טיהור של ה-DNA הנגיפי לצורך זיהוי חלבונים הקשורים ויראלי וסלולריות

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לטהר DNA של נגיף הרפס סימפלקס מסוג 1 מתאים נגועים לצורך ניתוח פרוטאומי של חלבונים הקשורים לגנום הנגיפי. שיטה זו מספקת תובנות מפתח לגבי מעורבותם של גורמים תאיים וזיהום בנגיף ההרפס. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להתאים אותה לטיהור ישיר של אוכלוסיות שונות של DNA ויראלי מתאים נגועים, מה שמאפשר ניתוח של היבטים מרובים של זיהום.

התחל הליך זה בתרבית של חמישה תאים של MRC כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, יש לדלל את HSV-1 בתמיסת מלח קרה עם טריס או TBS. לשלבים הבאים, חשוב לכבות את המפוח ואת מכסה המנוע של תרבית הרקמות כדי למנוע התייבשות של תאים.

השתמש בפיפטה כדי להעביר את מצע הגידול מתאי MRC 5 לבקבוק סטרילי כדי להוסיף בחזרה לתאים לאחר ההדבקה. להדביק את התאים על ידי הוספת שבעה מיליליטר של נגיף מדולל לתאים. נדנד את התאים כל 10 דקות למשך שעה בטמפרטורת החדר.

לאחר הספיגה יש לשאוב את האנקולום, לשטוף את התאים ב-50 מיליליטר TBS בטמפרטורת החדר ולהחליף את מצע הגידול המקורי. לאחר מכן, דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בנוכחות 5% פחמן דו חמצני. לאחר תחילת שכפול ה-DNA הנגיפי, כארבע שעות לאחר ההדבקה, תווית משכפלת DNA נגיפי.

לשם כך, יש לדלל את EdC במיליליטר אחד של מצע גידול ולהוסיף אותו למדיום תרבית התאים של תאים נגועים למשך שעתיים עד ארבע שעות. כדי לקצור גרעינים, החלף את מצע הגידול ב-20 מיליליטר של מאגר מיצוי גרעינים ודגירה למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס עם נדנוד מדי פעם. לאחר הדגירה, מגרדים גרעינים מהצלחת באמצעות מגרד תאים ומעבירים אותם לצינור חרוטי של 50 מיליליטר על קרח.

צנטריפוגה למשך 10 דקות בטמפרטורה של 2, 500 x גרם וארבע מעלות צלזיוס כדי לגלול את הגרעינים. לאחר צנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט. עקור בעדינות את הגלולה הגרעינית ב-10 מיליליטר של מי מלח פוספט או PBS והעביר אותה לצינור חרוטי של 50 מיליליטר.

לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה כמו קודם. לאחר הסרה מוחלטת של ה-PBS, השעו מחדש את הגלולה הגרעינית ב-10 מיליליטר של תערובת תגובת לחיצה, על ידי פיפטה בעדינות למעלה ולמטה חמש פעמים עם פיפטה של 10 מיליליטר. סובב את הדגימה במשך שעה בארבע מעלות צלזיוס, לפני כדור הגרעינים כמו קודם.

הסר לחלוטין את תערובת התגובה המהירה, ולאחר מכן, שטוף את הגלולה על ידי השעיה מחדש בעדינות ב-10 מיליליטר PBS וצנטריפוגה שוב. כעת, השעו מחדש בזהירות את הגלולה הגרעינית במיליליטר PBS אחד והעבירו את התמיסה לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. לאחר צנטריפוגה, הסר לחלוטין את ה-PBS והקפיא את הגלולה בחנקן נוזלי.

בשלב זה, ניתן לאחסן את הגלולה בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס או להמשיך בהליך. כדי לפרק את הגרעינים ולפרק את ה-DNA, השעו מחדש את הגרעינים המופשרים ב-500 מיקרוליטר של Buffer B1 על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. דגרו את המתלה על קרח למשך 45 דקות.

