Name: הזרקת hydrodynamic אגן הכליה נגיפי ביטוי של חלבונים בתוך הכליה. (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: למדו הזרקת DNA פלסמידי לאגן הכליה בעכברים בוגרים לביטוי חלבון ספציפי בכליה. שיטה זו מאפשרת חקר ממוקד של השפעות חלבונים על תפקוד הכליה במחקרי נפרולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרס פיתוח הקריירה של המחלקה ותיקי לענייני [BX002797] תמך L.E.W. מכוני הבריאות הלאומיים [R01-DK095867] ונתמך American Heart Association [15GRNT25700209] ג'יי מכוני הבריאות הלאומיים [DK093660], המחלקה לענייני חיילים משוחררים [BX002190] ואנדרבילט לחקר מחלת כליות תמיכה, M.H.W. חומר זה הוא התוצאה של עבודה נתמכת עם משאבים ושימוש במתקני במערכת הבריאות VA עמק טנסי.

<ol><li>Liu, F., Song, Y., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamics-based+transfection+in+animals+by+systemic+administration+of+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA.</a> Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).</li>
<li>Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+levels+of+foreign+gene+expression+in+hepatocytes+after+tail+vein+injections+of+naked+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA.</a> Human Gene Therapy. 10, 1735-1737 (1999).</li>
<li>Fumoto, S., Nishimura, K., Nishida, K., Kawakami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Imaging+of+the+Intracellular+Fate+of+Plasmid+DNA+and+Transgene+Expression%3A+ZsGreen1+and+Tissue+Clearing+Method+CUBIC+Are+an+Optimal+Combination+for+Multicolor+Deep+Imaging+in+Murine+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Imaging of the Intracellular Fate of Plasmid DNA and Transgene Expression: ZsGreen1 and Tissue Clearing Method CUBIC Are an Optimal Combination for Multicolor Deep Imaging in Murine Tissues.</a> PLoS One. 11 (1), e0148233(2016).</li>
<li>Yoshino, H., Hashizume, K., Kobayashi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naked+plasmid+DNA+transfer+to+the+porcine+liver+using+rapid+injection+with+large+volume%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Naked plasmid DNA transfer to the porcine liver using rapid injection with large volume.</a> Gene Ther. 13 (24), 1696-1702 (2006).</li>
<li>Kamimura, K., Suda, T., Xu, W., Zhang, G., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-guided%2C+lobe-specific+hydrodynamic+gene+delivery+to+swine+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Image-guided, lobe-specific hydrodynamic gene delivery to swine liver.</a> Mol Ther. 17 (3), 491-499 (2009).</li>
<li>Kamimura, K., Zhang, G., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-guided%2Cintravascular+hydrodynamic+gene+delivery+to+skeletal+muscle+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Image-guided,intravascular hydrodynamic gene delivery to skeletal muscle in pigs.</a> Mol Ther. 18 (1), 93-100 (2010).</li>
<li>Suda, T., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+gene+delivery%3A+its+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Ther%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications.</a> Mol.Ther. 15 (12), 2063-2069 (2007).</li>
<li>Alino, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naked+DNA+delivery+to+whole+pig+cardiac+tissue+by+coronary+sinus+retrograde+injection+employing+non-invasive+catheterization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Naked DNA delivery to whole pig cardiac tissue by coronary sinus retrograde injection employing non-invasive catheterization.</a> J Gene Med. 12 (11), 920-926 (2010).</li>
<li>Suda, T., Gao, X., Stolz, D. B., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+impact+of+hydrodynamic+injection+on+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Structural impact of hydrodynamic injection on mouse liver.</a> Gene Ther. 14 (2), 129-137 (2007).</li>
<li>Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia-reperfusion+model+of+acute+kidney+injury+and+post+injury+fibrosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li>
<li>Woodard, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney-specific+transposon-mediated+gene+transfer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Kidney-specific transposon-mediated gene transfer in vivo.</a> Sci Rep. 7, 44904(2017).</li>
<li>Liang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+glutathione+S-transferase+A4+accelerates+obstruction-induced+tubule+damage+and+renal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Loss of glutathione S-transferase A4 accelerates obstruction-induced tubule damage and renal fibrosis.</a> Journal of Pathology. 228 (4), 448-458 (2012).</li>
<li>Liang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+role+of+insulin-like+growth+factor-1+receptor+in+endothelial+cells+against+unilateral+ureteral+obstruction-induced+renal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Protective role of insulin-like growth factor-1 receptor in endothelial cells against unilateral ureteral obstruction-induced renal fibrosis.</a> Am J Pathol. 185 (5), 1234-1250 (2015).</li>
<li>Corridon, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+facilitate+and+monitor+expression+of+exogenous+genes+in+the+rat+kidney+using+plasmid+and+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">A method to facilitate and monitor expression of exogenous genes in the rat kidney using plasmid and viral vectors.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 304 (9), F1217-F1229 (2013).</li>
<li>Wallace, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+kidney+volume+in+mice+with+polycystic+kidney+disease+by+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Tracking kidney volume in mice with polycystic kidney disease by magnetic resonance imaging.</a> Kidney Int. 73 (6), 778-781 (2008).</li>
<li>Woodard, L. E., Wilson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac-ing+models+and+new+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">piggyBac-ing models and new therapeutic strategies.</a> Trends Biotechnol. 33 (9), 525-533 (2015).</li>
<li>Yeikilis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamics+based+transfection+in+normal+and+fibrotic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamics based transfection in normal and fibrotic rats.</a> World J Gastroenterol. 12 (38), 6149-6155 (2006).</li>
<li>Thalhofer, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+transgenic+Leishmania+parasites+in+a+live+host%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host.</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li>
<li>Wooddell, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+damage+after+delivery+of+naked+plasmid+DNA+into+skeletal+muscles+is+batch+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Muscle damage after delivery of naked plasmid DNA into skeletal muscles is batch dependent.</a> Hum Gene Ther. 22 (2), 225-235 (2011).</li>
<li>Crespo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+liver+gene+transfer+mechanism+involves+transient+sinusoidal+blood+stasis+and+massive+hepatocyte+endocytic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic liver gene transfer mechanism involves transient sinusoidal blood stasis and massive hepatocyte endocytic vesicles.</a> Gene Ther. 12 (11), 927-935 (2005).</li>
<li>Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rAAV9+combined+with+renal+vein+injection+is+optimal+for+kidney-targeted+gene+delivery%3A+conclusion+of+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: conclusion of a comparative study.</a> Gene Ther. 21 (6), 618-628 (2014).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף ולהצהיר אין ניגוד אינטרסים.

