Name: הנדסת רקמות הקרנית: במבחנה מודל של אינטראקציות סטרומה-עצב של הקרנית האנושית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: חקור אינטראקציות תאיות בין תאי סטרומה קרנית לתאי עצב במטריצה חוץ-תאית טבעית. מודל תלת-ממדי זה מסייע להבנת נזק וחידוש עצבים בקרנית האנושית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להרחיב שלנו כנה בזכות ד ר בן פאולר לעזרה טכנית שלו עם הניסויים TEM.

פרוטוקול זה עוקב אחר הקווים המנחים של ועדת הבדיקה אוניברסיטת אוקלהומה למדעי הבריאות מרכז/המוסדי (IRB #4509). כל חלקי הפרוטוקול פגש את העיקרים של ההכרזה של הלסינקי. דוגמאות הקרנית התקבלו פיתוח לאומי, מכון מחקר (NDRI) והגדה העין אריות אוקלהומה.
1. בידוד תאי ראשי
<ol><li>עם קבלת דגימות רקמות הקרנית האנושית, להעביר את הרקמות 21.5 ס מ2 פטרי המכילות 2 מ ל תמיסת סטרילית של Dulbecco באגירה פוספט (DPBS) (1 x).</li>
	<li>לגרד ולהסיר את אפיתל הקרנית על-ידי הצבת את הקרנית כיפת פנים כלפי מעלה. כדי להבטיח הסרה מלאה, לגרד את השכבה אפיתל ביסודיות בעזרת סכין גילוח בזווית של 45°. בשלב הבא, הפוך את הקרנית הכיפה, הפנים כלפי מטה, ביסודיות שתגרד אנדותל מ stroma עם סכין גילוח בזווית של 45° כדי להבטיח הסרה מלאה. לשטוף את הרקמה סטרומה עם DPBS.</li>
	<li>חותכים את רקמות סטרומה לחתיכות קטנות, באמצעות להב כירורגי מספר 10, שמירה על החלקים סטרומה רטוב כל הזמן באמצעות DPBS. להרים חתיכות סטרומה עם מלקחיים סטרילי ומקום לתוך בקבוקון תרבות T25 ללא מדיה (4 או 5 חתיכות של 2 x 2 מ"מ רקמות לאדם את הבקבוק).</li>
	<li>אפשר את explants לדבוק בתחתית הבקבוק ב 37 מעלות צלזיוס במשך כ- 30-40 דקות. ברגע דבקה, להוסיף לאט המינימום חיוני בינוני רשנה (EMEM) המכיל 10% סרום שור עוברית (FBS) ו 1% אנטיביוטיקה/Antimycotic את. הבקבוק מבלי להפריע את explants.</li>
	<li>הנח בעדינות את הבקבוק בחממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2. להשאיר את explants ללא הפרעה עד והתאים מתחילים בידוד ושל העברת בתוך הבקבוק. לאחר כ- 2-4 שבועות, תאים כדאי להגיע למפגש 100%. על 100% הנהרות, המעבר את התאים על ידי הסרת התקשורת תרביות רקמה, לשטוף את התאים עם DPBS.</li>
	<li>להוסיף טריפסין לתאים ולאחר מכן דגירה אותם ב 37 º C. לאחר כ 5 דקות, הצג את התאים תחת מיקרוסקופ אור כדי לאשר כי הם יש תלושים, אז לעצור את proteolysis על-ידי הוספת מדיה טריים.</li>
	<li>העברת התליה תא לתוך צינור חרוטי 15 mL עבור צנטריפוגה-1,000 x g... להסיר את תגובת שיקוע בזהירות מבלי להפריע בגדר והשהה את התאים EMEM טריים 10% FBS 1% לאנטיביוטיקה. לספור את התאים ואת זרע על עונה 1 פרק 106 תאים T75 הבקבוק תרבות להרחבה נוספת עם EMEM טרי 1% FBS 1% לאנטיביוטיקה.</li>
</ol>2. ראשי HCFs תרבות, מכלול מבנים תלת-ממד
<ol><li>להרכיב 3D מבנים מן explants EMEM בעבר מבוגר ב 10% FBS 1% אנטיביוטיקה/Antimycotic, מעבר, הרוזן HCFs.</li>
	<li>זרע כ עונה 1 פרק 106 תאים/טוב של HCFs ראשי-פוליקרבונט מוסיף קרום עם נקבוביות 0.4-מיקרומטר מן המבנה התלת-ממד, יחד עם 1.5 מ של טרי EMEM 10% FBS 1% אנטיביוטיקה/Antimycotic לחלק העליון של הבונה. להוסיף עוד כ- 1.5 מ ל אותה מדיה לתחתית של כל המבנה.</li>
	<li>לאחר 24 שעות של התא זריעה, התרבות התאים עם EMEM 10% FBS 1% אנטיביוטיקה/Antimycotic, מגורה בחומצה 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic 0.5 מ מ (ויטמין C) על ידי הוספת 1.5 mL בחלק העליון ו- mL 1.5 על החלק התחתון של כל המבנה.</li>
	<li>לשמור על התרבויות באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך 3 שבועות והענק מדיה טריים בכל יום במהלך תקופת המחקר כולו. אין מעבר נוספת נדרשת.</li>
</ol>3. תא בידול ותרבויות שיתוף
<ol><li>לאחר 3 שבועות, להוסיף 8 x 103 תאים/טוב של תאים נוירובלסטומה האנושי SH-SY5Y בראש 3D בעבר שהורכב בונה המכילה 1.5 מ ל EMEM המכיל 10% FBS, 1% אנטיביוטיקה/Antimycotic, ו- 0.5 מ מ 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic חומצה (ויטמין C).<ol>
<li>אפשר לגדול על גבי תאי סטרומה קרנית לפחות 24 שעות לפני ביצוע תאית התמיינות התאים נוירובלסטומה SH-SY5Y.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ליזום SH-SY5Y תאית התמיינות על ידי גירוי התאים עם EMEM המכיל 1% FBS ו 1.5 מיליליטר 10 מיקרומטר חומצה Retinoic מעל הבונה. להוסיף 1.5 מ ל מהל EMEM 10% FBS 1% אנטיביוטיקה/Antimycotic 0.5 מ מ 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic (ויטמין C) לתחתית של הבונה. שימו לב כי יש לבצע את הצעד חומצה Retinoic בחושך.<ol>
<li>להמשיך התרבות התאים בתקשורת בידול זה במשך 5 ימים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כאשר התאים מגיעים לשלב בידול, להחליף את התאים 1.5 מ של מדיה ללא סרום המכיל 2 nM של neurotrophic המוח-derived factor (BDNF) ו 1% אנטיביוטיקה/Antimycotic להוסיף EMEM, על-ידי הוספת לחלק העליון של הבונה. להוסיף 1.5 מ ל מהל EMEM 10% FBS 1% אנטיביוטיקה/Antimycotic 0.5 מ מ 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic (ויטמין C) לתחתית של הבונה. שימו לב כי יש לבצע את הצעד BDNF בחושך.</li>
	<li>התרבות התאים 2 ימים נוספים לפני עיבוד עבור כל ניתוח נוסף כמצוין בטבלה1.</li>
</ol>

