Name: שיפור שיטה להקמת במבחנה מחסום הדם - מוח מודל המבוסס על תאי אנדותל המוח חזירי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: למד שיטה משופרת להקמת מודל מחסום דם-מוח במבחנה באמצעות תאי אנדותל מוח חזיריים. הפרוטוקול מספק רבייה גבוהה של תאים ראשוניים עם ערכי TEER גבוהים וחדירות נמוכה לחקר מסירת תרופות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצה להכיר אליזבת הלנה Bruun, שרה כריסטין כריסטנסן ו נילס מ Kristiansen לקבלת סיוע טכני, קרן לונדבק להעניק מספר R155-2013-14113.

מחברי הדו ח אין ניגוד אינטרסים.

טיהור והתפשטות של pBEC
במהלך ההליך טיהור, שלבים קריטיים כוללות הסרה מהירה ויעילה של קרומי המוח והפרדה של חומר לבן ואפור, וזה חשוב עבור טיהור ביבול ובאיכות טוהר ועבור הקמת הדגם המתאים. לדגם הציג במבחנה BBB באמצעות pBECs, יש שיפור ואנו פשוטה הליך טיהור בהתבסס על המגון מכני של החומר האפור מבודד, גודל סלקטיבית סינון עבור בידוד של microvessels, מערכת העיכול עם collagenase , DNase וטריפסין, עם תרבות הראשונית של קטעים microvessel. באופן כללי, אחד האתגרים הגדולים במהלך טיהור והטיפוח של תאים העיק...