ב פרוטוקול זה מתוארת שיטה חזקה להשגת ביטוי גנים לשחזור באופן ספציפי בתוך הכליה. בידי מנתח מנוסה בינוני מצאנו האחוז של עכברים transfected באמצעות הטכניקה הזו להיות בטווח של 50-100%, בהתאם לגיל העכבר ואת הרגישות של המדידה של transgene. הרמה של ביטוי גנים לוציפראז היה מעל רקע במשך מספר חודשים בעכברים שקיבלו piggyBac טרנספוזונים ומתוחזק לחלוטין למשך מספר שבועות בעכברים immunocompromised קבלת טרנספוזונים אותו11. בעוד הרבה תאים מוכתם במאור פנים transgene באזור ההזרקה, היעילות הכוללת של תרביות ת...

טכניקת ההזרקה של וריד הזנב hydrodynamic הפך נפוץ דרך כדי להשיג רמות גבוהות של ביטוי גנים העכבר הכבד1,2. הכליות הן גם transfected באמצעות הטכניקה הזו ברמה יותר נמוכה, כ 100-fold פחות3. הזרקת hydrodynamic אגן הכליה המתוארים כאן מספק דרך פשוטה כדי לשלוט יחודיות של איברים ביטוי באמצעים פיזיים, באמצעות אותם עקרונות hydrodynamic שהוקמו בעבר כבד4,5 , שרירים6ו-7,8אחרים איברים. שיטה זו transfects תאים בעלי חיים ויוו באמצעות לחץ ותוקנו מהירות כדי לאלץ את ה-DNA המכיל נוזל לתוך התאים, בו זמנית גרימת נזק לאיבר זה במהירות9. באמצעות טכניקות ניתוחיות ומבוססת להמחיש את הכליה דרך החתך האגף10 יחד עם זריקה אחת על ידי מזרק אינסולין, מצאנו תקנים מוצלחת של סוגים שונים של תאי הכליה, בעיקר interstitial fibroblasts, בקוריאנית, צינור איסוף11. דיסקציה של עכברים אלה הראו כי איברים אחרים הם לא transfected ברמה גבוהה מספיק כדי להמחיש מאת לוציפראז הדמיה טכניקות11. מאז הטכניקה היא נגיפי, השימוש פלסמיד DNA עבור תרביות תאים מאפשרת הכנה קלה ומהירה של ריאגנטים הנדרש להזרקה.
השתמשנו זריקות hydrodynamic מקומי להביע גלוטתיון נוגד חמצון S-טרנספראז A4 הקולטן 1 פקטורי גדילה דמויי אינסולין, את אריתרופויאטין ההורמון בכליה, כולם בעלי השפעות ביולוגיות הצפוי11, 12 , 13. הערכה מפורטת של התוואי של המינהל, נפח הזרקה, מינון ה-DNA, יזם הבחירה היה שבוצעו11. בנוסף, שתי piggyBac transposon מערכת ו/או ציקלופוספמיד הטיפול לדכא את התגובה החיסונית transgene כבר הראו לשפר לטווח ארוך ג'ין ביטוי תוצאות11. חוקרים אחרים יש להשתמש בגישה וריד הכליה לעכבר עם הצלחה, השגת יעילות גבוהה תקנים עבור פרקי זמן של יותר מ חודש14. עם זאת, תיקון גנטי של פנוטיפים מחקה מחלות אנושיות בדרך כלל מבוצעות בעכברים לראשונה כמושג הוכחה-של-מאחר ביותר בתרבית של דגמים גנטיים הם מודלים העכבר. אנו לעומת הזרקה וריד הכליה אל אגן הכליה הזרקה, נמצא כי הזרקה לתוך האגן הכליה סופריור לוריד הכליה על ביטוי גנים (כ כוחנו גבוה) והישרדות11. אגן הכליה הוא מסלול אידיאלי של הערך לתוך הכליה כי זה גמיש מספיק לסבול תנודות ייצור השתן, והוא לעיתים קרובות מסוגל לשמור המבנית שלו גם כאשר התרחבו במהלך hydronephrosis. בנוסף, הזרקה לתוך האגן הכליה איפשרה גישה הכליה ללא פירסינג הקפסולה כליות, המאפשר את הנוזלים מוזרק בעליל יישמרו על ידי הכליות טוב יותר intraparenchymal הזרקת. איברים אחרים העכבר אין מסלול של ערך אחר מאשר להערכת, אבל המרחב השתן של הכליה הוא אתר אידיאלי הזרקה. בנוסף, זריקה לווריד כליות כתוצאה דליפה של דם לתוך חלל הבטן. עוצמת כליות מוחלטת פראי-סוג העכבר הכליות הוערך על ידי תהודה מגנטית יהיה כ 0.2 ס מ3, אז הנפח של כליה אחת שווה בקירוב כמות הנוזלים מוזרק על ידי רופא אגן הכליה hydrodynamic הזרקה (100 µL)15. במסמך זה, עשינו זמין לכל הניואנסים מפורט של פרוטוקול הזרקת hydrodynamic אגן הכליה להשגת תקנים לשחזור של הכליה.

