Name: טיהור של ה-DNA הנגיפי לצורך זיהוי חלבונים הקשורים ויראלי וסלולריות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: חקור טיהור DNA נגיפי מנגיף הרפס סימפלקס מסוג 1 בתאים נגועים לניתוח פרוטאומי של חלבונים הקשורים לגנום הנגיפי. שיטה זו חושפת את תפקידם של גורמים תאיים בהדבקה נגיפית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו להכיר חנה פוקס לעזרה בהכנת כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי NIH הענק R01AI030612.

<ol><li>Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKnipe%2C+DM+%22Fields+virology%22">Fields virology</a>. , 6th, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins Health. (2013).</li>
<li>Engel, E. A., Song, R., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+biology+of+alpha+herpesviruses+with+MS-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Investigating the biology of alpha herpesviruses with MS-based proteomics.</a> Proteomics. 15, 1943-1956 (2015).</li>
<li>Wagner, L. M., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+association+of+herpes+simplex+virus+ICP4+with+cellular+complexes+functioning+at+multiple+steps+in+PolII+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Temporal association of herpes simplex virus ICP4 with cellular complexes functioning at multiple steps in PolII transcription.</a> PloS One. 8, e78242(2013).</li>
<li>Taylor, T. J., Knipe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+of+herpes+simplex+virus+replication+compartments%3A+association+of+cellular+DNA+replication%2C+repair%2C+recombination%2C+and+chromatin+remodeling+proteins+with+ICP8%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Proteomics of herpes simplex virus replication compartments: association of cellular DNA replication, repair, recombination, and chromatin remodeling proteins with ICP8.</a> J Virol. 78, 5856-5866 (2004).</li>
<li>Fontaine-Rodriguez, E. C., Taylor, T. J., Olesky, M., Knipe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+of+herpes+simplex+virus+infected+cell+protein+27%3A+association+with+translation+initiation+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Proteomics of herpes simplex virus infected cell protein 27: association with translation initiation factors.</a> Virology. 330, 487-492 (2004).</li>
<li>Greco, T. M., Diner, B. A., Cristea, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Impact+of+Mass+Spectrometry-Based+Proteomics+on+Fundamental+Discoveries+in+Virology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Virol%22%5BJournal%5D)">The Impact of Mass Spectrometry-Based Proteomics on Fundamental Discoveries in Virology.</a> Annu Rev Virol. 1, 581-604 (2014).</li>
<li>Conwell, S. E., White, A. E., Harper, J. W., Knipe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+TRIM27+as+a+novel+degradation+target+of+herpes+simplex+virus+1+ICP0%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of TRIM27 as a novel degradation target of herpes simplex virus 1 ICP0.</a> J Virol. 89, 220-229 (2015).</li>
<li>Suk, H., Knipe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+the+herpes+simplex+virus+1+virion+protein+16+transactivator+protein+in+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of the herpes simplex virus 1 virion protein 16 transactivator protein in infected cells.</a> Proteomics. 15, 1957-1967 (2015).</li>
<li>Balasubramanian, N., Bai, P., Buchek, G., Korza, G., Weller, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+interaction+between+the+herpes+simplex+virus+type+1+exonuclease%2C+UL12%2C+and+the+DNA+double-strand+break-sensing+MRN+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Physical interaction between the herpes simplex virus type 1 exonuclease, UL12, and the DNA double-strand break-sensing MRN complex.</a> J Virol. 84, 12504-12514 (2010).</li>
<li>Sampath, P., Deluca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+ICP4%2C+TATA-binding+protein%2C+and+RNA+polymerase+II+to+herpes+simplex+virus+type+1+immediate-early%2C+early%2C+and+late+promoters+in+virus-infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Binding of ICP4, TATA-binding protein, and RNA polymerase II to herpes simplex virus type 1 immediate-early, early, and late promoters in virus-infected cells.</a> J Virol. 82, 2339-2349 (2008).</li>
<li>Amelio, A. L., McAnany, P. K., Bloom, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chromatin+insulator-like+element+in+the+herpes+simplex+virus+type+1+latency-associated+transcript+region+binds+CCCTC-binding+factor+and+displays+enhancer-blocking+and+silencing+activities%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A chromatin insulator-like element in the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript region binds CCCTC-binding factor and displays enhancer-blocking and silencing activities.</a> J Virol. 80, 2358-2368 (2006).</li>
<li>Cliffe, A. R., Knipe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+ICP0+promotes+both+histone+removal+and+acetylation+on+viral+DNA+during+lytic+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus ICP0 promotes both histone removal and acetylation on viral DNA during lytic infection.</a> J Virol. 82, 12030-12038 (2008).</li>
<li>Herrera, F. J., Triezenberg, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VP16-dependent+association+of+chromatin-modifying+coactivators+and+underrepresentation+of+histones+at+immediate-early+gene+promoters+during+herpes+simplex+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">VP16-dependent association of chromatin-modifying coactivators and underrepresentation of histones at immediate-early gene promoters during herpes simplex virus infection.</a> J Virol. 78, 9689-9696 (2004).</li>
<li>Kent, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((During+lytic+infection+herpes+simplex+virus+type+1+is+associated+with+histones+bearing+modifications+that+correlate+with+active+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">During lytic infection herpes simplex virus type 1 is associated with histones bearing modifications that correlate with active transcription.</a> J Virol. 78, 10178-10186 (2004).</li>
<li>Oh, J., Fraser, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+association+of+the+herpes+simplex+virus+genome+with+histone+proteins+during+a+lytic+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection.</a> J Virol. 82, 3530-3537 (2008).</li>
