgene וייצור של מייסד העכברים הטרנסגניים עם יעילות גבוהה על ידי זריקה פשוטה של וקטור במרחב perivitelline של oocyte מופרית lentiviral.

Lentiviral מתווכת הייצור של העכברים הטרנסגניים: שיטה פשוטה ויעילה מאוד עבור לימוד ישיר של המייסדים

ההרפס של תרנגולי הודו (גבוהה) משמש כפלטפורמה וקטור לדור של recombinant חיסונים נגד מספר מחלות העופות. מאמר זה מתאר גישה פשוטה ומהירה לדור של recombinant חיסונים HVT-הווקטורי שימוש משולב NHEJ-CRISPR/Cas9 ומערכת Cre-לקס.

יצירת וקטורים ההרפס העופות רקומביננטי עם CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה

כאן, אנו מציגים שיטה ששונתה עבור הקפאת הזמנות של עוברי תא אחד, כמו גם פרוטוקול כי זוגות השימוש של עוברים הקפאת להקפיא ואלקטרופורציה עבור הדור היעיל של עכברים מהונדסים גנטית.

השימוש של עוברים הקפאת-הפשפה לייצור יעילות גבוהה של עכברים ששונו גנטית

מאפיינים רבים של אאוסוציאליות חרקים נשענים על תקשורת בתוך המושבה וחלוקת עבודה. מניפולציה גנטית של גנים רגולטוריים מרכזיים בעוברי נמלים באמצעות מיקרו-הזרקה ומוטגנזה בתיווך קריספר מספקת תובנות על טבעה של התנהגות אלטרואיסטית בחרקים אאוסוציאליים.

זריקות עובר למוטגנזה בתיווך קריספר במלח הנמלה הרפגנתוס

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מוטציה אחת M213L ב- Gja1 השומרת על דור Connexin43 באורך מלא אך מונעת תרגום של איזופורם קטן יותר של GJA1-20k שתורגם באופן פנימי.

הסרת אתר התחלה תרגומי פנימי מ- mRNA תוך שמירה על הביטוי של חלבון באורך מלא

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מיקרו-הזרקה של זיגוטה של CRISPR-Cas9 ודנ"א של תורם כדי לייצר ביעילות קלטות גנים ועכברים פלוקסים.

מיקרו-הזרקה של זיגוטה ליצירת קלטות גנטיות ואללים של פלוקס בעכברים

במאמר זה אנו מתארים טכניקה פשוטה המיועדת לייצור יעיל של עכברים מהונדסים גנטית הנקראת CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). שיטה זו מספקת ריאגנטים לעריכה על ידי אלקטרופורציה לעוברים ביעילות המתקרבת ל-100%. פרוטוקול זה יעיל עבור מוטציות נקודתיות, החדרות גנומיות קטנות ומחיקות בעוברי יונקים.

עריכה גנומית יעילה של עכברים על ידי CRISPR אלקטרופורציה של זיגוטים

חקור את פרוטוקול ההזרקה הפרונוקליארית לייצור אוגרים סוריים מהונדסים גנטית באמצעות CRISPR/Cas9. השיטה מאפשרת יצירת מודלים חדשים למחלות אנושיות במחקר ביורפואי מתקדם.

הייצור של מהונדסים אוגרים סוריים הזהב באמצעות הזרקת Pronuclear של המתחם CRISPR/Cas9

גלה סרטונים נוספים