<table><tbody><tr><td>AnaSed Xylazine</td><td>Patterson וטרינרי</td><td>07-808-1947</td><td>הרדמה - חומר לא מבוקר</td></tr><tr><td>BD מזרק אינסולין 0.5 מ"ל 29 גרם 1/2 אינץ'</td><td>309306 בריאות קרדינל</td><td></td><td>מזרקים נדרשים</td></tr><tr><td>בופרנקס</td><td>רוקח/וטרינר</td><td></td><td>משככי כאבים - חומר מבוקר</td></tr><tr><td>Dynarex וילון מגבת חד פעמית</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>19-310-671</td><td>הנח מעל כרית חום</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>השתמש רק ב-DNA פלסמיד נטול אנדוטוקסין</td></tr><tr><td>Endosafe Jer-Clot LAL בקרה חיובית מהירה</td><td>צ'ארלס ריבר</td><td>PC200</td><td>בקרה חיובית לבדיקת אנדוטוקסין Endosafe</td></tr><tr><td>Jer-Clot LAL בקבוקון בדיקה יחיד מהיר</td><td>צ'ארלס ריבר</td><td>R13500</td><td>בדיקת אנדוטוקסין</td></tr><tr><td>מספריים מיקרו חיתוך עדין במיוחד</td><td>Roboz כירורגי מכשיר</td><td>RS-5882</td><td>כלי כירורגי</td></tr><tr><td>Fisherbrand נרתיק עיקור איטום מיידי - 9 אינץ'</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>01-812-51</td><td>לחיטוי כלים כירורגיים</td></tr><tr><td>Gaymar משאבת חום</td><td>פרגון רפואי</td><td>TP-700</td><td>משאבת חום במחזור מים</td></tr><tr><td>נביטה 500</td><td>מכשיר כירורגי</td><td>Roboz DS-401</td><td>לשימוש חוזר בכלים כירורגיים במהלך הניתוח</td></tr><tr><td>Graefe </td><td>מלקחיים Roboz מכשיר כירורגי</td><td>RS-5136</td><td>כלי כירורגי</td></tr><tr><td>מלקחיים רקמות Graefe</td><td>Roboz מכשיר כירורגי</td><td>RS-5153</td><td>כלי כירורגי</td></tr><tr><td>מחזיק מחט הלסי,</td><td>מכשיר כירורגי Roboz</td> באורך 5 אינץ' <td>RS-7841</td><td>כלי כירורגי</td></tr><tr><td>רפידות חום - 15 אינץ' x 21 אינץ' - צריך לפחות 3</td><td>Paragon Medical</td><td>TP22G</td><td>לשימוש עם משאבת</td></tr> <tr><td>חום GaymarIsoFlo (Isoflurane, USP)</td><td>Abbott Animal Health</td><td>5260-04-05</td><td>להדמיה והמתת חסד</td></tr><tr><td>Isotec Isoflurane Delivery System Vaporizor</td><td>Smiths Medical</td><td>VCT3K2</td><td>להדמיה והמתת חסד</td></tr><tr><td></td><td>קטמין רוקח/וטרינר</td><td></td><td>הרדמה - חומר מבוקר</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>34120</td><td>רקמות מעבדה</td></tr><tr><td>תוכנת תמונה חיה</td><td>קליפר מדעי</td><td></td> החיים <td>להדמיית בעלי חיים</td></tr><tr><td>חיים לוציפרין</td><td>פרקין אלמר</td><td>122796</td><td>להדמיית בעלי חיים</td></tr><tr><td>חיים Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000-US-CAN</td><td>ספקטרופוטומטר למדידת DNA</td></tr><tr><td>Prevantics Swabs</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23-100-110</td><td>לניתוחי עור הכנה</td></tr><tr><td>פרולן 5-0 תפרים Taper 30 "</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC0256891</td><td>תפרים לא נספגים לעור</td></tr><tr><td>Puralube מותג משחה אופטלמית</td><td>פטרסון וטרינרי</td><td>07-888-2572</td><td>כדי לשמור על לחות העיניים במהלך הניתוח</td></tr><tr><td>Trans IT - פתרון אספקה הידרודינמי QR</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR-5240</td><td>מאגר אספקה הידרודינמי לדילול DNA</td></tr><tr><td>Vicryl 5-0 תפרים J303H</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9816710</td><td>תפרים נספגים לשכבת השריר</td></tr><tr><td>Wahl Mini Arco Clipper</td><td>Med-Vet International</td><td>8787-1550</td><td>מכונת גילוח להכנת העור</td></tr><tr><td>Xenogen IVIS 200</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td>להדמיית בעלי חיים</td></tr></tbody></table> חיים

הזרקת hydrodynamic אגן הכליה נגיפי ביטוי של חלבונים בתוך הכליה.

