Name: הכנה של תאים לוקמיה לימפובלסטית חריפה העיקרית בשלבים שונים של מחזור התא על ידי צנטריפוגלי Elutriation (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: למד כיצד להפריד תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה לשלבים שונים של מחזור התא באמצעות צנטריפוגלי Elutriation. שיטה זו מאפשרת חקר השפעות תרופות נוגדות סרטן בהתאם לשלב התא.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי NIH CA109821 (כדי TCC). אנו מודים Beckman Coulter בנדיבות תקציבים כדי לכסות את עלויות הפרסום, לקבלת סיוע טכני בארצות ותפעול של מערכת elutriation. אנו מודים ד ר פרד Falkenburg למתן הראשית הראשונית בכל התרבויות.

הערה: פרוטוקול זה הותאם עבור ראשי B-כל התאים אשר נע בקוטר של 8 מיקרומטר (שלב G1) 13 מיקרומטר (שלבים G2/M). לפיכך, מהירויות צנטריפוגה ספציפיים, משאבת זרימה המחירים לא ייתכן החלים על תאים בעלי גודל שונה טווחים. ובכל זאת, הפרמטרים elutriation המתאים יכול להיות מוערך באמצעות המשוואה קצב שקיעת. תאים מתורבתים במדיום מוגדר ללא סרום כפי שמתואר 16 ב צפיפות מיטבית של 1-3 x 10 6 תאים למ"ל. פרט לאוסף של שברים מתנהל ב 4 ° C באמצעות צינורות מקורר קרח, נערכים כל השלבים בטמפרטורת החדר, לצנטריפוגה להגדיר ב- 20 ° C עם מקסימום של 24 מעלות צלזיוס
 1. הכנה של מאגר Elutriation וחומרים <ol><li>על מנת להפחית את הצליעה של תאים, להכין מאגר elutriation של האנק &#39; s מאוזנת תמיסת מלח (HBSS) עם פנול אדום בתוספת 2% סרום שור עוברית ( FBS), כדי להגן על התאים מלחץ מכני במהלך תהליך elutriation, ו 1.6 g/L 2-naphthol-6,8-דיסולפו dipotassium חומצת מלח (NDA), אשר הופך את הסביבה החיצונית תא אניון ומפחיתה את הצליעה.
	<ol><li>להוסיף 1.6 גר' NDA צינור חרוטי 50 מ ל.</li>
		<li>בתנאים סטריליים, להוסיף 35 מ של HBSS מתוך בקבוק 1 ליטר ל 50 מ ל צינור חרוטי המכיל NDA. מערבולת הצינור עד NDA יש התפרקה.</li>
		<li>באמצעות מסנן 0.2 µm, להעביר את NDA המומס לתוך צינור חרוטי סטרילי 50 מ ל. לאחר מכן להוסיף את NDA הנותרים 1 ליטר של HBSS.</li>
		<li>לבסוף, להוסיף 21 מ FBS HBSS הסופית בריכוז של 2% (v/v). 
		הערה: המאגר elutriation יכול להיות מוכן ומאוחסנים ב 4 ° C עד תאריך התפוגה של HBSS או עד שלא יהיה שינוי גדול ב- pH כמצוין על-ידי הצהבה של אינדקטור.</li>
	</ol></li> <li>תווית 50 מ ל צינורות חרוט עבור אוסף של שברים כך שיהיו צינורות בתווית לשטוף 1 ו-2 (W1, W2), שברים 1-20 (F1 - F20), ולהפסיק.
	<ol><li>מראש להירגע הצינורות האלה על הקרח לפני איסוף השברים.</li>
	</ol></li></ol> 2. הרכבה של מערכת Elutriation <ol><li>ראשון, התקן את מכלול strobe לתוך לצנטריפוגה כך כבל החשמל מוזנים אל מחוץ לתא באמצעות היציאה בצד שמאל. ודא המנורה פלאש strobe בחלקו הקדמי של החדר אז זה יעמדו בתור עם חלון צפייה לצנטריפוגה נסגר.
	<ol><li>המאבטחים את מכלול במקום קודם הידוק ברגי פיליפס שני לתוך החורים שני בחלק העליון של הסוגריים כל, ואז על ידי הידוק את מכשיר העינויים בתחתית הכן לכל.</li>
		<li>חברו את כבל החשמל ליציאת כוח strobe בחלק האחורי לצנטריפוגה.</li>
	</ol></li> <li>הבא, הגדר הרוטור ישר למטה על גבי ה-hub נסיעה צנטריפוגה ולאבטח עם מפתח ברגים hex ידית T. 