המבנה התאי ותפקוד מחסום הדם - מוח
-הממשק של הדם ומרכזי מערכת העצבים (CNS), BBB משמש אתר רגולטורי המפתח לשליטה homoeostatic של microenvironment מערכת העצבים המרכזית, שהוא חיוני לתפקוד תקין והגנה של מערכת העצבים. האתר של BBB הוא התאים אנדותל המצפים לומן כלי דם. נימים המוח, תאי אנדותל ליצור מורכבות המערכת צמתי צר, ביטוי חזק מקוטב דפוסים של מובילי זרם, בזרימת מסוים להבטיח תחבורה מולקולרי ספציפי מאוד בין הדם של המוח 1. מרכיביה המבניים של מתחמי צמוד לצומת לכלול חלבונים מן המשפחה occludin, claudin, zonula occludens (זואי) חלבונים, cingulin, ומקושרת מולקולות אדהזיה מהחיבור (ריבות). Claudin 5 חשוב במיוחד ההגבלה מהחיבור paracellular. תחזוקה של פנוטיפ אנדותל האופיינית הזאת BBB לערב דינמי אינטראקציות עם התאים שמסביב, כולל pericytes, האסטרוציטים, נוירונים, את הקרומים המרתף, אשר יחד עם המוח אנדותל תאים טופס נוירו-וסקולריים יחידה (NVU)2,3. המנגנונים המעורבים אינטראקציות אלה אינם עדיין לגמרי מובנים, אבל כוללים חילופי אותות כימיים בין תאים, אשר מאפשר אפנון של BBB חדירות בטווח הקצר ומשרה BBB לטווח ארוך כולל4. האסטרוציטים במיוחד ידועים לתרום ותפקיד תאי אנדותל המוח, הם מקור של גורמים רגולטוריים כגון פקטור (להשפיע על מחנה תאיים) גליה נגזר neurotrophic5, בסיסי פיברובלסט גורם הגדילה6, הידרוקורטיזון7, הפיכת גורם הגדילה β (TGF-β)8. עם זאת, ההשפעה של TGF-β, כבר התווכחו9.
In Vivo במבחנה BBB
מחקרים in vivo להמשיך לספק מידע רב ערך על BBB ביולוגיה. עם זאת, מודלים התרבות התא יכול לספק תובנות נוספות ומהווים כלים שימושיים להבנת היבטים פונקציונליים המולקולריים מפורט של BBB על בריאות ומחלה. יחסי גומלין מורכבים סוגי תאים ומרכיבים של BBB אמנם קשה להשיג באופן מלא דגמים במבחנה , היה, מאז הטיהור הראשון של תאי אנדותל המוח ויישום של אלה בתרבויות-מונו 10 , 11 , 12, פיתוח נרחב של תהליכי טיהור, תנאי הגידול של BBB תא מודלים תרבות, וכתוצאה מכך דמיון גדול עד המחסום ויוו . הדגמים BBB נפוץ במבחנה מבוססים על ראשי תאים של מכרסמים, חזירי, ומקור שור ועל שורות תאים מונצח. כל דגם כולל החסרונות והיתרונות שונים. השוואה ומודל בחירה, סמני אימות כגון הביטוי של BBB אנזימים, שנאים, קולטנים חלבונים מבניים משמשות ליצירת סקירות ויצר מודלים הנוכחית1.
מטרת הפרוטוקול
תכונה חשובה אחת של BBB מכשול מהבלוטות ומניעת TEER גבוהה, אך מספר גדול של הדגמים זמינים ואינם משקפים היטב את רמות ויוו . שילוב תרומות פיתוח ואופטימיזציה של מספר מעבדות, המטרה של פרוטוקול זה היא להציג שיטה להקמת גבוהה TEER במבחנה BBB מודל המבוסס על pBECs ראשי MC עם או בלי ACM, או NCC עם ראשי האסטרוציטים של עכברוש או מקור חזירי. הליכים שהוחל והקמת המודל כוללות מאמצים לחסל תאים מזהמים וכדי לשפר את הבידול של pBECs לתוך הפנוטיפ BBB. עבודה זו הובילה להקמת מודלים TEER אמינים, עם חדירות נמוכה paracellular וביטוי פונקציונליים טוב של מפתח חלבונים מהחיבור חזק, שנאים, קולטנים. עם זאת, כפי האסטרוציטים גורם תורם פנוטיפ תא אנדותל המוח, שלושה מצבים שונים של תרבות מייצגים שלוש פנוטיפים שונים של תאי אנדותל המוח. מודל NCC שימושית במיוחד עבור מחקרים של מנגנונים מיוחדים מסוימים מעורב גילוי תרופות, מחקרים תחבורה וסחר תאיים, כמו גם עבור חקירת האינטראקציות תא-תא איפה ביטוי מכסימלי של BBB תכונות יתרון.
