התקן הדמיה חיה לטווח ארוך עבור משופרת מניפולציה ניסויית של הזחלים דג זברה

המטרה הכוללת של ייצור מכשיר הדמיה זה היא ליצור פלטפורמה הניתנת לשינוי לניתוח מיקרוסקופי של ריפוי פצעים בזחלי דג זברה חיים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ריפוי פצעים, כמו מה התרומה של ארגון מחדש של סיבי קולגן ותגובות תאיות לצמיחה מחדש של רקמות לאחר פציעה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שפציעה והדמיה מתרחשים בתוך מכשיר בודד, בעוד שצמיחה מחודשת של הזנב אינה מונעת על ידי המכשיר.

בנוסף, ניתן לשנות את התאים הפונקציונליים המרובים של ה-zWEDGI באופן עצמאי כדי להתאים לשלבי זחל שונים ומערך של פרוטוקולים ניסיוניים. כדי להתחיל, עצב את רכיב ה-PDMS של המכשיר עם הגיאומטריות והתכונות הרצויות בהתאם לפרוטוקול הטקסט. לאחר הדפסת התבניות במדפסת תלת מימד פוטופולימרית, יש לנקות את התבניות באמצעות מברשת עדינה, אלכוהול מפוגל בבקבוק ספריי ואוויר דחוס.

שפשפו בעדינות והסירו את השרף הלא נרפא, במיוחד כל חומר מאזורי המיקרו-ערוצים. לאחר מכן, לאחר ריפוי התבניות במנגנון UV לאחר ריפוי למשך 60 דקות מכל צד, מכיוון ששרף לא נרפא רעיל לזחלי דג הזברה. בעזרת נייר זכוכית 200 חצץ, חול את צד החלל של התבנית על משטח ישר עד שכל משטחי התקרה נמצאים במגע עם נייר הזכוכית.

עם נייר זכוכית של 400 ו-600 חצץ, יש לשייף קלות בהדרגה כדי לייצר משטחים חלקים ושטוחים על פני כל חזיתות הגיאומטריה של התבנית. לאחר מכן, השתמש במחוון חיוג כדי למדוד את עומק החלל לאחר השיוף כדי לוודא שהוא קרוב לעומק העיצוב. נקו את התבניות ואת דיסקי כיסוי הזכוכית על ידי הנחתם בחומר ניקוי קולי מלא במים למשך 30 דקות או על ידי שטיפתם מתחת למים זורמים.

השתמש באלכוהול איזופרופיל ובאוויר דחוס מסונן כדי לנקות ולייבש את התבניות והכיסויים. הכן ספסל נקי כמקום לייצור המכשירים כדי למזער זיהום מפסולת הנישאת באוויר. הכינו את ה-PDMS על ידי מזיגת בסיס ומפעיל ביחס של 5:1 לכוס פלסטיק.

בעזרת מקל מלאכה מעץ מערבבים היטב במשך שתי דקות, תוך ערבוב הג'ל על עצמו כמו לישת לחם. מסירים את התערובת במייבש ואקום למשך 25 עד 45 דקות עד שכל הבועות נעלמות. לאחר מכן, בעזרת מזרק של 10 מיליליטר, מלאו את החלל של כל תבנית מודפסת בתלת מימד בכ-0.75 מיליליטר PDMS עד שהתבנית עולה מעט על גדותיה במניסקוס.

הסירו את התבניות הממולאות למשך 45 דקות כדי להסיר בועות נוספות שאולי נוצרו בעת המילוי. החל דיסק כיסוי זכוכית על גבי התבנית המלאה ב-PDMS, לחץ על הדיסק כלפי מטה בזווית כדי למנוע לכידת בועות. אפשר להוציא PDMS עודפים בעת החלת מכסה דיסק הזכוכית.

לאחר מכן, השתמש במחגר קטן clamp כדי להחזיק את דיסק הכיסוי בחוזקה לתבנית. לצורך יעילות, ניתן להשתמש במכשיר רב מהדק. רפאו את מכשיר ה-PDMS ואת התבניות המהודקות ב-100 מעלות צלזיוס בתנור למשך 90 דקות לפחות.

