שיפור שיטה להקמת במבחנה מחסום הדם - מוח מודל המבוסס על תאי אנדותל המוח חזירי

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לטהר ולבודד תאי אנדותל ראשוניים במוח חזירי על מנת להקים מודל מחסום דם-מוח הדוק במבחנה. שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח בתחום מחסום הדם-מוח, כגון העברת תרופות, חדירות, סחר בקולטנים, כמו גם ההידוק והקוטביות של ה-BB. היתרון העיקרי של מודל זה הוא התפוקה הגבוהה של תאי אנדותל ראשוניים במוח שניתן להשתמש בהם ליצירת מודל מחסום דם-מוח במבחנה בעל TEER גבוה וחדירות נמוכה. כדי להתחיל בהליך זה, הניחו את המוח בספסל זרימה סטרילי ושטפו אותם בעדינות עם ליטר PBS בכוס המונחת על קרח.

לאחר מכן, הסר בזהירות את קרומי המוח מכל מוח באמצעות מלקחיים דקים. בעזרת אזמל, מגרדים את החומר האפור מהמוח בזה אחר זה ומעבירים את החומר המבודד לצלחות פטרי המכילות 20 מיליליטר DMEM/F-12 המונחות על קרח. לפיצול ראשוני, העבירו את חומר החומר האפור דרך מזרק של 50 מיליליטר ללא המחט.

חזור על ההליך עבור כל המוחות ואגד את חומר החומר האפור שנאסף יחד. העבר את חומר החומר האפור המבודד עם מדיום DMEM/F-12 לצינור המטחנה של הומוגנייזר רקמות כף יד. הומוגניזציה של החומר על ידי ביצוע שמונה משיכות למעלה ולמטה עם עלי רופף, ולאחר מכן שמונה משיכות למעלה ולמטה עם עלי הדוק.

לאחר מכן, בודדו את הנימים על ידי סינון ההומוגנאט באמצעות בקבוק פקק כחול של 500 מיליליטר עם מחזיק מסנן ורשת פילטר של 140 מיקרון. מניחים את המסננים המכילים נימים בצלחות פטרי עם תמיסת עיכול. לאחר מכן, דגרו את צלחות הפטרי ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה על שייקר מסלולי ב-180 סל"ד, או ערבבו אותן בעדינות כל 10 דקות.

לאחר שעה יש לשטוף את הנימים מהפילטרים עם השעיה מצלחת הפטרי. לאחר מכן, פצלו את המתלה משלושת הכלים לשני צינורות של 50 מיליליטר ועצרו את העיכול על ידי הוספת 10 מיליליטר של DMEM/F-12 לכל צינור של 50 מיליליטר. צנטריפוגה מתלה התא ב -250 פעמים גרם, ארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

לאחר מכן, שאפו את הסופרנטנטים והשעו מחדש כל כדור ב-10 מיליליטר של DMEM/F-12. לאחר מכן, הוסף עוד 20 מיליליטר של DMEM/F-12 לכל צינור. כדי לייעל את התנאים להצמדת PBECs, הוסף תמיסת ציפוי לבקבוק T-75, וכתוצאה מכך הריכוזים הסופיים של קולגן ארבע ב-150 מיקרוגרם למיליליטר ופיברונקטין ב-50 מיקרוגרם למיליליטר ובמים מזוקקים, וודא שהתמיסה מכסה את כל פני השטח.

לאחר מכן, הפשירו את הנימים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. כדי להסיר מדיום הקפאה, סובב את הנימים כלפי מטה ב -250 פעמים גרם, ארבע מעלות צלזיוס, למשך שבע דקות. לאחר מכן, שאפו בזהירות את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד עד שניים של 10 מיליליטר.

לאחר מכן, העבירו את המתלה הנימי לבקבוק ה-T-75 המצופה, והטו בעדינות את הבקבוק כדי להבטיח פיזור שווה על פני השטח. הנח את בקבוק ה-T-75 ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. לאחר הדגירה של הלילה, הכינו 10 מיליליטר של מדיום גידול PBEC, בתוספת פורומיצין בארבעה מיקרוגרם למיליליטר לבקבוק T-75 אחד ובצעו שינוי בינוני.