Hydrodynamic Renal Pelvis Injection for Non-viral Expression of Proteins in the Kidney

הזרקת hydrodynamic יוצר סביבה מקומיים, בלחץ גבוה כדי transfect רקמות שונות עם דנ א פלסמיד וחומרים אחרים. הזרקת וריד הזנב hydrodynamic, לדוגמה, היא שיטה ומבוססת שבאמצעותו יכול להיות transfected הכבד. כתב יד זה מתאר יישום של עקרונות hydrodynamic על ידי הזרקה של הכליה העכבר ישירות עם פלסמיד הדנ א על ביטוי גנים ספציפיים כליות. עכברים הם מרדימים, הכליה נחשף על ידי חתך האגף ולאחריה זריקה מהירה של פלסמיד פתרון ה-DNA המכיל ישירות לתוך אגן הכליה. המחט הוא שמר על המקום לעשר שניות, מקום החתך מאוחה. למחרת, לחיות הדמיה בעלי חיים, תספיג או אימונוהיסטוכימיה עשוי לשמש assay ביטוי גנים או אחרים מבחני מתאים את transgene של בחירה משמשים לגילוי של החלבון עניין. שיטות שפורסמו להאריך ביטוי גנים כוללים אינטגרציה transgene בתיווך transposon וטיפול ציקלופוספמיד כדי לעכב את התגובה החיסונית כדי transgene.

טכניקת הניתוח, הזרקת פשוטים לביצוע נשכחו, הדורשים לא הציוד העיקרי או בחומרים יקרים. אם חדש האגף-חתך ניתוח בכליה, יום הדרכה אחד על מספר עכברים מתוכננת המתת חסד אסור שבו העכברים אינם התאושש הניתוח הבא כי הניסיון הראשון-ניתוח זה עשוי לארוך זמן רב יותר מהרגיל. לחלופין, חוקרים מוכר עם טכניקות דומות עלול למצוא את זה די פשוט. בזהירות בצע האיור באיור 1 בהוראות ציורית באיור2. למיקום כראוי את החתך, המנתח ניתן להשתמש האצבעות כדי ללחוץ על הע...

פרוטוקול זה מתאר שיטה להחדיר פלסמיד DNA לתוך הכליה העכבר באמצעות אגן הכליה כדי לייצר transgene ביטוי במיוחד בתוך הכליה.

Hydrodynamic injection creates a local, high-pressure environment to transfect various tissues with plasmid DNA and other substances. Hydrodynamic tail ...

