בזמן אמת רועד מפחד הנוצרות על-ידי המרה Assay גילוי של CWD Prions חומר צואתי

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה לבדיקת המרה הנגרמת על ידי רעידות בזמן אמת היא לאפשר זיהוי רגיש של פריונים של מחלת בזבוז כרוני בדגימות צואה של צוואת צוואר הרחם. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המחקר של CWD כגון מתי נגועים פריונים של CWD בצואה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא ספציפית, רגישה והיא מאפשרת תפוקה גבוהה של דגימות.

מי שתדגים את ההליך תהיה ג'יני צ'נג, טכנאית מעבדה מהמעבדה שלי. כדי להתחיל בהליך זה, הוסף גרם אחד של חומר צואה לצינור המכיל 10 מיליליטר מאגר תמצית צואה. בעזרת דיסוציאטור עם תוכנית מוגדרת מראש לחלבונים, הומוגניזציה של כדורי הצואה למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.

חזור על כך פעמיים-שלוש עד שדגימות הצואה הומוגניות לחלוטין. לאחר מכן השתמש בפרפילם כדי לאטום את הצינורות ולהניח אותם על משטח נדנדה או שייקר סיבובי למשך שעה של דגירה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, צנטריפוגה ב -18, 000 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

אספו את הסופרנטנטים והעבירו אותם לצינורות של 1.5 מיליליטר. יש לאחסן בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס עד שמוכן לשימוש. כדי להתחיל בשיטת משקעי חומצה פוספוטונגסטית, הוסף 250 מיקרוליטר סרקוזיל למיליליטר אחד של תמצית חלבון צואה.

בעזרת פרפילם, אטום את הצינור. הכניסו את הצינור למיקסר תרמי ודגרו בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם ניעור מתמיד ב -1, 400 סל"ד. לאחר מכן, הוסף תמיסת מלאי המכילה 10% חומצה פוספוטונגסטית נתרן ו-170 מילי-מולרי מגנזיום כלוריד כך שהריכוז הסופי של חומצה פוספוטונגסטית נתרן בדגימות הוא 3%העבירו את הדגימות למיקסר התרמי ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים עם ניעור מתמיד ב-400 סל"ד.

לאחר מכן, צנטריפוגה ב-15, 800 גרם למשך 30 דקות ב-14 מעלות צלזיוס. הסר בזהירות את הסופרנטנטים ושטוף את הכדורים על ידי השעייתם מחדש במאגר כביסה. ואז צנטריפוגה ב-15, 800 גרם למשך 15 דקות ב-14 מעלות צלזיוס.

הסר בזהירות את הסופרנטנטים והשהה מחדש את הכדורים ב-100 מיקרוליטר של מאגר דילול RT-QuIC. אחסן את הדגימות המטופלות במינוס 20 מעלות צלזיוס עד שיהיה מוכן לבצע את בדיקת RT-QuIC. כדי להתחיל, הוסף 0.032 גרם של Thioflavin T ל -10 מיליליטר מים מזוקקים כפולים להכנת תמיסת מלאי Thioflavin T טרייה של 10 מילי-מולאר.

לאחר מכן, השתמש במים מזוקקים כפולים כדי לבצע דילול של 1 עד 10 של תמיסת המלאי וכתוצאה מכך ריכוז סופי של מילי-מולרית אחת Thioflavin T.בעזרת מזרק המצויד במסנן דיסק Acro של 0.2 מיקרומטר, סנן את תמיסת ה-Thioflavin T המילי-מולרית האחת. לאחר מכן יש להפשיר את מצע חלבון הפריון הרקומביננטי ביותר. טען 500 מיקרוליטר של מצע חלבון פריון רקומביננטי בכל פעם לתוך מיקרו-צינורות מסנן הדרה בגודל 100 קילו דלתון.

צנטריפוגה בחום של 14, 000 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, העבירו את המצע המנופח לצינור סטרילי של 1.5 מיליליטר. יש לאחסן בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד שמוכן לשימוש.