<li>Catez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSV-1+genome+subnuclear+positioning+and+associations+with+host-cell+PML-NBs+and+centromeres+regulate+LAT+locus+transcription+during+latency+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">HSV-1 genome subnuclear positioning and associations with host-cell PML-NBs and centromeres regulate LAT locus transcription during latency in neurons.</a> PLoS Pathog. 8, e1002852(2012).</li>
<li>Everett, R. D., Murray, J., Orr, A., Preston, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+type+1+genomes+are+associated+with+ND10+nuclear+substructures+in+quiescently+infected+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus type 1 genomes are associated with ND10 nuclear substructures in quiescently infected human fibroblasts.</a> J Virol. 81, 10991-11004 (2007).</li>
<li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+minimum+herpes+simplex+virus+type+1+components+necessary+to+localize+transcriptionally+active+DNA+to+ND10%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Determination of minimum herpes simplex virus type 1 components necessary to localize transcriptionally active DNA to ND10.</a> J Virol. 77, 5821-5828 (2003).</li>
<li>Ishov, A. M., Maul, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+periphery+of+nuclear+domain+10+%28ND10%29+as+site+of+DNA+virus+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The periphery of nuclear domain 10 (ND10) as site of DNA virus deposition.</a> J Cell Biol. 134, 815-826 (1996).</li>
<li>Maroui, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latency+Entry+of+Herpes+Simplex+Virus+1+Is+Determined+by+the+Interaction+of+Its+Genome+with+the+Nuclear+Environment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Latency Entry of Herpes Simplex Virus 1 Is Determined by the Interaction of Its Genome with the Nuclear Environment.</a> PLoS Pathog. 12, e1005834(2016).</li>
<li>Sirbu, B. M., Couch, F. B., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+spatiotemporal+dynamics+of+proteins+at+replication+forks+and+in+assembled+chromatin+using+isolation+of+proteins+on+nascent+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Monitoring the spatiotemporal dynamics of proteins at replication forks and in assembled chromatin using isolation of proteins on nascent DNA.</a> Nat Protoc. 7, 594-605 (2012).</li>
<li>Leung, K. H., Abou El Hassan, M., Bremner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+method+to+purify+proteins+at+replication+forks+under+native+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient method to purify proteins at replication forks under native conditions.</a> BioTechniques. 55, 204-206 (2013).</li>
<li>Hobbs, W. E. 2nd, DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perturbation+of+cell+cycle+progression+and+cellular+gene+expression+as+a+function+of+herpes+simplex+virus+ICP0%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Perturbation of cell cycle progression and cellular gene expression as a function of herpes simplex virus ICP0.</a> J Virol. 73, 8245-8255 (1999).</li>
<li>Lomonte, P., Everett, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+type+1+immediate-early+protein+Vmw110+inhibits+progression+of+cells+through+mitosis+and+from+G%281%29+into+S+phase+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 inhibits progression of cells through mitosis and from G(1) into S phase of the cell cycle.</a> J Virol. 73, 9456-9467 (1999).</li>
<li>Dembowski, J. A., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+recruitment+of+nuclear+factors+to+productively+replicating+herpes+simplex+virus+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Selective recruitment of nuclear factors to productively replicating herpes simplex virus genomes.</a> PLoS Pathog. 11, e1004939(2015).</li>
<li>Dembowski, J. A., Dremel, S. E., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-Coupled+Recruitment+of+Viral+and+Cellular+Factors+to+Herpes+Simplex+Virus+Type+1+Replication+Forks+for+the+Maintenance+and+Expression+of+Viral+Genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Replication-Coupled Recruitment of Viral and Cellular Factors to Herpes Simplex Virus Type 1 Replication Forks for the Maintenance and Expression of Viral Genomes.</a> PLoS Pathog. 13, e1006166(2017).</li>
<li>Bjornberg, O., Nyman, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dUTPases+from+herpes+simplex+virus+type+1+and+mouse+mammary+tumour+virus+are+less+specific+than+the+Escherichia+coli+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">The dUTPases from herpes simplex virus type 1 and mouse mammary tumour virus are less specific than the Escherichia coli enzyme.</a> J Gen Virol. 77 (Pt 12), 3107-3111 (1996).</li>
<li>Chiou, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-+and+protein-scission+activities+of+ascorbate+in+the+presence+of+copper+ion+and+a+copper-peptide+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">DNA- and protein-scission activities of ascorbate in the presence of copper ion and a copper-peptide complex.</a> J Biochem. 94, 1259-1267 (1983).</li>
<li>Kennedy, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+consequences+of+copper+complexes+used+to+catalyze+bioorthogonal+click+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Cellular consequences of copper complexes used to catalyze bioorthogonal click reactions.</a> J Am Chem Soc. 133, 17993-18001 (2011).</li>
<li>Snel, B., Lehmann, G., Bork, P., Huynen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STRING%3A+a+web-server+to+retrieve+and+display+the+repeatedly+occurring+neighbourhood+of+a+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">STRING: a web-server to retrieve and display the repeatedly occurring neighbourhood of a gene.</a> Nucleic Acids Res. 28, 3442-3444 (2000).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה כולל מספר שלבים אשר, אם לא עקבו בזהירות, עלולה לגרום התשואה חלבון מופחתת באופן משמעותי או זיהום עם תאי ה-DNA. . זה קריטי כי נייח תאים משמשים לניסויים כל כדי להבטיח כי DNA הסלולר לא מתויג, מטוהרים זה יכול להיות מאושרות על ידי העדר polymerases DNA הסלולר במדגם חלבון כי HSV-1 לא לנצל את הסלולר DNA פולימראז של הגנום סינתזה. במהלך EdC תיוג גרעינים קציר צעדים, דגימות צריך להיות התנודד כדי להבטיח כי כל אחד מעובד באופן שווה. במהלך שלבי טיהור, להקפיד לא אתמרן גרעינים על-ידי pipetting מדי. זה יכול להוביל פירוק מוקדמת ש...