מקור והיסטוריה של הפרוטוקול
המודל pBEC המתוארים כאן מבוסס במידה רבה על המודל חזירי שפותחה במעבדות Eisai (לונדון) על ידי ד ר לואיס מורגן ועמיתיו, חישבת בהתבסס על מוצלחת קודמת המוח שור תא אנדותל דגם13. שיטת ההכנה התא המקורי היה רשתות שינוי סינון בשני שלבים באמצעות ניילון כדי לתפוס את microvessels, ואחריו צעד subculturing כדי לשפר את טוהר. בפיתוח קודמות של השיטה, אטימות פנוטיפ ומכשול BBB אופטימלית הושגו על ידי גידול בינוני שהושלם, כולל ACM. שינויים ותיקונים נוספים לשיטת נעשו על ידי ר' סקינר במעבדה של פרופ ' / ח' ש רותוול מנצ'סטר בבריטניה14,15. השיטה אומצה על ידי המעבדה אבוט, אשלגן כלורי לונדון, שם Patabendige עשה את זה משמעותי יותר פשוט להכין על ידי הימנעות משימוש האסטרוציטים או ACM בהריגת תאים מזהמים כמו pericytes עם puromycin. העיתונים הראשון אישר כי דגם MC נשמר כמה תכונות חשובות של ה- ויוו BBB, כולל צמתי צר יעיל, מערכות תחבורה ממברנה קולטן בתיווך transcytosis16,17 , 18 , 19 , 20. אח כ ס Yusof שוב נבדק תרבות משותפת אסטרוציט ונמצא זה לשפר באופן משמעותי TEER, אז זה הגרסה המועדפת כיום בשימוש המעבדה אבוט21. המודל כבר עכשיו בהצלחה להעביר את נילסן מ מעבדה בארהוס, איפה היו שינויים ותיקונים נוספים הציג (פרוטוקול זה), כולל גריי מפשט משנה החילוץ, באמצעות שלב סינון רשת אחת בלבד, וצעד ציפוי מסננים יחידה שילוב של קולגן, fibronectin. ההליך שימושית עבור בידוד של חזירי האסטרוציטים (פרוטוקול זה) התבססה על פרוטוקולים שפותחה על ידי המעבדה טי Moos באולבורג, שתואר על ידי תומסון ואח22. את TEER ומאפיינים אחרים של המודל שנוצר ב לונדון וב אהרחוס דומים, אשר מקנה בטחון לרעיון המודל בקלות מועברים בין מעבדות ומגיב היטב כדי התבוננות מעמיקה, רציונליזציה של שיטת השלבים. אכן, Yusof ס הקימה כעת דגם MC במדינה טרופית (מלזיה)23, אשר מעורבים התאמה נוספת עבור תנאים מקומיים ומקורות רקמות.
יתרונות על פני שיטות אלטרנטיביות וכיום הקימה מודלים
בהשוואה לתאי אנדותל מוח של פרה ומקור מכרסמים, pBECs לספק את היתרון של בעל שיעור נמוך יותר של אובדן ויוו BBB פנוטיפ בעקבות בידוד24. יתר על כן, pBECs מסוגלים להרכיב את המחסומים אנדותל צר יחסית, אפילו כאשר גדל ב- MC (Ω 800 ס מ2)16 לעומת רמות בדרך כלל דיווחו על monolayers של שורות תאים כגון bEND.5 ו- bEND.3 (50 Ω ס מ2) 25 , 26 , 27, cEND (300-800 Ω ס מ2)28,29,30, ואת cerebEND (500 Ω ס מ2)29,31,32, ומוח ראשוניים תאי אנדותל של העכבר (100-300 Ω ס מ2)האס. אס = "xref" > 33,34,35,36 , עכברוש (100-300 Ω ס מ2)37,38. עם זאת, TEER מראה תלות על ההליכים טיהור ותרבות. ברוב המקרים, התוספת של ACM או תרבות משותפת עם האסטרוציטים מראה השפעות המבדילים על תאי אנדותל ועלייה ב אטימות של שכבות אנדותל1. ובכל זאת, עם מאמצים כדי למטב את התנאים culturing, רק המודלים מבוססי שור הראו ערכי TEER להשוות המודלים מבוססי-חזירי (ממוצע של 800 Ω ס מ2 ב- MC, עד 2500 Ω ס מ2 בתרבות שיתוף אסטרוציט)13 ,39,40,41,42,43,44,45. כמו הדגמים בהתבסס על מוח ראשוניים שור תאי אנדותל הראו וריאציות גדול, בין