המטרה הכוללת של הליך כירורגי זה היא לייצר ביטוי חלבון מ-DNA פלסמיד בכליות העכבר הבוגר. שיטה זו היא כלי חדש לענות על שאלות מפתח בנפרולוגיה, כגון כיצד ביטוי של חלבון מעניין משפיע על הכליה הבוגרת. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מייצרת ביטוי חלבון בצורה הניתנת לשחזור, במיוחד בכליות, בניגוד לשיטות אחרות שעשויות לייצר ביטוי גנים גם באיברים אחרים.הדגמה ויזואלית של שיטה זו היא קריטית שכן הזרקת אגן הכליה דורשת חשיפה זהירה וחייבת להיעשות במהירות על מנת שה-DNA של הפלזמה ייכנס לתאים. התחל בהשעיית DNA פלסמיד במאגר האספקה ההידרודינמי. על כרית חום במחזור מים מכוסה בכרית כחולה, הניחו את העכבר.בעזרת מכונת גילוח המיועדת לטיפוח חיות מחמד, גלח את הצד השמאלי של גב העכבר מהכתף ועד לגב ומהאגף לעמוד השדרה. נקו שיער פזור ופסולת ומרחו משחה וטרינרית בשתי העיניים כדי למנוע ייבוש בקרנית. כעת, הכינו 100 מיקרוליטר המכילים 10 עד 50 מיקרוגרם DNA פלסמיד מדולל במזרק נפרד לכל עכבר מורדם, והבטיחו שאין בועות אוויר.יש לחבר את המחט לצמיתות ללא בטיחות. לפני ביצוע הניתוח יש לרוקן כלי ניתוח סטריליים מבלי לגעת במגש סטרילי המונח על כרית החום. כעת, הרם את העכבר ושרוך אותו בשדה ראייה מואר.מהאריזה, הסר 3.15% כלורהקסידין גלוקונאט ו-70% איזופרופיל אלכוהול ספוגיות חיטוי לעור והניח ליד החיה. ללבוש כפפות כירורגיות סטריליות והחל ממקום החתך, ספוג את החיה עם ספוגית אלכוהול כלורהקסידין חדשה, שלוש פעמים בתנועה סיבובית. כעת, אתר את אתר החתך.צובטים את העור בפינצטה ובעזרת מספריים חותכים את שכבת העור כסנטימטר אחד מעמוד השדרה, מתחת לכלוב הצלעות. בצע עוד סנטימטר אחד חתוך למטה בשכבת השריר. אתרו את הכליה ומבלי לגעת בה, חשפו אותה בעדינות מחלל הבטן על ידי הפעלת לחץ עדין ויציב על הבטן בעזרת האצבעות.חשיפת הכליה היא לפעמים קשה. הפעל לחץ עדין על הבטן ועמוד השדרה כדי למנוע פגיעה בטחול. אם יוצאים איברים אחרים מלבד הכליה, החזירו אותם בעדינות לחלל הגוף באמצעות מלקחיים סגורים במידת הצורך.לאחר מכן, הפרד בעדינות את הכליה מהשומן שמסביב בדיוק מספיק כדי לדמיין את אגן הכליה, שניתן לראות כנקודה לבנה קטנה. לאחר הדמיית אגן הכליה, השתמש במלקחיים סגורים כדי לדחוף כלפי מטה את הצד הימני של הכליה כך שאגן הכליה יישאר בטווח ראייה. לאחר מכן, אחוז במזרק האינסולין הטעון ביד ימין על ידי החזקתו במקביל למשטח העבודה והכנס את המחט בזהירות לאגן הכליה.לאחר החדרת המחט, הזריק את התמיסה במהירות, תוך שלוש שניות. הניחו למחט להישאר במקומה למשך כ-10 שניות כדי למנוע זרימה חוזרת של התמיסה. לאחר מכן, הסר את המחט לאט ובזהירות והחזיר את האיבר לחלל הבטן על ידי מתיחת מקום החתך בעדינות באמצעות מלקחיים סגורים.כעת, תפר את שכבת השריר עם תפרים נספגים של חמישה או והנח שניים עד ארבעה קשרים עצמאיים. באופן דומה, תפר את שכבת העור עם תפרי ניילון 5-O או 6-O שאינם נספגים והנח שניים עד ארבעה קשרים עצמאיים. כדי להעריך את יעילות הטרנספקציה, הכניסו 10 מיקרוגרם של לוציפראז המבטא פלסמיד ל-DNA המדולל להזרקה לביצוע הדמיה של בעלי חיים חיים, למחרת.