וירוסים יש קיבולת מוגבלת כדי לבצע פונקציות חיוניות, ולכן תלויות בגורמים המארח כדי להקל על היבטים קריטיים זיהום כולל ביטוי גנים ויראליים, שכפול, תיקון, רקומבינציה תחבורה. הפעילות של גורמים אלה מארח הם לעיתים קרובות בתוספת לשווק מקודד חלבונים. בנוסף, וירוסים עליך להימנע וזיהוי הפרעות על-ידי תגובות הסלולר זיהום ויראלי. לכן, וירוס מחשב מארח אינטראקציות להכתיב את התוצאה של זיהום. חשיבות עליונה היא ההבנה כמה וירוסים לשנות את הסביבה הסלולר, במטרה להתאים את מכונות הסלולר כדי להקל על התהליכים ויראלי. עניין מיוחד הוא זיהוי גורמים ותהליכים אשר פועלים על הגנום הנגיפי במהלך מחזור זיהומיות.
וירוס הרפס סימפלקס סוג 1 (HSV-1) הוא שכפול תקועים וירוס DNA מדביק חלק ניכר של האוכלוסייה האנושית. בתוך שעה הראשונה של זיהום, הגנום הנגיפי נכנס לגרעין, איפה מדורגת מסודרת של ביטוי גנים ויראליים מתפתח בתיאום עם שכפול נגיפי DNA (vDNA)1. בגרעין, הגנום הם כפופים לכללים epigenetic, לעבור רקומבינציה ותיקון, ארוזים לתוך capsids, כך virions הראשון רומא מיוצרים תוך פחות מ-6 שעות. הערכה מקיפה של גנום ויראלי הקשורים חלבונים לאורך כל הקורס של זיהום תניח את הקרקע כדי לחקור את הפרטים מולקולרית של תהליכים פועלים על הגנום הנגיפי, יספק תובנות אילו גורמים נגיפיים וסלולריות מעורבים בשלבים שונים של זיהום.
שיטות קודמות לחקירה של המארח גורמים מעורבים זיהום ויראלי לכלול טיהור זיקה של חלבונים נגיפיים לניתוח של החלבונים הקשורים2,3,4,5 , 6 , 7 , 8 , 9. מבחני אלה סייעו לצורך הזיהוי של הגורמים המעורבים הסלולר מארח תגובות אנטי ויראליים, כמו גם השינוי כרומטין ויראלי, ביטוי גנים, ותיקון דנ א. עם זאת, קשה לאמת אם האינטראקציות תלויים השיוך vDNA ולאחר פרוטאומיקס רק לספק תובנות האינטראקציות המתרחשות כפונקציה של גורם ויראלי ספציפי. Immunoprecipitation כרומטין (ChIP) נעשה שימוש כדי לזהות איפה לאגד חלבונים נגיפיים וסלולריות ספציפיים הגנום הנגיפי10,11,12,13,14 , 15 ופלורסנט היברידיזציה (דגים) בשילוב עם immunocytochemistry אפשרה את הפריט החזותי של גורמים הסלולר colocalize עם vDNA16,17,18, 19 , 20. מבחני אלה מאפשרים יכולות ניתוח. עם זאת, מגבלות כוללים את הצורך של נוגדנים ספציפיים מאוד רגישות מוגבלת, הצורך הקודם תובנה וירוס מחשב מארח אינטראקציות. לכן פיתחנו שיטת עבודה המבוססת על iPOND (בידוד של חלבונים על ה-DNA nascent)21 , aniPOND (iPOND יליד מואצת)22 כדי לתייג באופן סלקטיבי ולטהר vDNA מן נגוע תאים לצורך זיהוי מוטים אפידמיולוגיה חלבונים הקשורים באמצעות ספקטרומטר מסה. iPOND היה אינסטרומנטלי החקירה של דינמיקה מזלג שכפול הסלולר.
לטיהור סלקטיבי של הגנום הנגיפי של תאים נגועים, שכפול vDNA נקראת עם ethynyl ששינה נוקלאוזידים, 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (אדו) או 5-ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) (איור 1), ואחריו קוולנטיות ההטיה כדי ביוטין אזיד באמצעות לחץ על כימיה כדי להקל על צעד בודד טיהור של הגנום הנגיפי וחלבונים הקשורים על חרוזים מצופים streptavidin (איור 2B). חשוב לציין, זיהומים מבוצעות בתאי נייח, אשר לא עוסקים הסלולר שכפול ה-DNA כדי לאפשר תיוג ספציפית של vDNA. יתר על כן, זיהום HSV-1 גורם מחזור מעצר התא, ומעכב הסלולר DNA שכפול23,24. הוירוס יכול להיות prelabeled לפני זיהום לניתוח של חלבונים הקשורים נכנסות הגנום הנגיפי (איור 1 א') או תווית במהלך שכפול ה-DNA על הניתוח של חלבונים הקשורים לאחרונה מסונתז vDNA (איור 1B) 25. יתר על כן, ניתוח צ'ייס הדופק יכול לשמש כדי לחקור את הטבע של חלבונים הקשורים שכפול ויראלי מזלגות (איור 1C)26. בנוסף, vDNA ethynyl-השתנה יכול מצומדת covalently כדי fluorophore לחקירה המרחבי של חלבון דינמיקה (2A איור , איור 3). הדמיה מאפשר פריט חזותי ישיר של vDNA היא גישה ללא תשלום עבור האימות של אינטראקציות חלבון vDNA, ניתן להתאים לאתר הגנום הנגיפי במהלך זיהום. אנו צופים כי הגישות האלה יכול להיות עוד יותר שונה ללמוד בכל היבט של זיהום herpesviral, לרבות השהיית הפעלה מחדש, וכדי ללמוד וירוסים אחרים, ה-DNA. יתר על כן, תיוג עם 5-ethynyl uridine (EU) עלולה לאפשר לניתוח של הגנום נגיפי RNA.