לאחר מכן, הוציאו את התבניות מהתנור, והניחו להן להתקרר עד שניתן יהיה לטפל בהן בקלות. מהדקים את התבנית המכילה את מכשיר ה-PDMS הנרפא בסגן ספסל כך שהגיאומטריות של התבנית פונות כלפי מעלה, במקביל לספסל תחנת העבודה. התחל להסיר את התקן ה-PDMS באמצעות פינצטה שטוחה כדי לשחרר את ברז המשיכה PDMS מהתבנית.

לאחר מכן, עבדו סביב היקף התבנית בעזרת הפינצטה. יש לרפא את ה-PDMS לפחות 90 דקות ב-100 מעלות צלזיוס, אחרת הוא יישאר דביק ויידבק לתבנית. אינדיקציה טובה לכך שריפאת את המכשיר מספיק זמן היא שלמעשה תראה בועת אוויר בממשק בין התבנית למכשיר ה-PDMS, מה שמצביע על כך שהוא יוסר בקלות.

השתמש באוויר מסונן, דחוס ופינצטה כדי להרים בעדינות את המכשיר מהתבנית על ידי אחיזה בלשונית המשיכה ונשיפת אוויר מתחת למכשיר. לאחר מכן, הנח את מכשיר ה-PDMS הפוך על החלק הפנימי של המכסה של צלחת תחתית זכוכית כך שטריזי מנהרת הריסון נוגעים בפלסטיק. לאחר מכן, הנח את מכסה הכלים עם zWEDGI הפוך ואת צלחת הזכוכית התחתונה המתאימה לתוך מנקה פלזמה כשהזכוכית הפנימית פונה כלפי מעלה.

פנה את תא ניקוי הפלזמה עד שהלחץ מגיע ל -500 מיליטור. הגדר את תדר הרדיו, או עוצמת ה-RF, לגבוה וחשוף את המכשיר והצלחת לתדר RF למשך כשתי דקות. לאחר מכן, הורידו לאט את לחץ האוויר בתא והחזירו את המכשיר ואת המנה למכסה מנוע נקי.

הסר את מכשיר ה-PDMS ממכסה הכלים. לאחר מכן, הפוך את ה-PDMS zWEDGI לכיוון הנכון על הזכוכית על ידי מיקומו בזהירות על הבאר המרכזית של צלחת תחתית הזכוכית. כדי להבטיח היצמדות PDMS לזכוכית, השתמש בקצה האחורי של הפינצטה כדי להפעיל לחץ סביב הגיאומטריות הזעירות של המיקרו-ערוצים, והחליק את ה-PDMS החוצה לכיוון הקצוות.

לחץ קלות כלפי מטה על התקן ה-PDMS כדי להבטיח שבועות אוויר אינן כלואות מתחת להתקן. הוסף 70% אתנול לתבשיל ובעזרת מיקרופיפטה, שטוף את התעלות כולל דרך מנהרת הריסון. לאחר מכן, הסר את האתנול והשתמש במים מזוקקים כפולים כדי לשטוף את המכשיר פעמיים או שלוש לפני שתאפשר לו להתייבש באוויר.

מלאו את התעלות בחלב דל שומן, ודגרו את המכשיר למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי למזער את הידבקות הזחלים להחלקת כיסוי הזכוכית של המנה. לאחר מכן, טבלו בעדינות את המכשיר מספר פעמים במים מזוקקים כפולים לשטיפה, והניחו לו להתייבש באוויר הפוך. לאחר הרדמת זחלים על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש בכמה מיקרוליטרים של טריקאין E3 כדי להרטיב מראש את תעלות המכשיר.

בעזרת קצה פיפטה רחב של פתח, הרם זחל בודד והפקיד אותו בתעלת הטעינה. לאחר מכן, בעזרת קצה פיפטה או כלי דומה, כוון את הזחל בתא הטעינה כאשר הצד הגבי פונה לקצה הישר יותר של תא הטעינה, והזנב פונה למנהרת הריסון. משוך בזהירות נוזלים מתא הפציעה, ואפשר לזחל לזרום לתוך מנהרת הריסון.

הסר את רוב הנוזל תוך שמירה על לחות סביב הזחל. הזחל חייב להיות מכוון כראוי לתוך מנהרת הריסון מכיוון שרוב הנוזל מוסר. אבל מספיק נוזלים חייבים להישאר סביב הזחלים.

