הנדסת רקמות הקרנית: במבחנה מודל של אינטראקציות סטרומה-עצב של הקרנית האנושית

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לחקור את האינטראקציות התאיות בין תאי סטרומה בקרנית האנושית לבין תאי עצב במטריצה החוץ-תאית הטבעית שלהם. ניתן להרחיב את הפרוטוקול לחקר מחלות קרנית וניוון, כגון קרטוקונוס, קרטופתיה סוכרתית וניוון פוקס. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הקרנית האנושית, על ידי זיהוי המנגנונים והפגמים הבסיסיים באינטראקציות עצביות סטרומה במהלך מחלת קרנית או ניוון ספציפי.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שלתאים מותר להפריש מטריצה חוץ-תאית משלהם במבחנה המספקת מודל טוב ומדויק יותר של רקמת הקרנית האנושית בפועל in vivo. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול במחלות קרנית, מכיוון שהערכה של אינטראקציות תא-תא ותא מטריצה חוץ-תאית תבטיח ייצוג מדויק של רקמת הקרנית, ותאפשר פיתוח תרופות ממוקד יותר. כעת, שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי נזק עצבי בקרנית והתחדשות.

ניתן ליישם אותו גם במערכות אחרות, כגון סינון ופיתוח תרופות. עם קבלת דגימות רקמת קרנית אנושית, העבירו את הרקמות לצלחת בגודל 21.5 סנטימטר רבוע המכילה שני מיליליטר של מי מלח סטריליים עם פוספט של Dulbecco. מקם את כיפת הקרנית עם הפנים כלפי מעלה והשתמש בסכין גילוח בזווית של 45 מעלות כדי לגרד את שכבת האפיתל.

לאחר מכן, הפוך את כיפת הקרנית עם הפנים כלפי מטה וגרד היטב את האנדותל מהסטרומה. שטפו את רקמת הסטרומה עם DPBS. שמור את חלקי הסטרומה רטובים עם DPBS, והשתמש בלהב כירורגי מספר 10 כדי לחתוך את רקמות הסטרומה לחתיכות קטנות.

השתמש במלקחיים סטריליים כדי להעביר את חתיכות הסטרומה לבקבוק תרבית T25 ללא מדיה. הניחו לצמחים להיצמד לתחתית הבקבוק בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך כ-30 עד 40 דקות. לאחר חיתוך מדויק של רקמת הסטרומה, העבירו בזהירות את הבקבוק לחממה.

חשוב להמתין 30 עד 40 דקות, ולאחר מכן להוסיף מדיה לאט. שלב זה קריטי כדי לאפשר היצמדות מלאה של האקספלנטים, ולמנוע ניתוק שלהם. לאחר ההדבקה, יש להוסיף לאט לאט את המדיום החיוני המינימלי של Eagle, המכיל 10% סרום בקר עוברי ו-1% אנטיביוטיקה-אנטי-פטריית לבקבוק, מבלי להפריע לצמחים.

הניחו בעדינות את הבקבוק בחממה בחום של 37 מעלות צלזיוס ו -5% פחמן דו חמצני. השאירו את הצמחים ללא הפרעה עד שהתאים יתחילו לבודד ולנדוד בבקבוק. לאחר כשבועיים עד ארבעה שבועות, התאים אמורים להגיע למפגש של 100%.

עם מפגש של 100%, יש לעבור את התאים על ידי הסרת מדיום תרבית הרקמה, ולשטוף את התאים עם DPBS. הוסף טריפסין לתאים, ולאחר מכן דגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר כחמש דקות, צפו בתאים במיקרוסקופ אור כדי לוודא שהם התנתקו.

עצור את הפרוטאוליזה על ידי הוספת מדיום טרי והעביר את תרחיף התאים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. צנטריפוגה של הצינורות ב-1000 x g כדי לגלול את התאים. הסר את הסופרנטנט בזהירות מבלי להפריע לגלולה והשהה את התאים במדיום טרי.

לאחר ביצוע ספירת תאים, זרע בערך פעם 10 עד ששת התאים בבקבוק תרבית T75 עם מדיום טרי להרחבה נוספת. כדי להרכיב מבנה תלת מימדי, תחילה עברו וספרו פיברובלסטים אנושיים בקרנית, ולאחר מכן זרעו בערך פעם אחת 10 עד ששת ה-HCF על גבי קרום פוליקרבונט עם נקבוביות של 0.4 מיקרון. הוסף 1.5 מיליליטר מדיום טרי לחלק העליון של המבנה.

לאחר מכן פיפטה עוד 1.5 מיליליטר מאותה מדיה לתחתית כל מבנה. לאחר 24 שעות, הוסף 1.5 מיליליטר של מדיום, בתוספת 0.5 מילי-מולרי ויטמין C לחלק העליון והתחתון של כל מבנה. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך שלושה שבועות, והוספת חומר טרי המכיל ויטמין C כל יומיים.

זה ימריץ את התאים להפריש ולהרכיב מטריצה חוץ-תאית משלהם. לאחר שלושה שבועות, הוסף שמונה פעמים 10 לתאי הנוירובלסטומה האנושיים השלישיים SH-SY5Y על גבי המבנים התלת-ממדיים שהורכבו קודם לכן. זה קריטי לחשב את מספר התא המדויק בשלב זה, ולאפשר 24 שעות לפני תחילת התמיינות התאים.

לאחר 24 שעות של דגירה, התחל התמיינות תאי SH-SY5Y על ידי גירוי התאים עם 1.5 מיליליטר EMEM עם 10% FBS וחומצה רטינואית מיקרו-מולרית 10. לאחר מכן הוסף 1.5 מיליליטר מהמדיום המכיל ויטמין C לתחתית המבנה. חומצה רטינואית רגישה לאור, ולכן יש לבצע שלב זה בחושך.

לאחר חמישה ימים, כאשר התאים מגיעים לשלב ההתמיינות, הוסיפו 1.5 מיליליטר של מדיום נטול סרום המכיל שני BDNF ננו-מולרי ו-1% אנטיביוטיקה-אנטי-פטריית לחלק העליון של המבנה. הוסף מדיום טרי בתוספת ויטמין C לתחתית המבנה. תרבית התאים במשך יומיים נוספים לפני העיבוד להמשך ניתוח.

זוהי תמונת מיקרוסקופ אלקטרונים בהגדלה גבוהה של המבנה התלת-ממדי בהרכבה עצמית המציגה את קרום הפוליקרבונט ותאי הסטרומה של הקרנית היושבים מעל. תמונה זו מציגה את תאי העצב המובחנים היושבים למעלה, המציגים סידור תאים סטרומליים-עצביים. החצים בתמונה מראים את תאי העצב.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על רקמת קרנית רטובה בכל עת, בעת חיתוך צמחים, ולשמור על מכשירי ניתוח ולהבים סטריליים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להגדיר ולהשתמש במודל זה במבחנה כדי לחקור את האינטראקציות התאיות בין תאי סטרומה בקרנית האנושית לבין תאי עצב במטריצה החוץ-תאית הטבעית שלהם. אל תשכח שעבודה עם BDNF, חומצה רטינואית ולהבים כירורגיים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון לבישת ביגוד מגן מתאים, בעת ביצוע הליך זה.