ובתוך מעבדות14,45,46,47,48. הפארמצבטית יכול להיות בעיה. במודל pBEC שדווחו פה, המעבדות התורמים השיגו TEER דומה מאוד וערכי חדירות paracellular עם השתנות נמוך, והן בין מעבדות. ומכאן, זה צריך להיות אפשרי עבור מעבדות אחרות להקים מודל חזקים עם השתנות נמוך באמצעות השיטה המוצגת כאן. בנוסף ויוצרים שכבות אנדותל חזק, מודלים עם pBECs יש בעבר מאומתים על-ידי ביטוי של חלבונים צומת חזק, מובילי BBB פונקציונלי, רצפטורים, אנזימים והפגינו התאמה למגוון רחב של מחקרים15 , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59. יתר על כן, transcriptome שלא פורסמו נתונים על תרבויות המשנה pBECs מציגה פרופיל הצפוי של מובילי BBB, קולטנים (שלא פורסמו תוצאות, נילסן. et al.).
המודל מבוסס על חזירי BBB יש יתרון נוסף כמו הגנום, אנטומיה, פיזיולוגיה, ומשקפים התקדמות המחלה של החזיר הביולוגיה האנושית ברמה גבוהה מאשר דגמים אחרים הוקמה60, אשר הם חיוביים כולל בתעשייה הפרמצבטית. כמו חזירי המוח הם תופעת לוואי נפוצה של תעשיית הבשר, הם מהווים מקור נגיש בקלות של המוח תאי אנדותל, צמצום מספר בעלי חיים לצורך הניסויים, וגם לספק תשואה גבוהה טיהור מהמוח חזירי אחד. למרות טיהור והטיפוח של תאים העיקרי הוא במידה מסוימת זמן רב ודורש מומחיות התקינה מתארגנת המודל, ראשי תאים מפיקים הדגמים BBB הכי אמין. שורות תאים מונצחים לא יכול להיות תחליף, כמו תכונות חשובות כגון מכשול אטימות, פרופילי ביטוי טרנספורטר, ורגולציה microenvironment אינן משקפות את ממצאי הניסוי ויוו61, 62. מודלים במבחנה לספק יתרון לחיות תאים הדמיה עם רזולוציה גבוהה יותר, כך ויזואליזציה של תהליכים תאיים מאפשר מתן אפשרות גישה בסמיכות לתאי שנדגמו או שנצפה, באמצעות מטרות עם הגדלה גבוהה יותר, איכות אופטית טובה יותר63. זה אינו המקרה לשימוש של מיקרוסקופ שני הפוטונים בבעלי חיים. יתר על כן, במבחנה מודלים מספקים את היכולת transfect תאים, המאפשר ויזואליזציה של חלבונים מתויג והחקירה של סחר שלהם.
יישומים של המודל
הפונקציה של BBB אינו קבוע, יכול להיות מאופנן באופן דינמי פיזיולוגיה והן פתולוגיה. מחלות נוירולוגיות רבות, כולל ניווניות, במחלות דלקתיות וזיהומיות, הפרעה, חדירות מוגברת של BBB נצפית64,65,66,67 . על מנת להפחית ולמנוע התקדמות המחלה ונזק עוקבות, זיהוי ואפיון של המנגנונים המולקולריים שבבסיס של האפנון של BBB הם בעלי חשיבות גדולה. בהקשר זה, מודלים אמינים במבחנה יש ביקוש גבוה על ידי תעשיית התרופות, יתר על כן תפקיד חשוב בחיזוי BBB החדירות של סמים על מערכת העצבים. כל במבחנה דגם הגשה המסך חדירות צריך להציג מסלול paracellular מגבילים, ארכיטקטורה התא מבחינה פיזיולוגית מציאותי, ביטוי פונקציונאלי של טרנספורטר מנגנונים68. הפגינו ב מחקרים קודמים16,17,57, ועל ידי paracellular חדירות וביטוי של טי-ג'יי, ג'יי חלבונים כאן, המודל הציג עונה על כל הקריטריונים האלה ומתאים לטווח של BBB מחקרים בולטים בשני פיזיולוגיה נורמלי בפתולוגיה. נקודות החוזק של שיטת טיהור וטיפוח הציג כוללים שילוב של פשטות, הפארמצבטית ואת היכולת לכלול astrocytic להשפיע בדגם שנוצר עמיד ואמין גבוהה TEER במבחנה BBB. בשביל זה מטרה, האסטרוציטים של חזירי ואלשין מקור הוכחו להגדיל את ותפקיד BBB של pBECs בצורה דומה22.

