ספריית פפטיד חופפים למפות Epitopes Qa-1 בחלבון

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות אפיטופים של Qa-1 בחלבונים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הוויסות החיסוני והאימונותרפיה. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שפפטידים ממופים ידועים כמעוררים תאי CD8 T מוגבלים ב-Qa-1, וההליך קל לביצוע.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על עיצובים טיפוליים למחלות המתווכות על ידי מערכת החיסון, כגון טרשת נפוצה. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ויסות חיסוני מתווך Qa-1 בבעלי חיים, ניתן ליישם אותה גם על ויסות חיסוני מתווך HLA-E בבני אדם. כדי להתחיל בהליך, תכנן ספרייה של פפטידים 15-mer, שבה פפטידים סמוכים חופפים ב-11 חומצות אמינו.

השג והרכיב מחדש את הפפטידים בתנאים סטריליים. עבור כל פפטיד, שלב חמישה מיליגרם של הפפטיד עם 100 מיקרוליטר של דימתיל סולפוקסיד. שלב 10 מיקרוליטר מכל ציר פפטיד בצינור קריו נקי של 1 מיליליטר להכנת מלאי בריכת OLP.

לאחר מכן, טען 20 מיקרוליטר מכל ציר פפטיד לצלחת של 96 בארות עם תחתית V, ודלל כל ציר ב-80 מיקרוליטר מים סטריליים. אחסן גם את 50 המיליגרם הנותרים למלאי פפטידים של מיליליטר וגם את הצלחת של 10 מיליגרם למיליליטר פפטידים ב-20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטר מתמיסת מלאי הבריכה של OLP לצינור של 15 מיליליטר המכיל שני מיליליטר של תאים דנדריטיים מוקרנים במדיום נטול סרום, ובכך לדלל את ה-DMSO פי מאתיים.

אחסן את מלאי הבריכה הנותר של OLP בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. דגרו את ה-DCs עם בריכת ה-OLP בטמפרטורת החדר למשך שלוש שעות. יש לנער בעדינות את התאים כל 15 דקות ביד.

במהלך הדגירה, השתמש בערכה לטיהור תאי CD8+T מטחול או בלוטות לימפה של עכבר שנקטף. הכן חמישה מיליליטר של תמיסה עם 10 מיליון תאי T למיליליטר של מדיום נטול סרום עם 50 יחידות למיליליטר של אינטרלוקין 2, ו -100 יחידות למיליליטר של אינטרלוקין 7. תאי ה-CD8 T המטוהרים צריכים להיות נקיים מחרוזים, או ללא מגע.

הניחו 0.5 מיליליטר מתמיסת תאי ה- T בכל אחת מ -10 בארות של צלחת בת 48 בארות. לאחר השלמת הדגירה של תמיסת ה-DC הפועמת בבריכת OLP, הוסף 10 מיליליטר של מדיום נטול סרום ל-DCs. צנטריפוגה של התאים ב-300 פעמים G למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הרכיבו מחדש את התאים בחמישה מיליליטר של מדיום נטול סרום. הוסף 0.5 מיליליטר מתלה התאים לכל אחת מ -10 הבארות. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני למשך ארבעה ימים.

לאחר מכן, הסר 400 מיקרוליטר ממדיום התרבות מכל באר. הוסף 500 מיקרוליטר של מדיום טרי ללא סרום המכיל 100 יחידות למיליליטר כל אחת של IL-2 ו-IL-7 לכל באר. דגרו על התאים למשך יומיים-שלושה נוספים לפני שתגרו מחדש את התאים המוכנים במאגר OLP.

לפני גירוי מחדש, השג והקרין מקרופאגים צפקים של עכבר. התאם את ריכוז המקרופאגים לחמישה מיליון תאים למיליליטר של מדיום נטול סרום. שלב 10 מיקרוליטר ממלאי מאגר OLP עם שני מיליליטר של המקרופאגים הצפקיים המוקרנים לריכוז DMSO סופי של 0.5% בנפח.