<ol><li>Pascolini, D., Mariotti, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+estimates+of+visual+impairment%3A+2010%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Global estimates of visual impairment: 2010.</a> Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).</li>
<li>Rönkkö, S., Vellonen, K. -S., Järvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+corneal+cell+culture+models+for+drug+toxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Delivery+and+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Human corneal cell culture models for drug toxicity studies.</a> Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).</li>
<li>Ghezzi, C. E., Rnjak-Kovacina, J., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+tissue+engineering%3A+recent+advances+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Corneal tissue engineering: recent advances and future perspectives.</a> Tissue Eng Part B Rev. 21 (3), 278-287 (2015).</li>
<li>Shafaie, S., Hutter, V., Cook, M. T., Brown, M. B., Chau, D. Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Cell+Models+for+Ophthalmic+Drug+Development+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22BioResearch+Open+Access%22%5BJournal%5D)">In Vitro Cell Models for Ophthalmic Drug Development Applications.</a> BioResearch Open Access. 5 (1), 94-108 (2016).</li>
<li>Shaheen, B. S., Bakir, M., Jain, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+nerves+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Surv+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Corneal nerves in health and disease.</a> Surv Ophthalmol. 59 (3), 263-285 (2014).</li>
<li>Beuerman, R. W., Schimmelpfennig, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+denervation+of+the+rabbit+cornea+affects+epithelial+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Sensory denervation of the rabbit cornea affects epithelial properties.</a> Exp Neurol. 69 (1), 196-201 (1980).</li>
<li>Heigle, T. J., Pflugfelder, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous+tear+production+in+patients+with+neurotrophic+keratitis%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Aqueous tear production in patients with neurotrophic keratitis.</a> Cornea. 15 (2), 135-138 (1996).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+3D+corneal+tissue+model+with+epithelium%2C+stroma%2C+and+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">In vitro 3D corneal tissue model with epithelium, stroma, and innervation.</a> Biomaterials. 112, 1-9 (2017).</li>
<li>Ross, R. A., Spengler, B. A., Biedler, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+morphological+and+biochemical+interconversion+of+human+neuroblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Coordinate morphological and biochemical interconversion of human neuroblastoma cells.</a> J Natl Cancer Inst. 71 (4), 741-747 (1983).</li>
<li>Griffith, L. G., Naughton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+-+Current+challenges+and+expanding+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering - Current challenges and expanding opportunities.</a> Science. 295 (5557), (2002).</li>
<li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+characterization+of+organized+extracellular+matrix+deposition+by+ascorbic+acid-stimulated+human+corneal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Morphologic characterization of organized extracellular matrix deposition by ascorbic acid-stimulated human corneal fibroblasts.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (9), 4050-4060 (2007).</li>
<li>Karamichos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+tissue+engineering%3A+current+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Funct+Biomater%22%5BJournal%5D)">Ocular tissue engineering: current and future directions.</a> J Funct Biomater. 6 (1), 77-80 (2015).</li>
<li>Karamichos, D., Brown, R. A., Mudera, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+stiffness+regulates+cellular+contraction+and+matrix+remodeling+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Collagen stiffness regulates cellular contraction and matrix remodeling gene expression.</a> J Biomed Mater Res A. 83 (3), 887-894 (2007).</li>
<li>Ruberti, J. W., Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prelude+to+corneal+tissue+engineering+-+gaining+control+of+collagen+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Prelude to corneal tissue engineering - gaining control of collagen organization.</a> Prog Retin Eye Res. 27 (5), 549-577 (2008).</li>
<li>Karamichos, D., Guo, X. Q., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+corneal+fibrosis%3A+an+in+vitro+model%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Human corneal fibrosis: an in vitro model.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (3), 1382-1388 (2010).</li>
<li>Chen, F. M., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+biomaterials+of+human+origin+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Polym+Sci%22%5BJournal%5D)">Advancing biomaterials of human origin for tissue engineering.</a> Prog Polym Sci. 53, 86-168 (2016).</li>