לאחר מכן, סוניקציה של הדגימות שש פעמים למשך 30 שניות כל אחת במשרעת של 40%, באמצעות בדיקה של שלושה מילימטרים. הניחו את הדגימות על קרח למשך 30 שניות לפחות בין פולסים. לאחר סוניקציה, הדגימות צריכות להיראות ברורות, לא מעוננות.

גלולה את פסולת התא על ידי צנטריפוגה ב-14,000 x G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. גודל הגלולה צריך לרדת באופן משמעותי, לסנן את הסופרנטנט דרך מסננת תאים של 100 מיקרון ולשמור על הזרימה. לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר של Buffer B2 לסופרנטנט המסונן.

כדי לקשור את ה-DNA הביוטיני לחרוזים מצופים סטרפטווידין, הכינו את החרוזים המגנטיים של סטרפטווידין על ידי העברת 300 מיקרוליטר של תמיסת חרוזים לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. הכן צינור חרוזים אחד לכל דגימה. שטפו את החרוזים שלוש פעמים עם מיליליטר של Buffer B2 על ידי מערבולת להשעיה מחדש, מריחה על מגנט להפרדת החרוזים ושאיבת מאגר הכביסה.

לאחר מכן, הוסף 900 מיקרוליטר מהדגימה לחרוזים השטופים. יתרת הדגימה תשמש לקלט DNA ובידוד חלבונים. סובב את המתלה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.

למחרת, הכניסו את הדגימות לתוך מתלה צינור מיקרופוגה מגנטי והסירו את הסופרנטנט. השעו בעדינות את החרוזים במיליליטר אחד של Buffer B2, לפני סיבוב בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. הסר שוב את הסופרנטנט באמצעות מתלה צינור המיקרופוגה המגנטי.

הפעם, השעו בעדינות את החרוזים במאגר B3 של מיליליטר אחד וסובבו בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר הוצאת הסופרנטנט מתערובת החרוזים באמצעות המגנט, השעו מחדש את החרוזים ב-50 מיקרוליטר של מאגר דגימת Laemmli פי 2 כדי לרמוז על קומפלקסים של חלבון DNA. לאחר מכן, הרתיחו את הדגימות בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

מערבולת תערובת לפני שמסובבים במהירות את הדגימות במיקרופוגה. החל את הדגימות על המגנט והעביר את ההקצאה לצינור חדש. לבסוף, הקפיא בזק את הדגימות ואחסן אותן ב-80 מעלות צלזיוס.

בצע ניתוח חלבון כמתואר בפרוטוקול הטקסט. תיוג EdC בוצע במשך אפס, 20, 40 או 60 דקות ואחריו טיהור ה-DNA הנגיפי והחלבונים הנלווים. החלבונים שנפלטו היו נתונים לצביעה כחולה של קומאסי וכתם מערבי עם הנוגדן הספציפי לחלבונים קושרי DNA ויראליים, ICP4 ו-UL42.

החץ מציין סטרפטווידין שהופשט מהחרוזים במהלך הפליטה הקיימת בכל התנאים. חלבונים המבודדים בשיטה זו כפופים לאחר מכן לספקטרומטריית מסה. תרשים העוגה ממחיש את מספר החלבונים בכל קטגוריה תפקודית שנמצאו קשורים לסוג נגיף הרפס סימפלקס בגנום שש שעות לאחר ההדבקה.

מבט מקרוב על אינטראקציות חלבון-חלבון בין חלבונים שזוהו בוצע באמצעות מסד הנתונים של רשת אסוציאציות חלבון פונקציונליות מחרוזת. התוצאות חושפות תת-קומפלקסים של חלבונים המתפקדים יחד באותו תהליך ביולוגי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לטהר DNA ויראלי מתאים נגועים לצורך חקירה פרוטאומית של חלבונים הקשורים לגנום ויראלי.

ניתן להשלים טכניקה זו תוך שלושה עד ארבעה ימים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לנקוט באמצעי זהירות כדי למנוע זיהום DNA או פרוטאז של דגימות. בנוסף להליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו אימונופלואורסצנציה כדי לאמת את אופי ה-DNA הנגיפי המסומן ב-EdC.

טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום וירולוגיה של הרפס, לחקור את התפקודים של חלבוני מארח וזיהום ויראלי.