ניתן לכוונן את האוריינטציה לאחר הוספת אגרוז אך יש לבצע אותה לפני שהאגרוז מתמצק. פיפטה 1%LMP אגרוז בטריקאין E3 מעל ראש הזחל, ממלאת את תא ההעמסה, ומאפשרת לאגרוז להתמצק עם הזחל במיקום הנכון. הוסיפו טריקאין E3 לתא הפצעים לפי הצורך כדי לשמור על הידרציה.

לאחר מכן, חזור על תהליך טעינה זה עבור שני הערוצים הנותרים. בעזרת מחט מזרק, הסר בזהירות כל אגרוז שחלחל דרך מנהרת הריסון לתוך תא הפציעה. לפציעה, הדמיה לטווח קצר או בידוד לטיפול בפצעים, הוסף עוד טריקאין E3 מעל האגרוז.

כדי לפצוע את הזחלים בתא הפציעה, השתמש בלהב אזמל סטרילי כדי לחצות את סנפיר הזנב מאחור לנוטוכורד. הוסף טריקאין E3 נוסף במידת הצורך והחזר את מכסה צלחת התרבות. התקן את מכשיר ה-zWEDGI עם זחלים מורדמים על מיקרוסקופ הפוך בתוספת במה שתכיל את צלחת תחתית הזכוכית בגודל 60 מילימטר.

אתר את זנב הזחלים בתעלה העליונה, סובב את המנה לפי הצורך כדי לקבל את הזנב במיקום הרצוי. דמיין את הזחל כנדרש לניסוי הספציפי. בסיום הניסוי, הסר את צלחת zWEDGI מהמיקרוסקופ.

לאחר הסרת הזחלים והאגר על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש באתנול ובמים מזוקקים כדי לנקות את ה-zWEDGI כפי שהודגם קודם לכן, והניח אותו הפוך לייבוש באוויר. אחסן את המכשיר המכוסה במקום קריר ויבש. מוצגות כאן תמונות המשתמשות במיקרוסקופיה מולטיפוטונית להרמוניה שנייה, או הדמיית SHG של סיבי קולגן בסנפיר הזנב כדי להמחיש את יכולות ההדמיה של zWEDGI.

לפני הפציעה, ה-SHG זיהה סיבי קולגן המקרינים החוצה מהנוטוקורד לקצה הסנפיר. זמן קצר לאחר הפציעה, המרחק בין קצה הסנפיר המכווץ למרכז הסנפיר גדל עם הרפיית הפצע. ה-zWEDGI מאפשר איסוף נתונים תלת מימדיים לאורך זמן, ומספק תצוגה מלאה יותר של השינויים הדינמיים המתרחשים במבנה המטריצה החוץ-תאית.

האופי התלת-ממדי של איסוף הנתונים מאפשר שחזור מרחבי באמצעות תוכנת רינדור. שחזורים אלה ואפשרויות הסיבוב הבאות ממחישים כי ההתכווצות וההרפיה של הסנפיר מתרחשות לא רק במישור ה-XY של אוסף התמונות, אלא גם בציר Z, כאשר הזנב משתטח מהסלסול כלפי מעלה של המצב המכווץ. לאחר הדפסת התבניות הרב פעמיות, ניתן לבצע את טכניקת הייצור תוך שלוש עד ארבע שעות.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לוודא שאין בועות אוויר כלואות ב-PDMS לפני הריפוי ולרפא את המכשירים מספיק זמן לפני שמנסים להסיר אותם מהתבניות. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון יישום תרופות מקומי, תיוג נוגדנים או טיהור RNA וחלבונים על מנת לענות על שאלות נוספות כמו כיצד נוכחות תרופות או מעכבים משפיעה על ריפוי פצעים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום ריפוי הפצעים לחקור את הדינמיקה של קולגן, תגובת תאי החיסון וצמיחה מחדש של רקמות בזחלי דג הזברה.

לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לייצר zWEDGI ולהשתמש בו לפציעה והדמיה חיה של זחלי דג הזברה. אל תשכח ששרפים להדפסת תלת מימד פוטופולימרים מסוכנים לבני אדם ורעילים לדגי הזברה. יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות ושימוש במסכת פנים בזמן טיפול בחלקים מודפסים בתלת מימד שלא נרפאו, והקפדה על ריפוי כל השרף שנותר על ההדפסים לפני שמנסים למלא את התבניות ב-PDMS.