<table><tbody><tr><td>תאי MRC-5</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-179</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>12800-082</td><td>מוחלף ב-10% FBS, 2 מ"מ L-גלוטמין, 12 mM&nbsp; (לגידול בצלוחיות) או 30 מ"מ (לגידול בכלים) נתרן-ביקרבינאט</td></tr><tr><td>600 ס"מ2 צלחת תרבית רקמות</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>166508</td><td></td></tr><tr><td>Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4</td><td></td><td></td><td>137 מ"מ NaCl, 5 מ"מ KCl, 491 מ"מ MgCl, 680 מ"מ CaCl, 25.1 מ"מ</td></tr><tr>מלאי <td></td><td></td> Tricine<td>HSV-1</td><td>מלאי עם טיטרים גדולים מ-1x109 PFU/mL עובד בצורה הטובה ביותר</td></tr><tr><td>ספדקס G-25&nbsp; טור (עמודת התפלה PD-10)</td><td>GE Healthcare</td><td>17085101</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>D128-1</td><td></td></tr><tr><td>5&acute;-אתיניל-2&אקוטי;-דאוקסיציטידין (EdC)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T511307</td><td>ממיסים ב-DMSO להכנת מלאי של 40 מ"מ, מכילים ומאחסנים ב-20 מעלות; C&nbsp;</td></tr><tr><td>2&acute;-deoxycytidine (deoxyC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3897</td><td>ממיסים במים להכנת ציר של 40 מ"מ, aliquot, ומאחסנים בטמפרטורה של -20&deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>מאגר מיצוי גרעיני (NEB)</td><td></td><td></td> <td>הכן טרי (20 מ"מ Hepes pH 7.2, 50 מ"מ NaCl, 3 מ"מ MgCl2, 300 מ"מ סוכרוז, 0.5% Igepal)</td></tr> <tr><td>מגרד תאים</td><td>זכוכית Bellco</td><td>7731-22000</td><td>חיטוי לפני השימוש</td></tr><tr><td>תמיסה כחולה טריפאן</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.2 (10x)</td><td></td><td></td><td>1.37 מ' NaCl, 27 מ"מ KCl, 100 מ"מ Na2HPO4, 18 מ"מ KH2PO4 (לדלל ל-1x במים סטריליים לפני השימוש)</td></tr> <tr><td>נחושת (II) סולפט פנטהידראט (CuSO4-5H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C489</td><td>הכן מלאי של 100 מ"מ ואחסן ב-4 מעלות; C עד חודש</td></tr> <tr><td>(+) נתרן L-אסקורבט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td>הכן טרי מלאי 100 מ"מ ואחסן על קרח עד לשימוש</td></tr><tr><td>בביוטין אזיד</td><td>Invitrogen</td><td>B10184</td><td>הכן מלאי של 10 מ"מ ב-DMSO, aliquot, ואחסן ב-20 מעלות; C לתקופה של עד שנה&nbsp;</td></tr><tr><td>לחץ על תערובת</td><td></td><td></td> תגובה <td>הכן מיד לפני השימוש על ידי הוספת ריאגנטים בסדר המצוין (10 מ"ל: 8.8 מ"ל 1x PBS, 200 מ"ל 100 מ"מ CuSO4, 25 מ"ל 10 מ"מ ביוטין אזיד, 1 מ"ל 100 מ"מ נתרן אסקורבט)&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז שלם</td><td>Roche</td><td>11697498001</td><td>ממיסים ב-1 מ"ל מים להכנת ציר פי 50, ניתן לאחסן ב-4 מעלות; C עד שבוע, או הוסף ישירות כדור אחד למאגר 50 מ"ל</td></tr><tr><td>מאגר</td><td></td><td></td> הקפאה <td>הכן טרי (7 מ"ל 100% גליצרול, 3 מ"ל NEB, 200 &mu; מעכב פרוטאז L 50x)</td></tr><tr><td>בופר B1</td><td></td><td></td><td>הכן טרי (25 מ"מ NaCl, 2 מ"מ EDTA, 50 מ"מ Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x מעכב פרוטאז)</td></tr><tr><td>מאגר B2</td><td></td><td></td><td>הכן טרי (150 מ"מ NaCl, 2 מ"מ EDTA, 50 מ"מ Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x מעכב פרוטאז)</td></tr><tr><td>מאגר B3</td><td></td><td></td><td>הכן טרי (150 מ"מ NaCl, 2 מ"מ EDTA, 50 מ"מ Tris-HCl pH 8, 1x מעכב פרוטאז)</td></tr><tr><td>מעבד Vibra Cell Ultra Sonic מצויד בבדיקה 3 מ"מ</td><td>microtip Sonics</td><td>VCX 130</td><td></td></tr><tr><td>מסננת תאים</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td><td>Life Technologies</td><td>65601</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>מיני צינור מסובב</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>260750F</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli מאגר</td><td></td><td></td> דגימה <td>מערבבים 400 מ"ג SDS, 2 מ"ל 100% גליצרול, 1.25 מ"ל של 1 M Tris (pH 6.8) ו-10 מ"ג ברומופנול כחול ב-8 מ"ל מים. אחסן ב-4&nbsp; &deg; C עד 6 חודשים. לפני השימוש הוסף 1 M DTT לריכוז סופי של 200 מ"מ.