<table><tbody><tr><td>פיברונקטין</td><td>סיגמא-אולדריץ</td><td>' F1141</td><td></td></tr><tr><td>קולגן IV</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>פולי-ליזין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P1524</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>לונזה</td><td>BE12-719F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/גלוקוז נמוך</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D6046</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>ג'יבקו אינוויטרוגן</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>סרום נגזר פלזמה (PDS)</td> <td>פירסט לינק בריטניה בע"מ</td><td>60-00-89</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>10-270-106</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>הידרוקורטיזון</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>8-CPT-cAMP</td><td>Biolog</td><td>C010</td><td></td></tr><tr><td>RO 20-1724</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8279</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin Sulfate</td><td>Lonza</td><td>17-518Z</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34896</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>EtOH</td><td>VWR</td><td>20,824,296</td><td>מערבבים את תמיסת ה-70% מ-96% EtOH</td></tr><tr><td>DNAse 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4513</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז CLS2</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>ddH2O</td><td></td><td></td><td>מיוצר עם</td></tr><tr><td>צלוחיות Elga System T75</td><td>Thermo Scientific</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>Costar Transwell מוסיף (מוסיף ממברנה חדירה לתאים)</td> <td>Costar</td><td>CLS3401</td><td>צלחת 12 בארות, קוטר 12 מ"מ, 0.4 &mu; m ממברנת פוליקרבונט</td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות צנטריפוגה</td><td>Cellstar</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות צנטריפוגה</td><td>Cellstar</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי</td><td>Thermo Scientific</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני Cryo</td><td>Thermo Scientific</td><td>377224</td><td></td></tr><tr><td>500 מ"ל בקבוק</td><td>Thermo Scientific</td><td>159910/159920</td><td></td></tr><tr><td>אזמל</td><td>Swann-Morten</td><td>REF0211</td><td>סוג 24</td></tr><tr><td>הומוגנייזר רקמות</td><td>Sigma</td><td>D9188</td><td></td></tr><tr><td>140 &mu; מסנני m</td><td>MERCK</td><td>NY4H04700</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m מסננים</td><td>Corning</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>מערכת תא EndOhm</td> מכשירי <td>דיוק עולמיים</td><td>ENDOHM-12</td><td>תא EndOhm לכוסות תרבות 12 מ"מ</td></tr><tr><td>מערכת אלקטרודות EVOM2</td> World <td>Precision Instruments</td><td>300523+STX100C</td><td>מערכת מדידת TEER עם זוג אלקטרודות STX-100C קשיח</td></tr><tr><td>מחט ארוכה</td><td>סיגמא</td><td></td><td>הצמד למזרק</td></tr><tr><td>מלקחיים מעוקלים בקצה עדין</td><td>KLS Martin</td><td>12-409-12-07</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים עם קצה רחב</td><td>VWR</td><td>82027-390</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מסנן</td><td>MERCK Milipore</td><td>Swinnex-47</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל מזרק</td><td>בראון</td><td>4617509F</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל</td><td>Terumo</td><td>SSt20ESI</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד אוקלודין</td><td>Abcam</td><td>ab31721</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Anti-p120 Catenin נוגדן</td><td>BD Transduction</td><td>מעבדות 610133</td><td>1:200</td></tr><tr><td>נוגדן Anti-ZO-1</td><td>Invitrogen</td><td>61-7300</td><td>1:200</td></tr><tr><td>נוגדן Anti-Claudin 5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB4502981</td><td>1:100</td></tr><tr><td>חמור אנטי ארנב IgG מצומד עם קמח Alexa 568</td><td>Thermo Scientific</td><td>A10042</td><td>1:500</td></tr><tr><td>חמור אנטי עכבר IgG מצומד עם קמח Alexa 488</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>A21202</td><td>1:500</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>פרקין אלמר</td><td>NEC100X250UC</td><td>0.15&מיקרו; l/ml עבודה סופית conc</td></tr><tr><td>לוציפר צהוב</td><td>סיגמא</td><td>L0144</td><td>10 ומיקרו; גרם/מ"ל קונקציה סופית לעבודה</td></tr></tbody></table>