<li>Priyadarsini, S., Sarker-Nag, A., Rowsey, T. G., Ma, J. X., Karamichos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+3D+In+Vitro+Model+to+Accelerate+the+Development+of+Human+Therapies+against+Corneal+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Establishment of a 3D In Vitro Model to Accelerate the Development of Human Therapies against Corneal Diabetes.</a> PLoS One. 11 (12), e0168845(2016).</li>
<li>Karamichos, D., Hjortdal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratoconus%3A+tissue+engineering+and+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Funct+Biomater%22%5BJournal%5D)">Keratoconus: tissue engineering and biomaterials.</a> J Funct Biomater. 5 (3), 111-134 (2014).</li>
<li>Wilson, S. L., Yang, Y., El Haj, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+Stromal+Cell+Plasticity%3A+In+Vitro+Regulation+of+Cell+Phenotype+Through+Cell-Cell+Interactions+in+a+Three-Dimensional+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Corneal Stromal Cell Plasticity: In Vitro Regulation of Cell Phenotype Through Cell-Cell Interactions in a Three-Dimensional Model.</a> Tissue Engineering Part A. 20 (1-2), 225-238 (2014).</li>
<li>Proulx, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+a+human+cornea+by+the+self-assembly+approach+of+tissue+engineering+using+the+three+native+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of a human cornea by the self-assembly approach of tissue engineering using the three native cell types.</a> Molecular Vision. 16 (234-236), 2192-2201 (2010).</li>
<li>Gonzalez-Andrades, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+novel+in+vitro+model+of+stratified+epithelial+wound+healing+with+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Establishment of a novel in vitro model of stratified epithelial wound healing with barrier function.</a> Sci Rep. 6, 19395(2016).</li>
<li>Hopkins, A. M., DeSimone, E., Chwalek, K., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+in+vitro+modeling+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">3D in vitro modeling of the central nervous system.</a> Prog Neurobiol. 125, 1-25 (2015).</li>
<li>Schulz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+Corneal+Cell-Based+Microenvironment+as+Prerequisite+for+Balanced+3D+Corneal+Epithelial+Morphogenesis%3A+A+Promising+Animal+Experiment-Abandoning+Tool+in+Ophthalmology%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C-Methods%22%5BJournal%5D)">Natural Corneal Cell-Based Microenvironment as Prerequisite for Balanced 3D Corneal Epithelial Morphogenesis: A Promising Animal Experiment-Abandoning Tool in Ophthalmology.</a> Tissue Engineering Part C-Methods. 20 (4), 297-307 (2014).</li>
<li>Gao, J., Wang, Y., Zhao, X., Chen, P., Xie, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-204-5p-Mediated+Regulation+of+SIRT1+Contributes+to+the+Delay+of+Epithelial+Cell+Cycle+Traversal+in+Diabetic+Corneas%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-204-5p-Mediated Regulation of SIRT1 Contributes to the Delay of Epithelial Cell Cycle Traversal in Diabetic Corneas.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1493-1504 (2015).</li>
<li>Koulikovska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+regeneration+of+corneal+tissue+via+a+bioengineered+collagen+construct+implanted+by+a+nondisruptive+surgical+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Enhanced regeneration of corneal tissue via a bioengineered collagen construct implanted by a nondisruptive surgical technique.</a> Tissue Eng Part A. 21 (5-6), 1116-1130 (2015).</li>
<li>Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+corneal+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+retinal+and+eye+research%22%5BJournal%5D)">Progress in corneal wound healing.</a> Progress in retinal and eye research. 49, 17-45 (2015).</li>
<li>Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+and+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix and wound healing.</a> Curr Opin Ophthalmol. 12 (4), 237-241 (2001).</li>
<li>Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor-beta3+regulates+assembly+of+a+non-fibrotic+matrix+in+a+3D+corneal+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model.</a> J Tissue Eng Regen Med. 5 (8), e228-e238 (2011).</li>
<li>Karamichos, D., Lakshman, N., Petroll, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+model+for+assessing+fibroblast+migration+in+3-D+collagen+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">An experimental model for assessing fibroblast migration in 3-D collagen matrices.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (1), 1-9 (2009).</li>
<li>Karamichos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+in+Vitro+Model+for+Keratoconus+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Funct+Biomater%22%5BJournal%5D)">Novel in Vitro Model for Keratoconus Disease.</a> J Funct Biomater. 3 (4), 760-775 (2012).</li>
</ol>

המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

מספר מחקרים התמקדו על פיתוח מודלים בבעלי חיים שונים יכולים לעזור לפתח הבנה טובה יותר של מחלות הקרנית וכן לגלות טיפולים. עם זאת, ערך משמעותי לבני ממחקרים אלה לא אומת. עד כה, מודלים שונים במבחנה יש כבר שפותחו ונחקרו נרחב עקב שלהם משמעות קלינית יוצא מן הכלל. המודל שלנו שנקבעו קודם 3D במבחנה הוא מערכת הרומן משמעותית תורם התקדמות מדע הרפואה מחקר חזון, מציג יכולת ללא רבב של recapitulating ויוו אירועים במבחנה28 , 29 , <sup ...

בגוף האדם, הקרנית היא הרקמה innervated ביותר. העצבים אחראים על תחושות שונות כמו מגע, כאב, טמפרטורה, ויש גם תפקיד חיוני ריפוי פצעים, ממצמץ רפלקסים, לקרוע הייצור, ועל הפרשת5,6,7. הקרנית, גזעי עצב סטרומה נובעים מקלעת limbal והזן stroma הקרנית היקפיים בצורה רדיאלית. הארגון עצב סטרומה במקביל lamellae קולגן, הם עוד סניף לתוך קטנות fascicles הם התקדמותך לעבר שטחי משתית5,8. סיבי העצב עוד לחדור את שכבת האפיתל, לפיכך, העצבוב נרחב מתפרסת על פני אפיתל הקרנית משתית. לכן, העצבוב יש תפקיד חיוני במדינת בריאים וחולים של הקרנית. ב פרוטוקול זה, אנו חושפים את ההתקדמות של הרומן 3D במבחנה דוגמן, הוא הראשון מסוגו כדי לחקות את האינטראקציות סטרומה-עצב ויוו . שורת התאים SH-SY5Y נעשה שימוש במחקר זה, כי הוא אחד הקווים הוותיקים ביותר, טוב מאופיין המשמשות ללימוד צמיחה עצביים. שורת התאים SH-SY5Y כבר מתואר לייצר שני מחסידי המצע (S-type), neuroblastic (מסוג N) תאים זה יכול לעבור transdifferentiation9. כתוצאה מכך, אף-על-פי קו תא זה נגזר מתוך מבחר טריפל subclone רצופות של תאים מסוג N, הוא מכיל גם מספר קטן של S-type תאים שעברו התמיינות לתוך הנוירונים באמצעות retinoic חומצה, נגזר המוח neurotrophic פקטור9. זה מספק כלי זה עשוי להוביל להבנה טובה יותר של הקרנית הסיבוכים עם רטינופתיה סוכרתית (DM) ומחלות אחרות עינית. בשל הקשיים הקשורים בהשגת culturing נוירונים של חולים עם מחלה עינית, מודל זה 3D במבחנה מספק השלכות משמעותית הלומדים את האינטראקציות עצביים, איתות עם stroma הקרנית.
תנאים חולה לעיתים קרובות משפיעים על רקמות שונות בגוף בקנה מידה גדול מאוד, המוביל אל איכות חיים בסכנה. Dystrophies עינית סיבוכים נפוצים קשורה לעיתים קרובות עם מחלות מערכתיות ולהוביל אובדן של חדות הראייה או אובדן ראייה ואפילו קבע. מחקרים מקיפים חיוניים לעתים קרובות לצורך הבנה טובה יותר של מצב המחלה, כמו גם את ההשפעות ברמה התאית הבזליים. לחקור את ההשפעות של מחלות כאלה, פותחו מודלים שונים ב- vivo ו- in vitro לקשרי עם העזרה של רקמות יישומי הנדסה. יישומי הנדסת רקמות הקרנית משכו עניין רב ברחבי בתחומים השונים של מדעי10,11,12,13,14, אך ישנן מגבלות הגדולות עדיין במהלך יישום בפועל, לרבות הקרנית להשתיל דחיות, דלקות וצלקות10,11,12,13,14. ישנם מספר מחקרים יש בהצלחה פיתח והקים שונים במבחנה מודלים3,15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25,26. דגמי תלת-ממד במבחנה הם המבטיחים ביותר עניין מדעי רב. דגמי תלת-ממד ידועים יותר לשקף ויוו הסלולר האירועים ופיזיולוגיים הן קריטיות במהלך פיברוזיס, פצע ריפוי15,27,28,29. מודלים אלה במבחנה לשחק תפקיד חשוב למצוא גישות טיפוליות חדשות לטיפול במצבים למחלות שונות כולל סיבוכים הקרנית. למרות תפקיד קריטי של העצבוב בפונקציות הקרנית, הפך מעט מאמץ כדי לקדם את הפצת במערכת העצבים ההיקפית בתוך הקרנית בונה רקמות מהונדסים2,3. עם זאת, המבנה תא המוצע 3D במבחנה לחקות את רקמת המטרה כדי להשיג את הפונקציונליות הרקמה הרצויה.
בעוד keratopathy סוכרתית הוא יישום ברור עבור המודל המתואר כאן בשל הליקויים עצביים, ישנן מספר מחלות הקרנית אחרות יכולים להפיק תועלת מודל אנושי במבחנה כולל dystrophies קרטוקונוס, פוקס. דגם התלת-ממד שלנו מגיח זה פרוספקט, מציע הפיתוח של ייצוג במבחנה של רקמת הקרנית כדי להעריך תרופות והבטיחות של תרופות חדשות עינית.