</td></tr><tr><td>מנעולי מכסה לצינור 1.5 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>NC9679153</td><td></td></tr><tr><td>ריאגנטים</td><td></td><td></td><td></td>מערביים סטנדרטיים</tr><tr><td>NOVEX ערכת צביעה כחולה קולואידית</td><td>Invitrogen</td><td>LC6025</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות 12 בארות</td><td>קורנינג</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-100</td><td>אוטוקלאב לפני השימוש</td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-552-5</td><td></td></tr><tr><td>16% פרפורמלדהיד</td><td>אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעי</td><td>15710</td><td>לדלל ל-3.7% ב-1x PBS לפני השימוש</td></tr><tr><td>אלבומין בסרום בקר (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1605</td><td>הכן 3% ב-1x PBS</td></tr><tr><td>מאגר פרמיביליזציה (0.5% טריטון-X 100)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>הכן 0.5% טריטון-X 100 ב-1x PBS</td></tr><tr><td>קוקטייל תגובת קליק - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 ערכת הדמיה</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>C10337</td><td>הכן לפי פרוטוקול היצרן</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td>הכן 10 מ"ג/מ"ל במים, יכול לאחסן ב-4 מעלות; C למשך עד שנה</td></tr><tr><td>עכבר נגד ICP8 נוגדן ראשוני</td><td>Abcam</td><td>ab20194</td><td>השתמש בדילול של 1:200 בנוגדנים ראשוניים 1x PBS</td></tr><tr><td>Mouse anti-UL42 (2H4)</td><td>Abcam</td><td>ab19311</td><td>השתמש בדילול של 1:200 ב-1x PBS</td></tr><tr><td>עז נגד עכבר 594-מצומד נוגדן משני</td><td>Life Technologies</td><td>a11005</td><td>השתמש בדילול של 1:500 ב-1x PBS</td></tr><tr><td>Immu-mount</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>9990402</td><td></td></tr><tr><td>2x תמיסת</td><td></td><td></td> SDS-bicarb <td>2% SDS, 200 מ"מ NaHCO3</td></tr><tr><td>פנול: כלורופורם: אלכוהול</td><td></td><td></td> איזואמיל <td>מערבבים 25:24:1 לפחות יום אחד לפני השימוש, יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C בכלורופורם הכהה</td></tr><tr><td>: אלכוהול</td><td></td><td></td> איזואמיל <td>מערבבים 24:1 לפחות יום אחד לפני השימוש, יש לאחסן בטמפרטורת החדר בחושך</td></tr><tr><td>10x Tris EDTA (TE), pH 8.0</td><td></td><td></td><td>100 מ"מ Tris, 10 מ"מ EDTA (לדלל ל-1x לפני השימוש)</td></tr> <tr><td>ערכת טיהור Qiaquick PCR Qiagen</td><td></td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>3 M נתרן אצטט pH 5.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>קיוביט 2.0 פלואורומטר</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקה של Qubit dsDNA HS</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>צינורות בדיקת Qubit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד בתוכנת</td><td></td><td></td><td></td>הדמיה</tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה לצינורות</td><td></td><td></td><td></td>1.5 מ"ל</tr><tr><td>צנטריפוגה שולחנית לצינורות</td><td></td><td></td><td></td>15 ו-50 מ"ל</tr><tr><td>תא חממת</td><td></td><td></td><td></td>תרבות</tr><tr><td>ארון</td><td></td><td></td><td></td>בטיחות ביולוגית</tr><tr><td>גושי</td><td></td><td></td> חום <td>65 מעלות; C ו-95 מעלות; ג</td></tr></tbody></table>