הכניסו את כלוב העכברים הראשון לתא ואטמו אותו וסגרו אותו. לאחר ההרדמה, הזריק לכל עכבר תוך הצפק 100 מיקרוליטר לוציפרין מופשר ורשום את השעה. בחר את מזהה המשתמש הנכון ומשורת התפריטים העליונה, לחץ על רכישה ובחר שמירה אוטומטית של שניים מהתפריט הנפתח.אתחל את המערכת על ידי לחיצה על אתחול. המתן לסיום האתחול ושנה את שדה הראייה ל-D, לתמונה של חמישה עכברים. ודא שבעלי החיים ממוקמים בסדר הרצוי ושגבם פונה למצלמה כדי לדמיין את הכליה.לאחר מכן, לחץ על רכש חמש דקות לאחר ההזרקה כדי לצלם את התמונה. לאחר הרכישה, הסר את העכברים ממכונת ההדמיה. כבה את הגז.נקה את החדר, מסרקי האף ואת שלב ההדמיה. כדי לנתח את הנתונים, לאחר לחיצה על כלי החזר ROI, לחץ על סמל העיגול ובחר אחד בתפריט הנפתח כדי למקם החזר ROI חדש בתמונה כפי שמצוין על ידי אליפסה אדומה עם ארבעה ריבועים סביבו. כדי להתאים את גודל ההחזר על ההשקעה, מקם את הסמן מעל ריבוע אדום וגרור כדי להקיף את האזור הסגול המכסה את הכליה המוזרקת.כעת, לחץ לחיצה ימנית על החזר ROI זה ובחר החזר ROI כפול כדי לשכפל את החזר ה-ROI בחלון הנוכחי ולהעביר אותו לעכבר הבא. לאחר הצבת כל ההחזר על ההשקעה מהתפריט ישירות מעל התמונה, שנה את היחידות מספירות לפוטונים זוהרים. לבסוף, צור גיליון אלקטרוני של המדידות על ידי ייצוא נתוני ה-ROI מחיך הכלי על ידי לחיצה על כלי ROI ולאחר מכן על סמל סרגל העיפרון.מוצג ביטוי הגנים הספציפי של הכליה של פלסמידים מדווחים. לכל העכברים הוזרקו פלסמיד pTet המבטא לוציפראז גחליליות משופר, בעוד שלעכברים 2, 3 ו-5 הוזרקו גם פלסמיד pEF1-alpha-tdtomato המבטא את החלבון הפלואורסצנטי האדום, tdtomato. בדרך כלל, הקרינה בעכברים צעירים תהיה בסדר גודל אחד.ייתכן שחלק מהעכברים אינם מראים רמות ניכרות של קרינה, בין אם בגלל יעילות טרנספקציה נמוכה או היעדר הטרנסגן עצמו. הזרקת חיץ הידרודינמי משמשת כבקרה. לא נצפה ביטוי פלסמיד כאשר ניתן רק את המאגר ההידרודינמי.בימים הראשונים לאחר הטרנספקציה, סביר להניח שיהיה מספר נמוך של תאים שנצבעו חיוביים לטרנסגן. תאים אלה נראים ממוקמים בכתמים באזורים שנוזל ההזרקה חדר אליהם. בתמונה זו, האותות הירוקים הם מהצינורות הפרוקסימליים, המוכתמים עבור לוטוס טטרגונולבוס אגלוטינין והאותות האדומים הם מהתאים הטרנספטנטיים המבטאים את הגן המדווח tdtomato .לאחר השליטה, ניתן לבצע את הניתוח תוך פחות מ-10 דקות, עם זאת, להרדמה לוקח זמן לגרום ולהתאושש ממנה. לכן, שני אנשי צוות מיומנים, שעובדים בשיתוף פעולה הדוק, יוכלו לעשות רק כ-10 עד 15 עכברים ביום. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש בעכברים צעירים.הטכניקה ההידרודינמית אינה פועלת באותה מידה באיברים פיברוטיים ישנים יותר. לאחר הליך זה ניתן לבצע שיטות נוספות, כגון ניתוח דגימות דם, שתן ורקמות כליה, על מנת להעריך את ביטוי הגן המעניין. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להזריק לאגן הכליה DNA פלסמיד כדי להשיג ביטוי חלבון ספציפי לכליות.