לאחר מכן, הכינו את תוספות הממברנה החדירות לזריעת PBEC על ידי ציפוי בקולגן IV ב-500 מיקרוגרם למיליליטר, ופיברונקטין ב-100 מיקרוגרם למיליליטר, ובמים מזוקקים. טריפסין את התאים על ידי הוספת שני מיליליטר של תמיסת טריפסין-EDTA לבקבוק T-75, והנח אותו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני, למשך חמש עד שבע דקות. כדי לנתק את תאי האנדותל במוח, הקש בעדינות על צד בקבוק ה-T-75 בקצות האצבעות.

לאחר מכן, העבירו את תמיסת התא לצינור של 15 מיליליטר, וסובבו את תאי האנדותל במוח על ידי צנטריפוגה ב-250 פעמים גרם, ארבע מעלות צלזיוס, למשך שבע דקות. לאחר מכן, הסר בזהירות את הסופרנטנט, והשהה מחדש את הכדור במיליליטר אחד של מדיום. לאחר מכן, הוסף עוד שני מיליליטר של מדיום כדי להביא את הנפח הכולל לשלושה מיליליטר.

ספור את מספר התאים באופן ידני באמצעות תא ספירת תאים או מערכת ספירת תאים אוטומטית. עבור קוקולטורה ללא מגע, העבירו תוספות לבארות שיש בהן אסטרוציטים, שעברו רענון עם מדיום גידול אסטרוציטים יום קודם. למחרת, החלף את המדיום על תוספות הממברנה החדירות המכילות PBECs.

לאחר מכן, שאפו בזהירות את המדיום מהבארות והוסיפו 750 מיקרוליטר של מדיום בידול לכל באר. לאחר מכן, שאפו בזהירות מדיום מהתוספות והוסיפו 500 מיקרוליטר של מדיום בידול לכל תוספת. לאחר מכן, הוסיפו את 750 המיקרוליטרים הנותרים של מדיום התמיינות לכל באר אסטרוציטים.

לאחר מכן, דגרו את התאים עם מדיום התמיינות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני, עד למחרת. ביום שלאחר גירוי התאים במדיום התמיינות, הכינו את מערכת תא מדידת התנגדות הרקמות למדידות TEER על ידי שטיפת התא פעמיים במים מזוקקים, פעם אחת עם 70% אתנול למשך חמש דקות ופעמיים נוספות במים מזוקקים. לאחר מכן, חבר את החדר למערכת, הוסף ארבעה מיליליטר של DMEM/F-12 לתא מדידת התנגדות הרקמות, ותן לו להישאר בטמפרטורת החדר למשך כ-30 דקות.

לאחר מכן, בצע מדידות TEER על ידי הנחת התוספות בזהירות בתא מדידת התנגדות הרקמות. להלן תמונות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה של PBECs, תרביות ואסטרוציטים שנצפו במשך חמישה ימים. שברי נימים מטוהרים ביום הראשון של התרבית הראשונית הראו נוכחות של נימים ותאים מזהמים, אשר לאחר שינוי בינוני ביום השני ויום נוסף של צמיחה, הראו ברירה עבור PBECs, שהחלו את צמיחתם משברי הנימים.

חד-שכבות קונפלואנט של PBECs הושגו בדרך כלל ביום הרביעי עד השישי, כאשר PBECs הראו מורפולוגיה בצורת ציר והיו מיושרים לאורך. אסטרוציטים של חולדות שנזרעו בבארות התחתונות התרבו בדרך כלל לשכבות קונפלואנט תוך חמישה ימים, ושימשו למודלים של קוקולטורה ללא מגע לאחר שבועיים של צמיחה. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שבע שעות.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים לחקור העברת תרופות וסחר בקולטנים בתאי אנדותל מוח הדוקים ומקוטבים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד ליצור מודל מחסום דם-מוח במבחנה שיכול לשמש למחקרים חדשים שאינם יכולים לבצע in vivo.