שיפור שיטה להקמת במבחנה מחסום הדם - מוח מודל המבוסס על תאי אנדותל המוח חזירי

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

המטרה של פרוטוקול זה מציג את הליך בלתי אופטימליים לטיהור ודה הטיפוח של pBECs ולהקים במבחנה מחסום הדם - מוח (BBB) מודלים בהתבסס על pBECs, מונו-תרבות (MC), MC ממוזגים אסטרוציט בינונית (ACM), ו תרבות משותפת (NCC) עם האסטרוציטים של חזירי ללא מגע או עכברוש מקור. pBECs היו מבודדים ותרבותית של שברי נימים מ cortices המוח של חזירים במשפחה בת 5-6 חודשים. קטעים אלה היו מטוהרת על-ידי הסרת זהיר של קרומי המוח, בידוד המגון של החומר האפור, סינון, עיכול אנזימטי צנטריפוגה. לחסל עוד תאים מזהמים, שברי נימי היו תרבותי עם puromycin המכילות בינוני. כאשר 60-95% confluent, pBECs גדל מן השברים נימי היו passaged את קרום חדיר המסנן מוסיף והקימו במודלים. כדי להגדיל את מחסום מהבלוטות ומניעת BBB פנוטיפ אופייני של pBECs, התאים שטופלו הגורמים בידול הבאים: ממברנה permeant 8-CPT-מחנה (מחנה מקוצר כאן), הידרוקורטיזון, מעכב phosphodiesterase, RO-20-1724 (RO). ההליך בוצע על פני תקופה של 9-11 ימים, בעת יצירת מודל NCC, האסטרוציטים היו תרבותי 2-8 שבועות מראש. ההקפדה ההליכים המתוארים בפרוטוקול אפשרה את הקמת שכבות אנדותל עם חדירות paracellular מוגבלת מאוד, עם NCC המודל מראה על ממוצע transendothelial ההתנגדות החשמלית (TEER) 1249 ± Ω 80 ס מ 2, ו paracellular חדירות (Papp) עבור לוציפר צהוב 0.90 10-6 ± 0.13 10-6 ס מ סק-1 (זאת אומרת ± SEM, n = 55). הערכה נוספת של פנוטיפ pBEC הזה הראה ביטוי טוב claudin חזק חלבונים מהחיבור 5, זואי-1, occludin ו adherens של catenin p120 של צומת חלבון. המודל המוצג יכול לשמש למגוון רחב של מחקרים של BBB על בריאות ומחלה, עם החדירות paracellular מאוד מגבילה, מודל זה מתאים ללימודי תחבורה, וגדילת.

הקמתה של הדגמים במבחנה BBB
בשיטה שלו שהוצגו, אופטימיזציה, טיפוח של pBECs והקמת מערכת הוספה קרום חדיר עם MC או בלי ACM או NCC עם האסטרוציטים (איור 1) בוצע לתקופה של 9-11 ימים (איור 2). לבחירה של תאי אנדותל, תרבות הראשונית של קטעים נימי מטוהרים היה בשילוב עם טיפול puromycin לתקופה מקסימלית של 5 ימים, אשר חיסלה את רוב התאים מזהמים וקידם את הצמיחה של תאי אנדותל בצורת ...