לאחר מכן, הפשירו את מאגר הדילול המאוחסן. לדלל את הזרע ולהכין את תמיסות המלאי ותערובת התגובה RT-QuIC כמתואר בפרוטוקול הטקסט. בעזרת פיפטה עם קצה פילטר, מערבבים את תערובת התגובה על ידי פיפטה למעלה ולמטה.

שופכים את התערובת למאגר צנרת סילוק של 50 מיליליטר. בעזרת פיפטה רב-ערוצית, טען 98 מיקרוליטר של תערובת תגובת RT-QuIC לכל באר של צלחת תחתונה אופטית של 96 בארות. לכל תגובה, הוסף שני מיקרוליטרים של תמצית חלבון צואה לא מדוללת או מדוללת פי 10

לאחר מכן השתמש בסרט איטום כדי לאטום את הצלחת. דגירה בקורא צלחות בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 25 שעות עם מחזורים חוזרים ונשנים של דקה אחת של טלטול מסלול כפול ב-700 סל"ד ודקה אחת של מנוחה לאורך כל הדגירה. בינתיים, הגדר את הגדרות מדידת הקרינה כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

לאחר 25 שעות, הסר את הצלחת מקורא הצלחות. סובב את הצלחת ב-3,000 גרם למשך שלוש דקות כדי למנוע זיהום פוטנציאלי בין הבארות. לאחר מכן, הסר את החותם מהצלחת.

הכן צלחת חדשה על ידי הוספת 90 מיקרוליטר של תערובת תגובת RT-QuIC המכילה מצע טרי וצבע פלואורסצנטי טרי של Thioflavin T. מעבירים 10 מיקרוליטר מכל באר של הצלחת הראשונה לצלחת 96 הבארות שהוכנה לאחרונה. השתמש בסרט איטום כדי לאטום את הצלחת החדשה.

לאחר הגדרת הגדרות מדידת הקרינה, המשך בבדיקה למשך 50 שעות נוספות. קרא ותעד את אות הקרינה של תיופלבין T עבור כל באר כל 15 דקות. לאחר מכן אסוף ושרטט את הנתונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

במחקר זה, חומר צואה מאיילים או צבי פרד לא נגועים עוברים הומוגניות במאגר תמצית צואה כדי להשיג ריכוז דגימה סופי של 10% חלק מההומוגנטים מעובדים לאחר מכן ומרוכזים פי 10 על ידי משקעי חומצה פוספוטונגסטית נתרן. בעוד שהפחתה בהמרות ספונטניות נצפתה בדגימות מטוהרות, כל הדגימות הראו אותות פלואורסצנטיים נמוכים בדגימות צואה חיוביות ל-CWD. כדי לשפר את ההגברה של פריונים ולשפר את רגישות הזיהוי, משולב שלב החלפת מצע.

דגימות שעברו החלפת מצע כחלק מפרוטוקול RT-QuIC מראות עלייה ברגישות ובסגוליות של הגילוי, כאשר 14 מתוך 18 הדגימות היו חיוביות ואף אחת מהבקרות השליליות לא נרשמה כחיובית כוזבת. לאחר השליטה, ניתן לבצע הכנת תמצית צואה וריכוז PRP/SCRP תוך כארבע שעות וניתן להגדיר את בדיקת RT-QuIC תוך כ-1/1-2 שעות אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון ההליך, חשוב לזכור לסנן את המצע אך לעולם לא לערבב אותו.

לאחר ההליך, ניתן להשתמש בשיטות אחרות כגון Western Blotting כדי לענות על שאלות נוספות כמו עד כמה פרוטאזות עמידות הן התוצרים המתקבלים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך למדענים בתחום חקר הפריונים לחקור את נוכחותם של פריונים בחיות חיות על ידי בדיקת דגימות צואה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד להכין ולרכז PRP/SCRP מתמציות צואה וכיצד לבצע בדיקת RT-QuIC שונה כדי להשיג זיהוי פריונים רגיש וספציפי.

אל תשכח שעבודה עם פריונים עלולה להיות מסוכנת ביותר וכי חשוב ללבוש ציוד הגנה אישי מתאים ולעבוד מתחת לארון בטיחות ביולוגית בזמן ביצוע ההליך.