התפתחות מודל פרה האנושית של Osteoclastogenesis של דם היקפיים ומונוציטים תרבותי משותף עם שורות תאים של סרטן השד
13 בספטמבר 2017
פרוטוקול זה מתאר את התפתחות במבחנה האנושי פרה מודל של osteoclastogenesis של דם היקפיים ומונוציטים תרבותי עם שורות תאים של סרטן השד כדי לחקות את האינטראקציה תא-אוסטאוקלסט סרטן. המודל יכול לשמש כדי לקדם את ההבנה שלנו של עצם היווצרות גרורות ולשפר את אפשרויות טיפוליות.
המטרה הכוללת של מודל פרה-קליני אנושי זה במבחנה של אוסטאוקלסטוגנזה שמקורו במונוציטים בדם היקפי, או PBMCs, שגודלו עם קווי תאי סרטן השד היא לחקות אינטראקציות אוסטאוקלסטים של תאי סרטן. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום גרורות העצם לגבי ההשפעות של אינטראקציה בין תאי סרטן ותאי עצם בתוך מיקרו-סביבת העצם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמדובר במודל פרה-קליני אנושי לחלוטין.
כמו כן, שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי גרורות בעצמות. ניתן ליישם אותו גם לחקר מנגנונים פתולוגיים אחרים הקשורים לעצם, כגון אוסטאופורוזיס. אנשים חדשים בשיטה זו עשויים להיאבק בגלל השונות בין תורמים בריאים ובבחירת צפיפות תאי PBMC המתאימה.
הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שהם צריכים לראות את שלבי הבחירה והזריעה של PBMC שלנו דורשים ניסיון ידני לפני שניתן יהיה להשיג מיומנות. התחל בדילול של לפחות 20 מיליליטר של דם מלא מתורם בריא ב-EDTA ביחס של אחד לאחד ב-PBS. לאחר ערבוב יסודי, פצלו את תמיסת הדם ל-30 מיליליטר בצינורות חרוטיים של 50 מיליליטר.
הניחו בזהירות 15 מיליליטר של מדיום הפרדת לימפוציטים בתחתית כל צינור. הפרד את התאים על ידי צנטריפוגה של שיפוע צפיפות. ומשוך את התא החד-גרעיני הלבן המכיל מעילי באפי לתוך שפופרת חדשה של 15 מיליליטר.
שטפו את התאים שנקטפו פעמיים ב-20 מיליליטר PBS לכל שטיפה, ולאחר מכן ליזה של כדוריות הדם האדומות עם חמישה מיליליטר של מאגר ליזה של כדוריות דם אדומות למשך שלוש עד חמש דקות, על קרח. עצור את התגובה עם 20 מיליליטר PBS, ואסוף את תאי הדם הלבנים על ידי צנטריפוגה. השעו מחדש את הגלולה והשלימו אלפא M-E-M לספירה.
לאחר מכן, צלחו את התאים בשבע נקודות חמש כפול 10 לריכוז של חמישה PBMC לסנטימטר רבוע בכל באר של צלחת של 24 בארות לדגירתם ב-37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזי CO2. לאחר כשלוש שעות, הסר את הסופרנטנט, הפסולת, התאים הלא מחוברים והאריתרוציטים הלא ליזים מהתרבויות. ולהוסיף מדיום טרי, בתוספת MCSF.
ארבעה עשר יום לאחר הזריעה יש לשטוף את התאים פעמיים עם PBS, ולתקן אותם בארבעה אחוז פרפורמלדהיד למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. בצע צביעת מלכודת בהתאם להוראות היצרן. התאים דמויי האוסטיאוקלסט יהיו חיוביים ל-TRAP עם לפחות ארבעה גרעינים.