המטרה של הפרוטוקול היא להציג את הליך בלתי אופטימליים להקמת במבחנה מחסום הדם - מוח (BBB) מודל המבוסס על תאי אנדותל המוח חזירי הראשי (pBECs). המודל מראה הפארמצבטית גבוהה, אטימות גבוהה, מתאים ללימודי תחבורה, וגדילת גילוי סמים.

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לטהר ולבודד תאי אנדותל ראשוניים במוח חזירי על מנת להקים מודל מחסום דם-מוח הדוק במבחנה. שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח בתחום מחסום הדם-מוח, כגון העברת תרופות, חדירות, סחר בקולטנים, כמו גם ההידוק והקוטביות של ה-BB. היתרון העיקרי של מודל זה הוא התפוקה הגבוהה של תאי אנדותל ראשוניים במוח שניתן להשתמש בהם ליצירת מודל מחסום דם-מוח במבחנה בעל TEER גבוה וחדירות נמוכה. כדי להתחיל בהליך זה, הניחו את המוח בספסל זרימה סטרילי ושטפו אותם בעדינות עם ליטר PBS בכוס המונחת על קרח.לאחר מכן, הסר בזהירות את קרומי המוח מכל מוח באמצעות מלקחיים דקים. בעזרת אזמל, מגרדים את החומר האפור מהמוח בזה אחר זה ומעבירים את החומר המבודד לצלחות פטרי המכילות 20 מיליליטר DMEM/F-12 המונחות על קרח. לפיצול ראשוני, העבירו את חומר החומר האפור דרך מזרק של 50 מיליליטר ללא המחט.חזור על ההליך עבור כל המוחות ואגד את חומר החומר האפור שנאסף יחד. העבר את חומר החומר האפור המבודד עם מדיום DMEM/F-12 לצינור המטחנה של הומוגנייזר רקמות כף יד. הומוגניזציה של החומר על ידי ביצוע שמונה משיכות למעלה ולמטה עם עלי רופף, ולאחר מכן שמונה משיכות למעלה ולמטה עם עלי הדוק.לאחר מכן, בודדו את הנימים על ידי סינון ההומוגנאט באמצעות בקבוק פקק כחול של 500 מיליליטר עם מחזיק מסנן ורשת פילטר של 140 מיקרון. מניחים את המסננים המכילים נימים בצלחות פטרי עם תמיסת עיכול. לאחר מכן, דגרו את צלחות הפטרי ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה על שייקר מסלולי ב-180 סל"ד, או ערבבו אותן בעדינות כל 10 דקות.לאחר שעה יש לשטוף את הנימים מהפילטרים עם השעיה מצלחת הפטרי. לאחר מכן, פצלו את המתלה משלושת הכלים לשני צינורות של 50 מיליליטר ועצרו את העיכול על ידי הוספת 10 מיליליטר של DMEM/F-12 לכל צינור של 50 מיליליטר. צנטריפוגה מתלה התא ב -250 פעמים גרם, ארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.לאחר מכן, שאפו את הסופרנטנטים והשעו מחדש כל כדור ב-10 מיליליטר של DMEM/F-12. לאחר מכן, הוסף עוד 20 מיליליטר של DMEM/F-12 לכל צינור. כדי לייעל את התנאים להצמדת PBECs, הוסף תמיסת ציפוי לבקבוק T-75, וכתוצאה מכך הריכוזים הסופיים של קולגן ארבע ב-150 מיקרוגרם למיליליטר ופיברונקטין ב-50 מיקרוגרם למיליליטר ובמים מזוקקים, וודא שהתמיסה מכסה את כל פני השטח.לאחר מכן, הפשירו את הנימים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. כדי להסיר מדיום הקפאה, סובב את הנימים כלפי מטה ב -250 פעמים גרם, ארבע מעלות צלזיוס, למשך שבע דקות. לאחר מכן, שאפו בזהירות את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד עד שניים של 10 מיליליטר.לאחר מכן, העבירו את המתלה הנימי לבקבוק ה-T-75 המצופה, והטו בעדינות את הבקבוק כדי להבטיח פיזור שווה על פני השטח. הנח את בקבוק ה-T-75 ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. לאחר הדגירה של הלילה, הכינו 10 מיליליטר של מדיום גידול PBEC, בתוספת פורומיצין בארבעה מיקרוגרם למיליליטר לבקבוק T-75 אחד ובצעו שינוי בינוני.לאחר מכן, הכינו את תוספות הממברנה החדירות לזריעת PBEC על ידי ציפוי בקולגן IV ב-500 מיקרוגרם למיליליטר, ופיברונקטין ב-100 מיקרוגרם למיליליטר, ובמים מזוקקים. טריפסין את התאים על ידי הוספת שני מיליליטר של תמיסת טריפסין-EDTA לבקבוק T-75, והנח אותו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני, למשך חמש עד שבע דקות. כדי לנתק את תאי האנדותל במוח, הקש בעדינות על צד בקבוק ה-T-75 בקצות האצבעות.לאחר מכן, העבירו את תמיסת התא לצינור של 15 מיליליטר, וסובבו את תאי האנדותל במוח על ידי צנטריפוגה ב-250 פעמים גרם, ארבע מעלות צלזיוס, למשך שבע דקות. לאחר מכן, הסר בזהירות את הסופרנטנט, והשהה מחדש את הכדור במיליליטר אחד של מדיום. לאחר מכן, הוסף עוד שני מיליליטר של מדיום כדי להביא את הנפח הכולל לשלושה מיליליטר.ספור את מספר התאים באופן ידני באמצעות תא ספירת תאים או מערכת ספירת תאים אוטומטית. עבור קוקולטורה ללא מגע, העבירו תוספות לבארות שיש בהן אסטרוציטים, שעברו רענון עם מדיום גידול אסטרוציטים יום קודם. למחרת, החלף את המדיום על תוספות הממברנה החדירות המכילות PBECs.לאחר מכן, שאפו בזהירות את המדיום מהבארות והוסיפו 750 מיקרוליטר של מדיום בידול לכל באר. לאחר מכן, שאפו בזהירות מדיום מהתוספות והוסיפו 500 מיקרוליטר של מדיום בידול לכל תוספת. לאחר מכן, הוסיפו את 750 המיקרוליטרים הנותרים של מדיום התמיינות לכל באר אסטרוציטים.לאחר מכן, דגרו את התאים עם מדיום התמיינות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני, עד למחרת. ביום שלאחר גירוי התאים במדיום התמיינות, הכינו את מערכת תא מדידת התנגדות הרקמות למדידות TEER על ידי שטיפת התא פעמיים במים מזוקקים, פעם אחת עם 70% אתנול למשך חמש דקות ופעמיים נוספות במים מזוקקים. לאחר מכן, חבר את החדר למערכת, הוסף ארבעה מיליליטר של DMEM/F-12 לתא מדידת התנגדות הרקמות, ותן לו להישאר בטמפרטורת החדר למשך כ-30 דקות.לאחר מכן, בצע מדידות TEER על ידי הנחת התוספות בזהירות בתא מדידת התנגדות הרקמות. להלן תמונות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה של PBECs, תרביות ואסטרוציטים שנצפו במשך חמישה ימים. שברי נימים מטוהרים ביום הראשון של התרבית הראשונית הראו נוכחות של נימים ותאים מזהמים, אשר לאחר שינוי בינוני ביום השני ויום נוסף של צמיחה, הראו ברירה עבור PBECs, שהחלו את צמיחתם משברי הנימים.חד-שכבות קונפלואנט של PBECs הושגו בדרך כלל ביום הרביעי עד השישי, כאשר PBECs הראו מורפולוגיה בצורת ציר והיו מיושרים לאורך. אסטרוציטים של חולדות שנזרעו בבארות התחתונות התרבו בדרך כלל לשכבות קונפלואנט תוך חמישה ימים, ושימשו למודלים של קוקולטורה ללא מגע לאחר שבועיים של צמיחה. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שבע שעות.לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים לחקור העברת תרופות וסחר בקולטנים בתאי אנדותל מוח הדוקים ומקוטבים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד ליצור מודל מחסום דם-מוח במבחנה שיכול לשמש למחקרים חדשים שאינם יכולים לבצע in vivo.