	הערה: אם לצנטריפוגה נחוצה למטרות הלא-elutriation, את מכלול strobe ו הרוטור יכול להישמר בין פועל בצנטריפוגה.</li>
	<li>ברגע הרוטור מאובטחת, הנח את מכלול שחרור מהיר המכיל את elutriation קאמרית, מונה איזון, סיבוב חותם האסיפה, צלחת הרכבה לתוך הרוטור.
	<ol><li>לדחוף למטה באופן שווה עם יד אחת על תא elutriation, היד השנייה על האיזון מונה עד המנעולים של הרוטור הצמד לתוך החורים על הצלחת הרכבה.</li>
		<li>לבסוף, חבר את כבל עגינת על-ידי הצבת את הסיכה על צד אחד של הכבל לתוך החור בהרכבה חותם מסתובב ואבטחת את eyehole בצד השני של הכבל עם אחד הברגים פיליפס (מוזכר 2.1.1) שבכן-o בצד שמאל נ התא.</li>
	</ol></li> <li>הבא, להרכיב מערכת הזרימה באמצעות משאבה מהירות משתנה, אבובים למאגר משאבת לתוך elutriation קאמרית ולאסוף מאגר זורם החוצה מהחדר elutriation.
	<ol><li>הוספה הצנרת קלט בגודל 16 מגיע המשאבה מהירות משתנה באמצעות היציאה בחלק העליון השמאלי של החדר צנטריפוגה כך הוא נכנס אל החדר.</li>
		<li>לצרף מתאים לסוף חינם של הצנרת קלט ולהוסיף ההתאמה לתוך החור קלט בצד מכלול חותם מסתובב.</li>
		<li>הוספה בגודל 16 פלט אבובים דרך היציאה ולחבר אותו צינור העברה בחלק העליון של סיבוב חותם האסיפה. 
		הערה: מערכת הזרימה יכולה גם להישאר התאספו בין פועל elutriation.</li>
	</ol></li> <li>לבסוף, להפעיל לצנטריפוגה ולהגדיר את המפרט הדרוש לניסוי.
	<ol><li>שינוי הרוטור מזהה</li>
		<li>אם לצנטריפוגה דורש קלט הזמן, להגדיר עבור 2 h, וזה די והותר להשלים elutriation לרוץ.</li>
		<li>מוגדר בטמפרטורה של 20 ° C עם זמני מקסימום 24 ° C.</li>
		<li>להגדיר את ההאצה על מקס והאטה עבור לאט.</li>
		<li>לבסוף, הגדר את המהירות לג'י x 867</li>
	</ol></li></ol> 3. הטרמה של מערכת Elutriation <ol><li>קודם כדי לחטא את מערכת elutriation, למקם את הצנרור מאגר מים לתוך בקבוק 500 מ"ל פלסטיק המכילה 5% מלבין ולמקם את צינורות פלט לתוך 1 ליטר פלסטיק פסולת בקבוק ריק.
	<ol><li>להפעיל את המשאבה להגדיר את המהירות עד 25 mL/min ומאפשרים לזרום לאורך כל הדרך מערכת elutriation עד זה נשאבים מתוך הצינור פלט לתוך הבקבוק פסולת המלבין 5%-</li>
		<li>תפעיל לצנטריפוגה ולא לאפשר לו לבוא המרבי שנקבע מהירות (867 x g) כדי לשחרר בועות, backpressure.</li>
		<li>עוצרים לצנטריפוגה. ברגע הרוטור הפסיק סיבוב, פותחים את המכסה ולבדוק את התא עבור הדלפות.</li>
		<li>אם אין דליפות, לתת את הפתרון אקונומיקה זרימה דרך המערכת לפחות 5 דק</li>
	</ol></li> <li>הבא, לרוקן את המערכת עם מים בלוק כמו אקונומיקה יכול להוביל להיווצרות פוחת משקעים מתוך המאגר elutriation אשר עשויים להוביל הצליעה של התאים, כמו גם לגרום נזק לתאים.
	<ol><li>המקום הצנרת מאגר מים לתוך בקבוק 1 ליטר של בלוק מים ולאפשר את המים דרך במשך לפחות 10 דקות</li>
	</ol></li> <li>לאחר שטיפה עם מים, להציג את מאגר elutriation לתוך המערכת. להשתמש בבקבוק זכוכית 150 מ אשר היה בלוק ליצירת מאגר עבור מאגר elutriation ותאים.