טיהור של ה-dna הנגיפי לצורך זיהוי חלבונים הקשורים ויראלי וסלולריות

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

המטרה של פרוטוקול זה הוא לבודד את וירוס הרפס סימפלקס סוג 1 (HSV-1) ה-DNA של תאים נגועים לצורך הזיהוי הקשורים ויראלי החלבונים על ידי מסה ספקטרומטר. למרות חלבונים המקיימים אינטראקציה עם הגנום הנגיפי משחק תפקידים עיקריים בקביעת התוצאה של זיהום, ניתוח מקיף של גנום ויראלי הקשורים חלבונים לא היה אפשרי בעבר. כאן נדגים שיטה המאפשרת את טיהור ישירה של HSV-1 הגנום של תאים נגועים. שכפול ה-DNA הנגיפי מסומן באופן סלקטיבי עם נוקלאוטידים ששונה מכילים קבוצה פונקציונלית של אלקין. דנ א שכותרתו אז במיוחד ובלתי הפיך מתויג באמצעות החזקה קוולנטיות של ביוטין אזיד דרך נחושת (I)-מזורז אזיד-אלקין cycloaddition או לחץ על התגובה. מתויג ביוטין DNA מטוהר על חרוזים מצופים streptavidin, חלבונים הקשורים eluted, המזוהה באמצעות ספקטרומטר מסה. שיטה זו מאפשרת מיקוד סלקטיבי ובידוד של מזלגות שכפול HSV-1 או כל הגנום של סביבות ביולוגיות מורכבות. יתר על כן, עיבוד של גישה זו יאפשר החקירה של היבטים שונים של זיהום herpesviral, כמו גם הבחינה של הגנום של וירוסים אחרים, ה-DNA.

השימוש לחץ כימיה לטיהור של ה-DNA של תאים בוצעה לראשונה על ידי שיטת iPOND21. מטרת iPOND היא לטהר מזלגות שכפול הסלולר לצורך זיהוי חלבונים הקשורים. אנחנו הסתגלו טכניקה זו ללמוד אינטראקציות חלבון vDNA במיוחד במהלך זיהום. מניפולציה של הגישה לתייג הגנום הנגיפי עם EdC (איור 1), בשילוב עם זיהומים מסונכרן, אפשרה עבור בידוד סלקטיבי והחקירה של אוכלוסיות נפרדות vDNA. DNA HSV-1 מסומן עם EdC (איור 1) כדי להקל על הקובץ ה...

