דנדרימר מבוססי Nanopatterns לא אחיד כדי מקומית משטח שליטה Adhesiveness: שיטה ישירה בידול Chondrogenic

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להשיג ננו-תבניות לא אחידות מבוססות דנדרימר בקנה מידה גדול המאפשרות שליטה בקנה מידה ננומטרי של דבקות פני השטח המקומית. השיטה המתוארת מיושמת לחקר הידבקות תאים והתמיינות כונדרוגנית. ננו-תבניות מוגבהות של דנדרימר מאפשרות לשלוט באופן מקומי על דבקות פני השטח בקנה מידה ננומטרי.

פוליננומרים מהדור הראשון ששונו עם פפטיד RGD דבק התא משמשים ליצירת ננו-תבניות. הם מאופיינים בטכניקות סריקה לכל מיקרוסקופיה ומשמשים במחקרי הידבקות והתמיינות תאים. לאחר מכן אנו מנתחים את התוצאות מטכניקות מיקרוסקופיה וצביעה חיסונית.

השלב הראשון הוא הכנת מצעי העבודה. שקופיות זכוכית מרובעות מותאמות אישית מיוצרות על ידי חיתוך שקופיות מיקרוסקופיה עם חותך עם קצה יהלום. צור שקופיות בגודל 1.25 על 1.25 סנטימטרים.

שטפו את השקופיות במים נטולי יונים, ואחריהם אתנול 96% ותנו להן להתייבש באוויר. הכן את תמיסת 2% PLLA על ידי הוספת 200 מיליגרם PLLA לצינור לחץ והוסף 10 מיליליטר דיאוקסן. מוסיפים מוט ערבוב וסוגרים היטב את הצינור.

חממו את התערובת באמבט גליצרין בחום של 60 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות תוך ערבוב עדין. הניחו את מגלשות הזכוכית בבקבוקון זכוכית המכיל את תמיסת PLLA על פלטה נקייה וחמה בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס. המתן לפחות 10 דקות כדי להגיע לטמפרטורה הדרושה.

ציפוי ספין את מצעי הזכוכית בתמיסת PLLA על ידי הנחת מגלשת הזכוכית על שלב ציפוי הסיבוב והפעלת התוכנית שנבחרה. אנו בוחרים 3,000 סל"ד למשך 30 שניות עם תאוצה של 1,500 סל"ד לשנייה עם שלב מקדים של 500 סל"ד בחמש שניות ב-300 סל"ד לשנייה כדי להבטיח ציפוי הומוגני. ניתן לאחסן כוסות מצופות ספין במקרר.

הכן וסוניקציה למשך 10 דקות תמיסה A, תמיסה של 0.77 מיליגרם למיליליטר של דנדרימר RGD-Cys-D1 במים נטולי יונים. לאחר מכן הכינו תמיסות דנדרימר של 10 עד 2% ו-10 עד 5% תמיסה B ו-C בהתאמה במים נטולי יונים. תמיסת סוניקציה C למשך 10 דקות והכינו את תמיסות הדנדרימרים הבאות, D, E ו-F גם במים נטולי יונים.

פתרון D, 2.5x10 עד 8% פתרון E, 10 עד 8% ופתרון F, 4 10 עד 9%שמור את התמיסות הללו במקרר עד לשימוש. אתה מסיים עם מנורת UV של תא תרבית התאים 18 כוסות מצופות PLLA למשך 13 דקות כדי להפוך אותן לסטריליות. סוניקציה של כל אחת מתמיסות הדנדרימר למשך 10 דקות.

סנן את תמיסות הדנדרימר דרך מסננים בקוטר 0.22 מיקרומטר על שקופיות הזכוכית המצופות PLLA בצלחת של 12 בארות מתחת לזרימה הלמינרית של תא תרבית התאים. השאירו אותם בתוך התא בטמפרטורת החדר למשך 16 שעות ושטפו אותם במים סטריליים ונטולי יונים. עבור דגימות הבקרה החיוביות, הכינו תמיסת פיברונקטין סטרילית ב-PBS ודגרו את ההעתקים עם התמיסה למשך שעה בטמפרטורת החדר בתא תרבית התאים.

שטפו אותם עם PBS. שלושת המצעים המצופים PLLA הנותרים ישמשו כהעתקים לבקרה השלילית. טופוגרפיה ננו-דפוסית מנותחת עם AFM המופעל במצב הקשה באוויר.

התקן שלוחת סיליקון עם קבוע קפיץ של 40 ניוטון למטר ותדירות תהודה של 300 קילו-הרץ לתוך מחזיק קצה ה-AFM. עם מצע הננו-דפוס על דרגת AFM, התקרב אל פני השטח עד למגע ובחר נקודת הגדרת משרעת המאפשרת הדמיה של תצורת הדנדרימר מבלי להפעיל לחץ מוגזם על פני השטח. רשום לפחות שלוש תמונות מייצגות של 5x5 מיקרומטר לכל מצע של שלושה מצעים עצמאיים לכל מצב.

טפל בתמונות שנרכשו באמצעות תוכנת העיבוד AFM. בחר דנדרימרים בתמונות גובה ה-AFM המעובדות וקבל את ספי התמונה המתאימים. קבל את דיוק החלקיקים והשתמש בהם כדי להשיג את המרחקים המינימליים בין החלקיקים.