	<ol><li>להוסיף 100 מ של elutriation מאגר של הבקבוק ולהזיז את המאגר אבובים על בקבוק הזכוכית כך ברכבת התחתית נמצאת בתחתית מאוד.</li>
		<li>לאפשר את המאגר לזרום דרך המערכת כדי. להוריד את המים ומתחילים לצנטריפוגה.</li>
		<li>פעם בקבוק לאגירת כמעט ריקה המים התרוקן לגמרי מחוץ למערכת, להעביר את הפלט אבובים מהבקבוק פסולת למאגר המים כך המאגר להיות ממוחזר דרך המערכת.</li>
	</ol></li> <li>לבסוף, להתאים את חלון צפייה כך תא elutriation ניתן לראות את המהירות הנוכחית.
	<ol><li>העיתונות strobe מנורת חשמל כפתור בצד החיצוני של צנטריפוגה כך מדליק המנורה. להפוך את k elutriationנוב גם בצד החיצוני של צנטריפוגה עד הסוף שמאלה.</li>
		<li>בזמן מביט מבעד לחלון הצפייה, לאט סיבוב הידית שמאלה עד תא elutriation מגיע לתוך נוף ואור strobe הוא בזמן עם הסיבוב של הרוטור. 
		הערה: מערכת elutriation יכול להיות שמאל במצב זה עד התאים הם מוכנה.</li>
	</ol></li></ol> 4. הכנת המדגם תא <ol><li>ספירת תאים, מדיום הגידול בתוך 300 עד 400 מיליון aliquot לתוך צינורות חרוט מספר 50 מ ל. ספין למטה התאים ב g ואורך 1210 x עבור מינימלית 3</li>
	<li>לשאוב את צמיחת תאים resuspend ומדיה 25 מ של מאגר elutriation על ידי pipetting למעלה ולמטה בעדינות.</li>
	<li>על מנת להפחית תא clumping, מסירה תאים פעמיים דרך 25 להעריך את המחט.
	<ol><li>באמצעות מזרק 10 מ"ל לצייר את התאים ואז לצרף מחט בקוטר 25, תעביר את התאים דרך אל תוך קיר של צינור חרוטי סטרילי 50 מ ל. חזור על פעולה זו עד 25 מ ל כל עברו דרך המחט.</li>
		<li>לקבל מזרק עם מחט חדשה וחזור על התהליך לעיל פעם. 
		התראה: מחטי מזרקים להניחה במיכלים שרפ. 
		הערה: זה קריטי התאים יידחפו דרך המחט מיד לפני להם היכרות עם מערכת elutriation לשמור על התא clumping למינימום.</li>
	</ol></li></ol> 5. הקדמה של דגימות התאים לתוך המערכת Elutriation ואת אוסף של שברים <ol><li>להציג דגימת תאים לתוך המערכת elutriation על ידי מזיגת המדגם תא לתוך הטנק מאגר הכולל מאגר elutriation הנותרים מיחזור באמצעות .
	<ol><li>לתת את התאים נכנסים למערכת ולהגיע שיווי משקל בתוך תא elutriation. 
		הערה: תהליך זה ייקח בערך 5 דקות, ניתן לעקוב אחר התקדמות על-ידי צפייה התאים כפי שהם להיכנס לתא באמצעות חלון הצפייה. כדי להבטיח שכל התאים בבית הבליעה, קח טיפה של eluent, מניחים על משטח זכוכית, ולהציג תחת מיקרוסקופ. אם המדגם הוא חינם של תאים שלמים, זה מאשר את השמירה שלהם בתא.</li>
	</ol></li> <li>להתחיל באיסוף שברים ברגע כל התאים נכנסו אל החדר ואין גבול שונות בחלק הרחב ביותר של התא שבו התאים נמצאים בשיווי משקל.
	<ol><li>בגין על-ידי העברת הצינור פלט הצינור חרוט 50 מ ל תווית W1. לאסוף 50 מ של elutriation למאגר הזה שבר, מקפיד לשמור על מיכל אגירה, לחדש באמצעות מאגר elutriation בעת הצורך. 