המטרה של פרוטוקול זה היא במיוחד לתייג באופן סלקטיבי לבודד את ה-DNA הנגיפי של תאים נגועים על האפיון של גנום ויראלי הקשורים חלבונים.

טיהור של ה-DNA הנגיפי לצורך זיהוי חלבונים הקשורים ויראלי וסלולריות

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לטהר DNA של נגיף הרפס סימפלקס מסוג 1 מתאים נגועים לצורך ניתוח פרוטאומי של חלבונים הקשורים לגנום הנגיפי. שיטה זו מספקת תובנות מפתח לגבי מעורבותם של גורמים תאיים וזיהום בנגיף ההרפס. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להתאים אותה לטיהור ישיר של אוכלוסיות שונות של DNA ויראלי מתאים נגועים, מה שמאפשר ניתוח של היבטים מרובים של זיהום.התחל הליך זה בתרבית של חמישה תאים של MRC כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, יש לדלל את HSV-1 בתמיסת מלח קרה עם טריס או TBS. לשלבים הבאים, חשוב לכבות את המפוח ואת מכסה המנוע של תרבית הרקמות כדי למנוע התייבשות של תאים.השתמש בפיפטה כדי להעביר את מצע הגידול מתאי MRC 5 לבקבוק סטרילי כדי להוסיף בחזרה לתאים לאחר ההדבקה. להדביק את התאים על ידי הוספת שבעה מיליליטר של נגיף מדולל לתאים. נדנד את התאים כל 10 דקות למשך שעה בטמפרטורת החדר.לאחר הספיגה יש לשאוב את האנקולום, לשטוף את התאים ב-50 מיליליטר TBS בטמפרטורת החדר ולהחליף את מצע הגידול המקורי. לאחר מכן, דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בנוכחות 5% פחמן דו חמצני. לאחר תחילת שכפול ה-DNA הנגיפי, כארבע שעות לאחר ההדבקה, תווית משכפלת DNA נגיפי.לשם כך, יש לדלל את EdC במיליליטר אחד של מצע גידול ולהוסיף אותו למדיום תרבית התאים של תאים נגועים למשך שעתיים עד ארבע שעות. כדי לקצור גרעינים, החלף

purification-viral-dna-for-identification-associated-viral-cellular

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

הגנום של שפעת וירוס כוללת שמונה מתחמים נפרדים של רנ"א וחלבונים, כינה מתחמי ribonucleoprotein ויראלי (vRNPs). מאמר זה מתאר את שיפוע גליצרול טיהור במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים להדמיה של שפעת vRNPs.

טיהור ויזואליזציה של שפעת מכלולים Ribonucleoprotein ויראלי

אנו מתארים את תהליך של בידוד הטוהר גבוהה ההרפס DNA nucleocapsid מן התאים הנגועים. ה-DNA הסופי שנתפסו מן הפתרון של ריכוז הטוהר גבוהה, מה שהופך אותו אידיאלי עבור סידור תפוקה גבוהה, איכות גבוהה התגובות PCR, ו transfections לייצר recombinants ויראלי חדש.

ההכנה של ה-DNA ויראלי של Nucleocapsids

טיהור טנדם הזיקה היא גישה חזקה לזיהוי של שותפים חלבון מחייב. כהוכחה של המושג, מתודולוגיה זו יושמה כדי eIF4E היטב מאופיין ייזום גורם תרגום המשקע שיתוף סלולריים גורמים המארחות מעורב בייזום תרגום. שיטה זו היא להתאים בקלות לכל חלבון רצוי נייד או ויראלי.

זיהוי שותפים חלבון אינטראקציה באמצעות טיהור טנדם זיקה

ג'נומיקס וירוס אחד (SVG) הוא שיטה לבודד ולהגביר את הגנום של virons בודד. השעיות נגיפיות של מכלול מעורב מסודרים באמצעות cytometry זרימה לשקופית מיקרוסקופ עם בארות בדידות המכילות agarose, ובכך ללכוד את virion והפחתת גז הגנום במהלך עיבוד במורד הזרם. ההגברה הגנום כולו מושגת באמצעות הגברה עקירה מרובה (מד"א) וכתוצאה מכך חומר גנטי שמתאים לסידור.

בידוד ואנליזה של הגנום virions יחיד באמצעות &#39;נומיקס וירוס אחד &quot;

נגיפי שפעת לשכפל גנום הרנ"א שלהם בשיתוף עם הכרומטין מארח תאים. כאן, אנו מציגים שיטה לטיהור שלמים מתחמי ribonucleoprotein ויראלי של הכרומטין של תאים נגועים. מטוהרים מתחמי ויראלי יכול להיות מנותח על ידי כתם הן המערבי תחל הרחבה של חלבון ותוכן RNA, בהתאמה.