תן למרחקים המינימליים בין החלקיקים ב-Z לדיוק החלקיקים המתאימים כדי להשיג את תקעי בקרת ההסתברות עבור המרחקים המינימליים בין החלקיקים. התאם את סולם הצבעים של העלילה כדי לדמיין את האזורים שבהם צפיפות פני השטח המקומית של RGD נמוכה מ-70 ננומטר. כמת את השטח של אזורים אלה על-ידי בחירתם בתמונה ויצירת סף.

השתמש בשומן אנושי מסחרי שמקורו בתאי גזע מזנכימליים ממעברים מוקדמים, רצוי מתחת לחמש. תרבו אותם בטמפרטורה של 37 מעלות ו-4.6% CO2 במדיום הגידול של תאי הגזע עד שמגיעים למפגש של 70 או 80%. זרע את התאים בצפיפות תאים של 3,000 תאים לסנטימטר רבוע על המצעים במדיום מעורר כונדרוגנזה.

החלף את המדיום כל שלושה ימים. ניתן לצפות בשלב העיבוי מהיום הראשון בתרבית, וניתן לעקוב אחר התפתחותם על ידי מיקרוסקופ ניגודיות פאזה אופטי בכל מעבדות התרבות. מקבעים את התאים בתמיסת פורמלין של 10% בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות, ואז שוטפים עם PBS.

נעל את קבוצות הפורלדהיד על ידי הוספת תמיסה של 50 מילי-מולרית של אמוניום כלוריד ב-PBS. השאירו למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו עם PBS.

לחדור לתאים עם תמיסה של 0.1% של ספונין בתמיסת החסימה של 1% אלבומין ב-PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. דגירה עם נוגדנים ראשוניים בתמיסת החסימה למשך שעה בטמפרטורת החדר. שטפו עם PBS.

דגירה עם נוגדנים משניים בתמיסת החסימה למשך שעה בטמפרטורת החדר, הימנעות מחשיפה לאור. שוטפים עם PBS ומייבשים. מרחו מדיום הרכבה במיקרוסקופיה על הדגימות וכסו אותן בעדינות עם החלקות כיסוי.

דמיינו את הדגימות המוכתמות במערכת החיסון עבור חלבון ההדבקה המוקדית פקסילין לאחר יום אחד של אינדוקציה כונדרוגנית, ועבור הסמן הכונדרוגני המוקדם, קולגן II אלפא I לאחר חמישה ימים של אינדוקציה כונדרוגנית באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי זקוף. אסוף קטעים במרווח מייצג, למשל 0.5 או 1 מיקרומטר. סנן את התמונות המוכתמות עבור פקסילין מהאזור הבסיסי של עיבוי תאים.

הסר את הרקע, החלק והמר לקבצי שמונה סיביות. הפוך אותם לבינאריים על ידי הגדרת סף שנבחר אמפירית. טפל במינימום של שלושה עיבוי תאים לכל מצב של שלוש דגימות בלתי תלויות.

כמת את האזורים שנבחרו ובטא אותם כאחוז השטח המתאים חלקי מספר גרעיני התא בתמונה. כדי לכמת צביעת קולגן II אלפא I, צור הקרנות Z קונפוקליות. סנן את התמונות המתקבלות, הסר רקע, החלק והגדר סף.

כמת את סכום השטח הצפוי מקסימום קולגן II אלפא I לדגימה מול שטח עיבוי התא המתאים. ניתן להשיג תצורות ננו-דפוס שונות המשנות את ריכוז הדנדרימר הראשוני בתמיסה. ניתן לדמיין ננו-תבניות על ידי ניתוח AFM ותרשימי קווי מתאר הסתברות עבור המרחק המינימלי בין החלקיקים שנבנה.

הם מדגישים את האזורים על פני השטח עם צפיפות פני השטח המקומית הגבוהה ביותר של RGD. ננו-תבניות דנדרימר משמשות במחקרי הידבקות תאים. ההדבקה גדלה עם צפיפות פני השטח המקומית של RGD.

עבור הבקרה החיובית והמשטחים המכילים אגרגטים של דנדרימר, מתאם זה הולך לאיבוד. השפעת צפיפות פני השטח המקומית של RGD נבדקה בכונדרוגנזה, הן עיבוי התאים והן ההתמיינות מועדפים על ידי ננו-דפוסים המציגים דבקות ביניים. לסיכום, ננו-דפוס מבוסס דנדרימר בשיטת שלוש טבלאות כדי לטפל בהשפעת צפיפות ה-RGD המקומית על תגובת התא.

ננו-תבניות מקיימות הידבקות תאים בצורה יעילה יותר במשטח ההומוגני המקביל המשמש בדרך כלל בתרבית תאים. בניסויי התמיינות, הדבקת ביניים של תאים למצע העדיפה עיבוי תאים מזנכימלי והתמיינות כרונדוגנית מוקדמת. בשל השינוי הקל של צמיחה היקפית של דנדרימר, ניתן להרחיב את השיטה המתוארת כאן לכל השכבות הראומטיות המוגזמות שיש להן השפעות צפיפות על התאים.