		הערה: על מנת לוודא כי כל התאים נכנסו לתוך המערכת, לאפשר את טנק המאגר להפוך כמעט ריק לפני מילוי המאגר בפעם הראשונה. אחרי רעיון הראשון לא יהיה צורך לחכות המאגר להפוך כמעט ריק. גם, לא פעם לאפשר לטנק להיות ריק כמו פעולה זו תיצור בועות ולחץ בגב במערכת.</li>
		<li>לאחר 50 מ ל שנגבה עבור W1, בו זמנית לשנות את המהירות ל 821 x g, להעביר צינור פלט כדי הצינור חרוט עם התווית W2, לאסוף 50 מ ל יותר במהירות הזאת.</li>
		<li>ממשיכים לשנות את המהירות ואיסוף השברים כמצוין בטבלה 1. ודא כי יש מדיה במאגר המים טנק ולשמור את צינורות חרוט על קרח בכל עת. לבסוף, להתאים את חלון צפייה על ידי לאט הופכים את הידית ימינה כפי מקטין המהירות.</li>
		<li>לאחר שברים 20 כל נאספו, תפסיק לצנטריפוגה ולאסוף 50 מ ל צינור חרוט עם התווית להפסיק.</li>
	</ol></li></ol> 6. שטיפה של מערכת Elutriation <ol><li>לאחר לצנטריפוגה הפסיק לחלוטין מיושרות המערכת על ידי מכניס את הצינור מאגר מים 1 ליטר בקבוק מים בלוק ולתחנת רכבת התחתית בקווינסוואי פלט לבקבוק פסולת.
	<ol><li>להפעיל את המשאבה מהירות עד 50 mL/min ולאפשר את המים לרוץ דרך המערכת עד זה תיגמר.</li>
	</ol></li> <li>להפעיל את המשאבה, הסר את הצינור קלט ופלט של מכלול שחרור מהיר, להוציא את ה-pin של הכבל עגינת.
	<ol><li>הסר מכלול שחרור מהיר של הרוטור. 
		הערה: תלוי מה לצנטריפוגה ישמש עבור, מערכת elutriation יכול עכשיו להיות יושארו כפי. אחרת, מכלול שלם ניתן לקחת לפי סדר מול כמתואר לעיל. תא elutriation יכול להיות הסרת מכלול שחרור מהיר וניקה בין פועל באמצעות אמבט מים אולטרה סאונד. פעולה זו מסירה את הלכלוך ואת מזהמים מהקיר קאמרית אשר עלול להשפיע לרעה פועל מאוחר יותר.</li>
	</ol></li></ol> 7. ניתוח של שברים ואוסף של G1 או בריכות G2/M.
 הערה: כדי להדגים את היעילות של elutriation, ניתוח שבר כל ספירת תאים, תא בקוטר של תוכן ה-DNA, בריכות נוצרים תאים בשלבים G1 או G2/M עבור ניתוחים immunoblot, כפי שמתואר נציג תוצאות. סעיף פרוטוקול זה יתאר כיצד ליצור בשלוליות להכין אותם לשימוש ניסיוני.
<ol><li>לסובב כל שבר ב g x 2000 דקות 5-4 ° C ו לשאוב את מאגר elutriation.</li>
	<li>שברים לשלב ביחד על מנת לקבל בריכה שלב G1 וגם בריכה שלבים G2/M.
	<ol><li>עבור G1 שלב הבריכה, resuspend שברים אשר נאספו בטווח מהירות של 788 x g 661 x גרם (F1 - F5) סך 1 מ"ל של פוספט תמיסת מלח מאגר (PBS), העברת צינור חרוטי 15 מ"ל. עבור מאגר שלבים G2/M, resuspend שברים אשר נאספו בטווח מהירות של 387-g ו- g x 333 (F17 - F20).</li>
		<li>ספין למטה תאים ב g x 2000 דקות 5-4 ° C ו לשאוב את PBS.</li>
	</ol></li> <li>Resuspend בתאים 10 מ"ל של צמיחה מדיה ולקחת ספירה תא.</li>
	<li>סעו aliquot של תוכן באמצעות propidium יודיד מכתים בכל בריכה שינותח לדנ א, לזרום cytometric ניתוח 15. 