השלם תמיסה זו עם 100 יחידות למיליליטר של גורם מגרה מושבת מקרופאגים עכברים. מלאו צלחת של 48 בארות ב-200 מיקרוליטר של תמיסת המקרופאג OLP-pool בכל באר. דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות.

לאחר מכן, שטפו בעדינות כל באר עם 200 מיקרוליטר של מדיום RPMI-0 מחומם מראש. תמיסת המקרופאגים תכיל הרבה חרוזים. לפני הוספת תאי CD8 T מוכנים לבריכת OLP, יש לבדוק את הצלחת תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שכל הבארות נקיות מחרוזים.

לאחר מכן, אסוף ואגד את תאי CD8+T המוכנים למאגר OLP המוכנים לגירוי מחדש. התאם את ריכוז תאי ה-T למיליון תאים למיליליטר במדיום נטול סרום המכיל 25 יחידות למיליליטר של IL-2, ו-50 יחידות למיליליטר של IL-7. הוסף מיליליטר אחד של תמיסת תאי T מאוגדת לכל באר המכילה מקרופאגים פועמים במאגר OLP.

תרבו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני במשך ארבעה ימים. לאחר מכן, הסר כ -400 מיקרוליטר מהמדיום מכל באר. הוסף לכל באר 500 מיקרוליטר של מדיום טרי ללא סרום המכיל 100 יחידות למיליליטר כל אחת של IL-2 ו-IL-7.

המשך את הדגירה באותם תנאים. לאחר שלושה עד ארבעה ימים, בדוק את התאים המגורים מחדש לתגובה מוגבלת של Qa-1 ספציפית למאגר OLP עם בדיקת נקודה חיסונית מקושרת לאנזים אינטרפרון-גמא. רענן את מדיום תאי CD8 + T כל שלושה עד ארבעה ימים בזמן ההמתנה לתוצאות.

בצע בדיקת ELISPOT עם מלאי הפפטידים המדולל כדי לקבוע אילו פפטידים מייצרים את הפרשת האינטרפרון-גמא המוגבלת Qa-1 הספציפית למאגר OLP. לבסוף, הערך סדרת פפטידים קטומה עם ELISPOT כדי לזהות את האפיטופ האופטימלי של Qa-1. בדיקת ELISPOT של אינטרפרון-גמא הראתה עלייה משמעותית בתאים יוצרי כתמים כאשר תאי CD8+T המגורים על ידי ספריית הפפטידים החופפת של MOG שולבו עם C1R.

תאי Qa-1b. זה הצביע על כך שתאי ה-T הגיבו לפפטידים הקשורים ל-Qa-1, וכי ה-MOG_pool הכילו אפיטופ קושר Qa-1 אחד או יותר. בדיקה נוספת בוצעה כדי לסנן את הפפטידים הבודדים בבריכה.

שלושה פפטידים הראו תגובות שהיו גדולות לפחות פי שלושה מהתגובה בנוכחות C1R. תאי Qa-1b ללא פפטידים. מבין אלה, הפפטיד עם התגובה הגדולה ביותר נבחר להערכה נוספת.

ספרייה של פפטידים קטומים המבוססת על פפטיד 15-mer המעניין הוערכה כדי לזהות את האפיטופ האופטימלי של Qa-1. האפיטופ יהיה באופן אידיאלי שמונה עד 10 מר, עם עדיפות לתשעה מר. יתר על כן, האפיטופ האופטימלי יראה תגובת אינטרפרון-גמא דומה או חזקה יותר מאשר פפטיד 15-mer.

הפפטיד הקטום של תשעה mer N-terminally מתאים בצורה הטובה ביותר לקריטריונים אלה, מה שהופך אותו לאפיטופ האופטימלי של Qa-1. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הבקרה החיסונית לגלות אפיטופים חדשים של Qa-1 לחקר ויסות חיסוני ברקמות אחרות, כמו הלבלב. אל תשכח, עבודה עם קרינה עלולה להיות מסוכנת ביותר.

על החוקרים לעקוב בקפדנות אחר המדיניות המוסדית ולקבל הכשרה מתאימה.