<table><tbody><tr><td>רקמת קרנית בריאה</td><td>דגימות NDRI</td><td></td><td>מתורמים ללא טראומה עינית או מחלה מערכתית</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphate Buffered Solution (1X)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים סטריליים</td><td>Fischer Scientific</td><td>13-812-42</td><td>Fisherbrand Dissecting Extra-Ped-Pointed Splinter Celinters</td></tr><tr><td>סכיני גילוח בקצה יחיד</td><td>Personna</td><td>270100</td><td></td></tr><tr><td>להבי אזמל כירורגיים סטריליים מס' 10</td><td>להב כירורגי נוצה</td><td>2976#10</td><td></td></tr><tr><td>Eagle' s Minimum Essential Medium</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td>10% FBS נדרש להכנת מדיה</td></tr><tr><td>אנטיביוטיקה-אנטימיקוטיקה (100X)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>1% אנטיביוטיקה-אנטימיקוטיקה נדרשת להכנת מדיה</td></tr><tr><td>0.05% טריפסין EDTA(1X)</td><td>Gibco של Life Technologies</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>מוסיף קרום פוליקרבונט עם 0.4-&mu; נקבוביות</td><td>קורנינג קוסטאר</td><td>3412</td><td></td></tr><tr><td>2-O-&alpha;-Dglucopyranosyl-L-חומצה אסקורבית (ויטמין C)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>SMB00390-14</td><td>יש להשתמש בריכוז של 0.5 מ"מ למחקר</td></tr><tr><td>בלוק שעווה</td><td>VWR</td><td>50-949-027</td><td></td></tr><tr><td>SH-SY5Y תאי נוירובלסטומה</td><td>ATCC</td><td>SHSY5YATCC CRL-2266</td><td></td></tr><tr><td>חומצה רטינואית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>SRP3014-10UG</td><td>יש להשתמש בריכוז סופי של 10uM</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625-100MG</td><td>יש להשתמש בריכוז סופי של 2nM</td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td> <td>VWR-Alfa Aesar</td><td>67-68-5</td><td>Ultra Pure Grade-Sterile DMSO לשימוש</td></tr> תרמו <tr><td>מדעי Nunc Cell Culture מטופל EasYFlasks (T25)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>12-565-351</td><td></td></tr><tr><td>תרבית תאים Nunc Thermo Scientific מטופלת EasYFlasks (T75)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-565-349</td><td></td></tr></tbody></table>

הנדסת רקמות הקרנית: במבחנה מודל של אינטראקציות סטרומה-עצב של הקרנית האנושית

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

הנדסת רקמות זכה להכרה משמעותית בשל הביקוש הגבוה החלפת הקרנית האנושית בערך 10 מיליון אנשים ברחבי העולם הסובלים אובדן ראייה הקרנית1. כדי לענות על הביקוש קיימא הקרנית האנושית, התקדמות משמעותית ברקמה תלת מימדי (3D) הנדסה הפך2,3,4. מודלים אלה קרנית נע בין מערכות חד שכבתי פשוטה דגמי מרובה שכבות, שמוביל תלת-ממד מלא-עובי הקרנית ששווי הערך2.
עם זאת, השימוש של הקרנית רקמות מהונדסים 3D בהקשר של במבחנה המחלה מודלים למד עד תאריך חסר דמיון המבנה מרובה שכבות תלת-ממד רקמת הקרנית, פונקציה של הרשתות של סוגי תאים שונים (כלומר, חוצפה, אפיתל stroma, אנדותל)2,3. בנוסף, גדל הביקוש במבחנה מודלים רקמת הקרנית בניסיון להפחית את הניסויים בחיות עבור מוצרים פרמצבטיים. לפיכך, דגמים מתוחכמים יותר נדרשים על מנת שיתאימו יותר מערכות לדרישות הפיזיולוגיות האנושי, הפיתוח של מודל זה יותר רלוונטי האוכלוסייה המטופלת הוא הכרחי. בהתחשב בכך סוגי תאים מרובים הקרנית מושפעים ומחלות dystrophies, כגון קרטוקונוס, Keratopathy סוכרתית, פוקס, מודל זה כולל דגם תלת-ממד תרבות משותפת של ראשי האדם הקרנית fibroblasts (HCFs) תורמים בריא, נוירונים מ הקו תא SH-SY5Y. זה מאפשר לנו לראשונה לחקור את האינטראקציות בין סוגי שני תאים בתוך הרקמה הקרנית האנושית. אנו מאמינים כי מודל זה יכול באופן פוטנציאלי לנתח המנגנונים הבסיסית המשויכת את האינטראקציות סטרומה-עצב של מחלות קרנית כי התערוכה עצב נזקים. דגם תלת-ממד זה מראות הטבע אנטומית, פיזיולוגית בסיסית של ה רקמת הקרנית ויוו , יכול לשמש בעתיד ככלי עבור חוקרים פגמים הקרנית, כמו גם הקרנת את היעילות של סוכנים שונים לפני הניסויים בחיות.