hydrodynamic-renal-pelvis-injection-for-non-viral-expression-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מקור: גופטה, ק. ואחרים. הזרקה תוך-כלייתית של אשריכיה קולי במודל חולדה של דלקת פיאלונפריטיס.  J. Vis. Exp. (2017).הסרטון הזה מדגים את ההזרקה התוך-כלייתית של E. coli לאגן הכלייתי של עכברוש מונשם, כדי לגרום לזיהום כליה מקומי, בדומה לפילונפריטיס חריפה. הוא מדגיש שלבים כירורגיים מרכזיים וטכניקות אספטיות הנדרשות להקמת מודל זיהום ב-vivo שניתן לשחזור לניתוח במסגרת הדרך.

הזרקה תוך-כלייתית של E. coli לתוך האגן הכלייתי של חולדה

Source: Van Lidth de Jeude, et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the process of producing viral particles through transfection of embryonic kidney cells with plasmid–polyethylenimine complexes, which leads to viral genome expression, particle assembly, and virus collection in the medium.

Polyethylenimine-Mediated Transfection of Embryonic Kidney Cells for Recombinant Virus Production

בסרטון זה אנו מציגים את הפרוטוקול להזרקה הידרודינמית של פלסמידים לאגן הכליה של הכליה של הכליה של העכבר לצורך העברת חומצות גרעין. טכניקה זו מאפשרת העברה ספציפית של פלסמידים על ידי ניצול עקרון הלחץ ההידרוסטטי הגבוה, אשר דוחף בכוח את הפלסמידים לאתר הספציפי מבלי לגרום לפגיעה ברקמות.