ספרו את התאים דמויי האוסטיאוקלסט באופן ידני מתחת למיקרוסקופ בהגדלה של פי 10. עבור התמיינות אוסטאוקלסטים המושרה על ידי תאי סרטן כאשר תאי הסרטן מגיעים למפגש של תשעים אחוז, הם מנותקים על ידי טריפסיניזציה ונזרעים על נקבוביות נקודת אפס של ארבעה מיקרומטר בריכוז של ארבעה כפול 10 לשלושה תאים לסנטימטר רבוע באלפא MEM טרי. למחרת, הניחו את התוספות הזרוע על תרביות תאים חד-גרעיניים מצופים ליום אחד באלפא M-E-M שלם, והחליפו את המדיום כל יומיים-שלושה.
לאחר מכן, 11 יום לאחר תחילת התרבות המשותפת, העבירו את התוספות לצלחת חדשה המכילה את המגיב המתאים לניתוח הרצוי במורד הזרם. תאי סרטן השד יכולים לקיים אוסטאוקלסטוגנזה, מכיוון שמספר האוסטיאוקלסטים בבארות המושרות על ידי תאים סרטניים דומה לזה המתקבל בבארות הבקרה של גורם הגדילה החיובי. עם זאת, מספר האוסטיאוקלסטים שנצפו בכל התרביות מצטמצם כאשר התאים מטופלים בתרופה אנטי-גידולית.
מעניין ששטחי הפנים של אוסטאוקלסטים בוגרים שמקורם בגורמי גדילה גדולים מאלה המושרים על ידי תאים סרטניים. השפעה זו אינה נצפית בתרביות שטופלו בתרופות נגד גידולים. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך שבע ושמונה שעות אם היא מבוצעת כראוי.
לאחר הליך זה, ניתן לבצע ניתוח נוסף במורד הזרם כניתוח ביטוי גנים, כתם מערבי, ניתוח אימונופלואורסצנטי או ELISA כדי לענות על שאלות נוספות לגבי אינטראקציות בין תאים סרטניים/תאי עצם או לגבי מנגנוני תרופות נגד גידולים. לאחר פיתוחה טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום גרורות העצם לחקור את המיקרו-סביבה של העצם, במודל פרה-קליני אנושי מלא. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לתרבית מונוציטים במשותף, לעבור התמיינות עם תאים סרטניים.
אל תשכח שעבודה עם דגימות ביולוגיות ותרופות עלולה להיות מסוכנת ביותר וכי תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות ומעילי מעבדה בעת ביצוע הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
פרוטוקול זה מתאר את הפיתוח של מודל פרה-קליני אנושי in vitro של אוסטאוקלסטוגנזה ממונוציטים מדם פריפריאלי שתרבתו עם קווי תאים של סרטן השד כדי לחקות את האינטראקציה בין תא סרטני לאוסטאוקלסט. מודל זה יכול לעזור לענות על שאלות מרכזיות בנוגע לגרורות בעצמות ולשפר אפשרויות טיפוליות.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- אוסטאוקלסטוגנזה
- גרורות בעצמות
- אינטראקציות בין תאי סרטן
רקע
- המודל משתמש במונוציטים מדם פריפריאלי (PBMCs).
- הוא שואף לשחזר את האינטראקציות בין תאי סרטן לאוסטאוקלסטים.
- מחקר זה משמעותי להבנת פתולוגיות הקשורות לעצמות.
- השונות בין תורמים בריאים עשויה להשפיע על התוצאות.
מטרת המחקר
- לחקות אינטראקציות בין תא סרטני לאוסטאוקלסט.
- לחקור את ההשפעות של אינטראקציות אלו בתוך המיקרו-סביבה של העצם.
- לספק תובנות לגבי גרורות בעצמות ותנאים קשורים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תרבות של PBMCs עם קווי תאים של סרטן השד.
- הערכת האוסטאוקלסטוגנזה.
- הערכת האינטראקציות בין תא סרטן ותא עצם.
- ניתוח השונות בצפיפות תאי PBMC.
תוצאות עיקריות
- המודל מחקה בהצלחה אינטראקציות בין תא סרטני לאוסטאוקלסט.