זיקה טיהור של נגיף השפעת תסביכים Ribonucleoprotein של הכרומטין של תאים נגועים

מקור: Dembowski, J. A., Deluca, N. A. טיהור של DNA נגיפי לזיהוי של חלבונים נגיפיים ותאיים נלווים. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מדגים הדבקה של תאי יונקים בשלב סטציונרי ב-HSV-1 (Herpes Simplex Virus-1), ולאחריה שכפול של הגנום הוויראלי באמצעות מנגנוני השכפול של המארח והווירוס. אנלוג נוקלאוזידי סינתטי נטמע ב-DNA ויראלי שסונתז לאחרונה כדי לסמן גנומים בשכפול, אשר מבודלים לאחר מכן לצורך אנליזה פרוטאומיקה של חלבוני המארח והווירוס הקשורים אליהם.

סימון של גנומים משתכפלים של HSV-1 באמצעות אנלוג נוקלאוזידי

מקור: .Dembowski, J. A ואחריםטיהור של DNA נגיפי לצורך זיהוי חלבונים נגיפיים ותאיים נלווים. J. Vis. Exp. (2017).סרטון זה מדגים את בידודם של קומפלקסים של חלבון-DNA ויראלי מגרעיני תאים באמצעות כימיית קליק (click chemistry) וטיהור באמצעות חרוזי מגנט. הפרוטוקול כולל סימון של גנומים ויראליים באמצעות נוקלאוטידים שעברו מודיפיקציה של אלקין, ביוטינילציה באמצעות תגובת קליק, וקישור לחרוזי מגנט מצופים בסטראפטווידין. לאחר שטיפה ואלוציה תרמית, הקומפלקסים המטוהרים נאספים, עוברים הקפאה מהירה ומאוחסנים לצורך...

בידוד חלבונים מקומפלקסים של DNA ויראלי-חלבון

מקור: Gao, Y., et al. יצירה והרכבה של נוקלאוקפסيدات ספציפיות לנגיף של נגיף הסינציטיומ של דרכי הנשימה. J. Vis. Exp. (2021)הסרטון מדגים הרכבה in vitro של נוקלאוקפסيدات ספציפיות לנגיף מקומפלקס מטהר של נוקלאופרוטאין-פוספופרוטאין נטול RNA, את טיהורן באמצעות כרומטוגרפיית החרגתו גודל, ואימות של RNA ויראלי באורכו המלא בתוך החלקיקים המורכבים.

שחזור וטיהור במעבדה (In Vitro) של חלקיקים דמויי נוקלאוקפסיד נגיפיים

שימוש בדרכי נשימת סיסטיק פיברוזיס כדוגמא, את כתב היד מציגה עבודה מקיפה הכוללת שילוב של גישות metagenomic וmetatranscriptomic לאפיין את החיידקים וקהילות נגיפיות בדגימות הקשורים לבעלי חיים.

טיהור הלא טהור: Metagenomes הרצף וMetatranscriptomes מדוגמאות הקשורים בבעלי חיים מורכבות

כאן אנו מציגים גישה חדשה לזיהוי וירוסים עם כפול-גדיל DNA הגנום. אנו משתמשים בשיטות הרגילות כדי לחלץ DNA ו- RNA עלים נגועים ולבצע רצף הדור הבא. כלים Bioinformatic להרכיב רצפים לתוך contigs, לזהות contigs המייצג את הגנום של וירוס והקצה הגנום לקבוצות בטקסונומיה.

שילוב ניתוח של דנ א ב מיצוי Virion גולמי עם הניתוח של RNA של עלים נגועים לגלות הגנום וירוס חדש

מוצג כאן פרוטוקול לגישת הדמיה פלואורסצנטית, multiplex immunofluorescent c ell-based detection של DNA, RNA, ו- protein (MICDDRP), שיטה המסוגלת להדמיה פלואורסצנטית סימולטנית חד-תאית של חלבונים נגיפיים וחומצות גרעין מסוג וגדילה שונים. גישה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של מערכות.

הדמיה פלואורסצנטית מרובת תאים בודדים כדי לדמיין חומצות גרעין וחלבונים ויראליים ולפקח על HIV, HTLV, HBV, HCV, נגיף זיקה וזיהום שפעת

חקור טיהור DNA נגיפי מנגיף הרפס סימפלקס מסוג 1 בתאים נגועים לניתוח פרוטאומי של חלבונים הקשורים לגנום הנגיפי. שיטה זו חושפת את תפקידם של גורמים תאיים בהדבקה נגיפית.

טיהור של ה-DNA הנגיפי לצורך זיהוי חלבונים הקשורים ויראלי וסלולריות

גלה סרטונים נוספים