איור 1 היא תמונה מייצגת שלב אחר שלב של דגם תלת-ממד in vitro לקשרי עבודה. בשלב הראשון, תאים מבודדים מן הקרנית האנושית. לאחר מכן, הם גדל על קרום פוליקרבונט, גירוי עם ויטמין C להרכיב עצמית על ידי מטריצה תלת-ממד. מערכת זו לבנות 3D גורם הסינתזה של יישום מרובה שכבות הסלולר ויוו-כמו מטריקס סטרומה. לאחר מכן, נוירובלסטומה תאים הם נזרע על גבי תאי סטרומה ואחריו מתחילה התמיינות תאים עצביים. זה מוביל תרבות משותפת של הקרנית סטרומה תאים תאים עצביים במודל ת...

פרוטוקול זה מתאר את הרומן תלת מימדי במבחנה מודל, שבו תאי סטרומה הקרנית ואת תאים עצביים מתורבתים יחד כדי לסייע בדיקה והבנה של האינטראקציות של תא שני הסוגים.

Tissue engineering has gained substantial recognition due to the high demand for human cornea replacements with an estimated 10 million people worldwide ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לחקור את האינטראקציות התאיות בין תאי סטרומה בקרנית האנושית לבין תאי עצב במטריצה החוץ-תאית הטבעית שלהם. ניתן להרחיב את הפרוטוקול לחקר מחלות קרנית וניוון, כגון קרטוקונוס, קרטופתיה סוכרתית וניוון פוקס. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הקרנית האנושית, על ידי זיהוי המנגנונים והפגמים הבסיסיים באינטראקציות עצביות סטרומה במהלך מחלת קרנית או ניוון ספציפי.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שלתאים מותר להפריש מטריצה חוץ-תאית משלהם במבחנה המספקת מודל טוב ומדויק יותר של רקמת הקרנית האנושית בפועל in vivo. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול במחלות קרנית, מכיוון שהערכה של אינטראקציות תא-תא ותא מטריצה חוץ-תאית תבטיח ייצוג מדויק של רקמת הקרנית, ותאפשר פיתוח תרופות ממוקד יותר. כעת, שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי נזק עצבי בקרנית והתחדשות.ניתן ליישם אותו גם במערכות אחרות, כגון סינון ופיתוח תרופות. עם קבלת דגימות רקמת קרנית אנושית, העבירו את הרקמות לצלחת בגודל 21.5 סנטימטר רבוע המכילה שני מיליליטר של מי מלח סטריליים עם פוספט של Dulbecco. מקם את כיפת הקרנית עם הפנים כלפי מעלה והשתמש בסכין גילוח בזווית של 45 מעלות כדי לגרד את שכבת האפיתל.לאחר מכן, הפוך את כיפת הקרנית עם הפנים כלפי מטה וגרד היטב את האנדותל מהסטרומה. שטפו את רקמת הסטרומה עם DPBS. שמור את חלקי הסטרומה רטובים עם DPBS, והשתמש בלהב כירורגי מספר 10 כדי לחתוך את רקמות הסטרומה לחתיכות קטנות.השתמש במלקחיים סטריליים כדי להעביר את חתיכות הסטרומה לבקבוק תרבית T25 ללא מדיה. הניחו לצמחים להיצמד לתחתית הבקבוק בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך כ-30 עד 40 דקות. לאחר חיתוך מדויק של רקמת הסטרומה, העבירו בזהירות את הבקבוק לחממה.חשוב להמתין 30 עד 40 דקות, ולאחר מכן להוסיף מדיה לאט. שלב זה קריטי כדי לאפשר היצמדות מלאה של האקספלנטים, ולמנוע ניתוק שלהם. לאחר ההדבקה, יש להוסיף לאט לאט את המדיום החיוני המינימלי של Eagle, המכיל 10% סרום בקר עוברי ו-1% אנטיביוטיקה-אנטי-פטריית לבקבוק, מבלי להפריע לצמחים.הניחו בעדינות את הבקבוק בחממה בחום של 37 מעלות צלזיוס ו -5% פחמן דו חמצני. השאירו את הצמחים ללא הפרעה עד שהתאים יתחילו לבודד ולנדוד בבקבוק. לאחר כשבועיים עד ארבעה שבועות, התאים אמורים להגיע למפגש של 100%.