הזרקת אגן כליות הידרודינמית: טכניקה להעברת DNA ישירות לתאי כליות של מודל מורין

בסרטון זה אנו מדגימים מתן תרופות תוך-כלייתיות בחולדות דרך עורק הכליה. שיטה זו מועילה בשיפור מיקוד התרופות, עוצמת התרופות ומזעור רעילות מערכתית.

אספקת תרופות תוך כלייתית בחולדות: שיטה להעברת תרופות טיפוליות בכליה של חולדות באמצעות הזרקה תוך עורקית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש במפות גורל ועוקבי שושלת כדי למקד זריקות לבלסטומרים בודדים המולידים כליה של עוברי Xenopus laevis.

טכניקה לכוון Microinjection אל פיתוח<em&gt; Xenopus</em&gt; כליה

פציעות כליות הנגרמות nephrotoxins, הכולל תרופות החל אנטיביוטיקה כימותרפיות, שיכולות לגרום להפרעות מורכבות בפתוגנזה ששרידיו מובנים. פרוטוקול זה מדגים כיצד דג הזברה יכול לשמש בסיס לפיתוח מודלים למחלות של תנאים אלה, אשר יכול להיות מיושם על זיהוי של צעדים renoprotective.

Nephrotoxin Microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה

בנוסף, לשימוש בתרופות עבור התאוששות של תפקוד כליות מחייב שליטה של ​​הלוקליזציה וההפצה של המתחם הטיפולי. כאן אנו מתארים בפרוטרוט טכניקה פשוטה למסירת intrarenal של סמים בחולדות. הליך זה עשוי להתבצע בקלות ללא תמותת שחזור גבוה.

משלוח intravascular של מוצרים ביולוגיים לכליה עכברוש

כתב יד זה מתאר מודל כירורגי של חולדות של פיילונפריטיס באמצעות זיהום תוך-כלייתי ישיר על ידי Escherichia coli לאגן הכליה. ניתן להשתמש בהליך הניסוי כדי לחקור את הפתוגנזה של פיילונפריטיס כמו גם את הדלקת והפיברוזיס הנלווים.

הזרקת Intranenal של Escherichia coli במודל עכברוש של Pyelonephritis

כתב יד זה מתאר שיטה להעברה ממוקדת לכליה אחת באמצעות קטטר שהונח בבטן הבטן האינפרנלית בעכבר.

משלוח תרופות ישיר לכליות דרך עורק הכליה

כאן, אנו מספקים חיקויי miRNA אקסוגניים מסונתזים באופן מלאכותי לכליה באמצעות הזרקת וריד זנב של וקטור לא ויראלי וננו-חלקיקי פוליאתילנימין במספר מודלים של עכברים למחלות כליות. זה הוביל לביטוי יתר משמעותי של miRNA המטרה בכליה, וכתוצאה מכך עיכוב התקדמות של מחלת כליות במספר מודלים של עכברים.

העברה של miRNA אקסוגני מסונתז באופן מלאכותי לחקות לכליה באמצעות ננו-חלקיקי פוליאתילנימין במספר מודלים של עכברים למחלות כליות

דוח זה מפרט את שיטת ההזרקה המקומית של וקטורי AAV דרך אגן הכליה להעברת גנים יעילה ובטוחה לכליות העכבר.

העברת גנים יעילה ובטוחה לכליות העכבר באמצעות הזרקת אגן כליה רטרוגרדית איטית של וקטורים של וירוסים הקשורים לאדנו.

למדו הזרקת DNA פלסמידי לאגן הכליה בעכברים בוגרים לביטוי חלבון ספציפי בכליה. שיטה זו מאפשרת חקר ממוקד של השפעות חלבונים על תפקוד הכליה במחקרי נפרולוגיה.

הזרקת hydrodynamic אגן הכליה נגיפי ביטוי של חלבונים בתוך הכליה.

גלה סרטונים נוספים