- התובנות שהושגו יכולות לספק מידע לאסטרטגיות טיפוליות לגרורות בעצמות.
- יישומים פוטנציאליים מתרחבים למחלות אחרות הקשורות לעצמות.
- האתגרים כוללים שונות בין תורמים ואתגרים בבחירת צפיפות תאי PBMC המתאימה.
מסקנות
- מודל פרה-קליני אנושי זה הוא בעל ערך לחקר גרורות בעצמות.
- הוא משפר את ההבנה של האינטראקציות בין תאי סרטן בסביבת המיקרו של העצם.
- מחקרים עתידיים יכולים לנצל מודל זה ליישומים רחבים יותר בפתולוגיה של העצמות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This fully human preclinical model enables mechanistic de-risking of osteoclastogenic pathways in bone metastasis by recapitulating cancer cell-osteoclast crosstalk in a physiologically relevant system. It supports target validation and assay development for anti-tumor therapeutics by providing quantitative readouts of osteoclast differentiation and function. The model enhances predictive confidence in lead identification by allowing direct observation of reciprocal interactions and downstream analysis of both cell types under drug treatment conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding tumor-induced osteoclastogenesis and pathway clarification in the bone microenvironment.
- Operational Value: Supports biological de-risking and functional target validation by modeling osteoclast differentiation from primary human monocytes under defined co-culture conditions.
- Scientific Value: Facilitates predictive confidence and portfolio triage by quantifying osteoclast formation in response to cancer cell stimuli versus growth factor controls.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows through standardized osteoclast differentiation from PBMCs using RANKL and MCSF.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility via fixed cell density seeding (7.5×10⁵ PBMC/cm²) and timed differentiation (14 days) with TRAP-based osteoclast quantification.
- Scientific Value: Enables reliable compound evaluation by testing drug effects on osteoclastogenesis in both indirect (conditioned medium) and direct co-culture formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease relevance modeling for osteoporosis and other bone conditions through adaptation of the osteoclastogenesis assay.
- Operational Value: Ensures translational continuity by using fully human cells, reducing species translation risk in preclinical-to-clinical extrapolation.
- Scientific Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by measuring changes in osteoclast number and surface area as pharmacodynamic biomarkers of drug efficacy.
Pipeline & Workflow Integration
The model fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for bone-targeted therapies and bone microenvironment modulators.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of cancer cell-derived factors in osteoclast activation and pathway clarification of RANKL-independent osteoclast induction mechanisms.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized monocyte isolation, differentiation, and co-culture with breast cancer cell lines on permeable inserts for paracrine and juxtacrine signaling studies.
- Analytics: Provides quantitative osteoclast readouts via TRAP staining, multinucleated cell counting, and morphometric analysis (surface area) to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling study of drug effects on the metastatic bone microenvironment using clinically relevant breast cancer cell lines.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for studying osteoclast modulation across multiple cancer types and bone pathologies beyond breast cancer.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Delivers predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in osteoclast-cancer cell interactions.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined PBMC isolation, seeding density, and cytokine supplementation protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of drug effects on osteoclast formation and function, reducing late-stage biological risk in bone metastasis programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by quantifying osteoclastogenic potential of compounds and guiding advancement based on bone microenvironment modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary human cell isolation, culture, and differentiation techniques, including PBMC separation and monocyte adherence.
- Depends on instrumentation for cell counting, centrifugation, microscopy (10X magnification for osteoclast counting), and incubation (37°C, 5% CO₂).
- Necessitates cross-team standardization of PBMC donor sourcing, cell density optimization (7.5×10⁵ PBMC/cm²), and co-culture timing (11 days post-cancer cell seeding) to minimize variability.
- Involves adaptation considerations when extending to non-breast cancer cell lines or alternative osteoclast stimuli beyond RANKL/MCSF.
- Includes practical limitations such as donor variability in osteoclast differentiation potential and the need for manual proficiency in PBMC seeding and co-culture setup.