improved-method-for-establishment-an-vitro-blood-brain-barrier-model

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

שיטה זו מתארת ​​כיצד לבודד ולהנציח תאי אנדותל כלי דם ממוח עכבר. אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד החל מהומוגניזציה של רקמת מוח, שלבי עיכול, זריעה והנצחה של התאים. בדרך כלל, זה לוקח בערך חמישה שבועות כדי להשיג קו אחיד, שהונצח כלי דם האנדותל תא.

דור של קו הונצח Murine מוח כלי דם האנדותל סלולרי כ<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם מחסום דם מוח

סרטון זה מדגים את בידוד הנימים ממוחות חזיריים טריים. התהליך כולל הסרת קרומי המוח, בידוד החומר האפור מרקמת המוח, הומוגניזציה וסינון של החומר האפור כדי לבודד את הנימים, ולבסוף שימוש בעיכול אנזימטי כדי לטהר את הנימים עוד יותר.

טיהור נימים ממוח חזירי

הקמת מודלים האנושיים של מחסום דם המוח (BBB) ​​יכולה להועיל למחקר לתנאי מוח הקשורים לכישלון BBB. אנו מתארים כאן טכניקה משופרת להכנת מודל BBB מגע, המאפשר coculturing של האסטרוציטים אנושיים ותאי האנדותל במוח בצדדים המנוגדים של קרום נקבובי.

שיפר שיטה להכנה מבוססת תאים, דגם מגע אנושי של מחסום דם המוח

מטרת המחקר הנוכחי הייתה לאמת את שחזור של מודל במבחנה BBB מעורב syngeneic חולדה שיתוף תרבות של תאים והאסטרוציטים אנדותל. Monolayer תא אנדותל הציג Teer גבוה וחדירות LY נמוכות. ביטוי של חלבונים ספציפיים TJ, תגובות פונקציונליות לדלקת ופונקציונליות של מובילים וקולטנים הוערכו.

הגדרה למעלה<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום דם מוח חולדה (BBB): פוקוס על BBB האטים ותחבורה בתיווך קולטן

תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח (BMEC) מחוברים זה לזה על ידי חלבוני צומת ספציפיים היוצרים מחסום מווסת מאוד המפריד בין הדם למערכת העצבים המרכזית (CNS), מה שנקרא מחסום דם-מוח (BBB). הבידוד של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ראשוניים במוח העכברים, כפי שנדון בפרוטוקול זה, מאפשר מחקרי מבחנה מפורטים של BBB.

בידוד של תאים הראשוניים Murine מוח כלי הדם האנדותל

כאן, אנו מתארים מודל עכברי במבחנה של מחסום הדם-מוח העושה שימוש בספקטרוסקופיה של תאי עכבה, תוך התמקדות בהשלכות על שלמות תאי האנדותל וחדירות באינטראקציה עם תאי T מופעלים.

<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום דם-מוח באמצעות ספקטרוסקופיית עכבה: התמקדות T Cell-אנדותל אינטראקציה תא

מחסום הדם-מוח האנושי באופן סלקטיבי מונע חדירה של מולקולות הידרופילית ופתוגנים לתוך המוח. מספר פתווגיות, כולל דלקת קרום המוח והזיות פוסט-אופרטיביות, קשורות לחדירות מוגברות של מחסום הדם-מוחי. כאן, אנו מתארים מודל של התרבות התא האנדותל כדי לבדוק את חדירות המכשול על ידי החציית מחיידקים.

ניתוח חדירות של מכשול המוח-הדם על ידי חציית מיקרודם באמצעות תאי מיקרו-כלי

מחסום הדם-מוח (BBB) הוא יחידת נוירונימי-דם הדוקה באופן הדוק הומאוסטזיס מוחי. על ידי שילוב האדם iPSCs והעוגב-על-שבב טכנולוגיות, יצרנו שבב BBB אישי, מתאים למידול מחלות ותחזיות החדירה לתרופות של הפונקציה. פרוטוקול מפורט מתואר לדור ותפעול של שבב BBB.

הדור של המוח האנושי מבוסס על-ידי שבב דם-מחסום

פרוטוקול זה מתאר שיטה להקמת מחסום דם-מוח אנושי (BBB) במודל מבחנה . תאי האנדותל והפריציטים נזרעים בכל צד של מסנן הכנסה (תא דם), ואסטרוציטים נזרעים בבאר התחתונה (תא המוח). המודל שאפיין שימש לניסויים בהובלת ננו-חלקיקים.

מערכת תאי תרבית משולשת המדגימה את מחסום הדם-מוח האנושי

למחסום הדם-מוח (BBB) יש תפקיד מכריע בשמירה על סביבת מוח יציבה ובריאה. תפקוד לקוי של BBB קשור למחלות נוירולוגיות רבות. פיתחנו מודל תלת-ממדי, הנגזר מתאי גזע של BBB כדי לחקור פתולוגיה של כלי דם במוח, שלמות BBB, וכיצד BBB משתנה על ידי גנטיקה ומחלות.

שחזור מחסום הדם-מוח במבחנה כדי למדל ולטפל במחלות נוירולוגיות

למד שיטה משופרת להקמת מודל מחסום דם-מוח במבחנה באמצעות תאי אנדותל מוח חזיריים. הפרוטוקול מספק רבייה גבוהה של תאים ראשוניים עם ערכי TEER גבוהים וחדירות נמוכה לחקר מסירת תרופות.

שיפור שיטה להקמת במבחנה מחסום הדם - מוח מודל המבוסס על תאי אנדותל המוח חזירי

גלה סרטונים נוספים