עם מפגש של 100%, יש לעבור את התאים על ידי הסרת מדיום תרבית הרקמה, ולשטוף את התאים עם DPBS. הוסף טריפסין לתאים, ולאחר מכן דגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר כחמש דקות, צפו בתאים במיקרוסקופ אור כדי לוודא שהם התנתקו.עצור את הפרוטאוליזה על ידי הוספת מדיום טרי והעביר את תרחיף התאים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. צנטריפוגה של הצינורות ב-1000 x g כדי לגלול את התאים. הסר את הסופרנטנט בזהירות מבלי להפריע לגלולה והשהה את התאים במדיום טרי.לאחר ביצוע ספירת תאים, זרע בערך פעם 10 עד ששת התאים בבקבוק תרבית T75 עם מדיום טרי להרחבה נוספת. כדי להרכיב מבנה תלת מימדי, תחילה עברו וספרו פיברובלסטים אנושיים בקרנית, ולאחר מכן זרעו בערך פעם אחת 10 עד ששת ה-HCF על גבי קרום פוליקרבונט עם נקבוביות של 0.4 מיקרון. הוסף 1.5 מיליליטר מדיום טרי לחלק העליון של המבנה.לאחר מכן פיפטה עוד 1.5 מיליליטר מאותה מדיה לתחתית כל מבנה. לאחר 24 שעות, הוסף 1.5 מיליליטר של מדיום, בתוספת 0.5 מילי-מולרי ויטמין C לחלק העליון והתחתון של כל מבנה. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך שלושה שבועות, והוספת חומר טרי המכיל ויטמין C כל יומיים.זה ימריץ את התאים להפריש ולהרכיב מטריצה חוץ-תאית משלהם. לאחר שלושה שבועות, הוסף שמונה פעמים 10 לתאי הנוירובלסטומה האנושיים השלישיים SH-SY5Y על גבי המבנים התלת-ממדיים שהורכבו קודם לכן. זה קריטי לחשב את מספר התא המדויק בשלב זה, ולאפשר 24 שעות לפני תחילת התמיינות התאים.לאחר 24 שעות של דגירה, התחל התמיינות תאי SH-SY5Y על ידי גירוי התאים עם 1.5 מיליליטר EMEM עם 10% FBS וחומצה רטינואית מיקרו-מולרית 10. לאחר מכן הוסף 1.5 מיליליטר מהמדיום המכיל ויטמין C לתחתית המבנה. חומצה רטינואית רגישה לאור, ולכן יש לבצע שלב זה בחושך.לאחר חמישה ימים, כאשר התאים מגיעים לשלב ההתמיינות, הוסיפו 1.5 מיליליטר של מדיום נטול סרום המכיל שני BDNF ננו-מולרי ו-1% אנטיביוטיקה-אנטי-פטריית לחלק העליון של המבנה. הוסף מדיום טרי בתוספת ויטמין C לתחתית המבנה. תרבית התאים במשך יומיים נוספים לפני העיבוד להמשך ניתוח.זוהי תמונת מיקרוסקופ אלקטרונים בהגדלה גבוהה של המבנה התלת-ממדי בהרכבה עצמית המציגה את קרום הפוליקרבונט ותאי הסטרומה של הקרנית היושבים מעל. תמונה זו מציגה את תאי העצב המובחנים היושבים למעלה, המציגים סידור תאים סטרומליים-עצביים. החצים בתמונה מראים את תאי העצב.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על רקמת קרנית רטובה בכל עת, בעת חיתוך צמחים, ולשמור על מכשירי ניתוח ולהבים סטריליים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להגדיר ולהשתמש במודל זה במבחנה כדי לחקור את האינטראקציות התאיות בין תאי סטרומה בקרנית האנושית לבין תאי עצב במטריצה החוץ-תאית הטבעית שלהם. אל תשכח שעבודה עם BDNF, חומצה רטינואית ולהבים כירורגיים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון לבישת ביגוד מגן מתאים, בעת ביצוע הליך זה.

corneal-tissue-engineering-an-vitro-model-stromal-nerve-interactions

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

סרטון זה מדגים טכניקה ליצירת מערכת מודל תלת-ממדית של תרבית משותפת של פיברובלסטים ראשוניים בקרנית האנושית ותאים עצביים ממוינים. מערכת תרבית משותפת זו יכולה לשמש לחקר אינטראקציות סטרומה-עצב.

יצירת מודל תלת-ממדי של תרבית משותפת של פיברובלסטים ונוירונים בקרנית האדם

אנו מדווחים טכניקה לייצור של micropockets בתוך ממברנות electrospun בי ללמוד התנהגות תא. באופן ספציפי, אנו מתארים שילוב של microstereolithography וelectrospinning לייצור PLGA (פולי (lactide-CO-glycolide)) ההתקנים ביולוגי קרני מצוידים בmicrofeatures.

שילוב של Microstereolithography וElectrospinning כדי לייצר ממברנות מצויד בגומחות להתחדשות קרנית

תרבות עיקרית של תאי אנדותל קרניים שור שמשה לחקור את המנגנון של מעבר אנדותל-mesenchymal הקרני. יתר על כן, מודל cryoinjury האנדותל עכברוש הקרני שמש להפגין מעבר אנדותל-mesenchymal קרני in vivo.

במבחנה מודלים Vivo ללמוד קרנית האנדותל-mesenchymal מעבר

פרוטוקול עבור אקסית vivo איברים הקרנית תרבות מודל שימושי עבור לימודי ריפוי הפצע מתואר. מערכת מודל זה יכול לשמש כדי להעריך את ההשפעות של סוכני כדי לקדם ריפוי משובי או רעילות התרופה סביבה מאורגנת multicellular תלת-ממד.

Ex-Vivo איברים הקרנית מודל תרבות עבור ריפוי פצעים מחקרים

כאן, פרוטוקול צעד אחר צעד להכנה וטיפוח של כפתורי הקרנית מפוצל חזירי מוצג. כמו זה אורגאנו-מעובד בדרך כלל מודל תרבות האיברים מראה שיעורי מוות של תאים בתוך 15 ימים, המקבילה לקרנית התורם האנושי, הוא מייצג את המודל הראשון המאפשר טיפוח לטווח ארוך של קרניות לא אנושיות מבלי להוסיף דקטרן רעיל.

מודל של הקרנית של הקרניות הפותל באמצעות לחצני הקרנית מפוצלת

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לנתק את תאי הקרניות של הקרנית (CEC) מהקרום של האישה (DM) באמצעות "YAG" (בלייזר) של ממברנה הvivo לשעבר של המחלה של keratopathy בולולס (BK).

פיתוח של מודל פולשני, בסיוע לייזר של הקרנית הפסד של תא אנדותל

פרוטוקול זה מתאר את הצעדים הקריטיים הנדרשים כדי ליצור ולגדל תרביות תאים של הקרנית מפני הצמח של רקמת האדם או הכבשים. שיטה לתאי הקרנית משנית של תאים אנדותל על קרומי ביוארילים מוצג גם.

צמיחת הקרנית של האדם והכבשים שכבות של תאי-על ביומטריה

כאן, מודלים של בעלי חיים המבוססים על עכבר וארנב מפותחים עבור פגיעה מכנית וכימית של אפיתל הקרנית כדי לסנן טיפולים חדשים ואת המנגנון הבסיסי.

מודלים של בעלי חיים של Ex Vivo ו-In Vivo לפציעות מכניות וכימיות של אפיתל הקרנית

Stripping Only של Descemet הוא הליך ניסיוני שבו מטופלים עם גוטה מרכזית של הקרנית כתוצאה מדיסטרופיה של האנדותל של פוקס פשטו את הממברנה של Descemet עבור תאים היקפיים כדי לחדש את שכבת האנדותל. אנו מציגים מתודולוגיה חדשנית המדמה DSO בקרניות אנושיות דיסטרופיות ex vivo עם ריפוי מואץ המעורר על ידי eFGF1 (NM141).

מודל תרבית איברי הקרנית האנושית של הפשטת Descemet רק עם ריפוי מואץ מגורה על ידי גורם גדילה פיברובלסט מהונדס 1

הפרוטוקול הנוכחי מדגים את השלבים השונים הכרוכים בפציעת הקרנית של אפרוח עוברי באובו. ניתן לנתח את הקרנית המתחדשת או המשוחזרת במלואה עבור פוטנציאל התחדשות באמצעות טכניקות תאיות ומולקולריות שונות לאחר הליך הפציעה.

חקר התחדשות רקמות ללא צלקות בקרנית אפרוח פצועה עוברית

כאן, אנו מציעים שלוש שיטות שונות לפגיעה בסיבי החישה המעצבבים את הקרנית. שיטות אלה מקלות על חקר התחדשות האקסון בעכברים. שלוש שיטות אלה, הניתנות להתאמה למודלים אחרים של בעלי חיים, אידיאליות לחקר הפיזיולוגיה וההתחדשות של עצבוב הקרנית.

שלוש אסטרטגיות לגרימת קראטיטיס נוירוטרופית והתחדשות עצבית בקרנית מורין

חקור אינטראקציות תאיות בין תאי סטרומה קרנית לתאי עצב במטריצה חוץ-תאית טבעית. מודל תלת-ממדי זה מסייע להבנת נזק וחידוש עצבים בקרנית האנושית.

הנדסת רקמות הקרנית: במבחנה מודל של אינטראקציות סטרומה-עצב של הקרנית האנושית

גלה סרטונים נוספים