	הערה: השארית בכל בריכה יכול לשמש לניסויים נוספים-</li>
</ol>

<ol><li>Beach, D., Piper, M., Shall, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+newly-initiated+DNA+from+the+early+S+phase+of+the+synchronous+eukaryote%2C+Physarum+polycephalum%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+cell+res%22%5BJournal%5D)">Isolation of newly-initiated DNA from the early S phase of the synchronous eukaryote, Physarum polycephalum.</a> Exp cell res. 129, 211-221 (1980).</li>
<li>Sevcikova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Completion+of+cell+division+is+associated+with+maximum+telomerase+activity+in+naturally+synchronized+cultures+of+the+green+alga+Desmodesmus+quadricauda%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Completion of cell division is associated with maximum telomerase activity in naturally synchronized cultures of the green alga Desmodesmus quadricauda.</a> FEBS letters. 587, 743-748 (2013).</li>
<li>Rosner, M., Schipany, K., Hengstschlager, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merging+high-quality+biochemical+fractionation+with+a+refined+flow+cytometry+approach+to+monitor+nucleocytoplasmic+protein+expression+throughout+the+unperturbed+mammalian+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+protoc%22%5BJournal%5D)">Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle.</a> Nat protoc. 8, 602-626 (2013).</li>
<li>Banfalvi, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21755438">Overview of cell synchronization.</a> Meth mol biol. 761, 1-23 (2011).</li>
<li>Langan, T. J., Rodgers, K. R., Chou, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+Mammalian+Cell+Cultures+by+Serum+Deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+mol+biol%22%5BJournal%5D)">Synchronization of Mammalian Cell Cultures by Serum Deprivation.</a> Meth mol biol. 1524, 97-105 (2017).</li>
<li>Dulla, K., Margalef, A. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21755441">Large-Scale Mitotic Cell Synchronization.</a> Meth mol biol. 1524, 65-74 (2017).</li>
<li>Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+control+in+the+early+embryonic+development+of+aquatic+animal+species%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+biochem+physiol+Toxicol%2Cpharmacol+CBP%22%5BJournal%5D)">Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species.</a> Comp biochem physiol Toxicol,pharmacol CBP. 178, 8-15 (2015).</li>
<li>Banfalvi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+synchronization+of+animal+cells+and+nuclei+by+centrifugal+elutriation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+protoc%22%5BJournal%5D)">Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrifugal elutriation.</a> Nat protoc. 3, 663-673 (2008).</li>
<li>Grosse, J., Meier, K., Bauer, T. J., Eilles, C., Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+separation+by+countercurrent+centrifugal+elutriation%3A+recent+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Prep+biochem%2Cbiotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell separation by countercurrent centrifugal elutriation: recent developments.</a> Prep biochem,biotechnol. 42, 217-233 (2012).</li>
<li>Smith, J., Manukyan, A., Hua, H., Dungrawala, H., Schneider, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+mol%22%5BJournal%5D)">Synchronization of Yeast.</a> Meth mol. 1524, 215-242 (2017).</li>
<li>Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+anti-mitotic+drugs+kill+cancer+cells%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+cell+sci%22%5BJournal%5D)">How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?</a> J cell sci. 122, 2579-2585 (2009).</li>
<li>Manchado, E., Guillamot, M., Malumbres, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killing+cells+by+targeting+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+death+diff%22%5BJournal%5D)">Killing cells by targeting mitosis.</a> Cell death diff. 19, 369-377 (2012).</li>
<li>Komlodi-Pasztor, E., Sackett, D., Wilkerson, J., Fojo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitosis+is+not+a+key+target+of+microtubule+agents+in+patient+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Clinic+oncol%22%5BJournal%5D)">Mitosis is not a key target of microtubule agents in patient tumors.</a> Nature reviews. Clinic oncol. 8, 244-250 (2011).</li>
<li>Furst, R., Vollmar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+perspective+on+old+drugs%3A+non-mitotic+actions+of+tubulin-binding+drugs+play+a+major+role+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Die+Pharmazie%22%5BJournal%5D)">A new perspective on old drugs: non-mitotic actions of tubulin-binding drugs play a major role in cancer treatment.</a> Die Pharmazie. 68, 478-483 (2013).</li>
<li>Kothari, A., Hittelman, W. N., Chambers, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Cycle-Dependent+Mechanisms+Underlie+Vincristine-Induced+Death+of+Primary+Acute+Lymphoblastic+Leukemia+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+res%22%5BJournal%5D)">Cell Cycle-Dependent Mechanisms Underlie Vincristine-Induced Death of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells.</a> Cancer res. 76, 3553-3561 (2016).</li>
<li>Nijmeijer, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+primary+human+lymphoblastic+leukemia+cells+in+the+absence+of+serum+or+hematopoietic+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+hematol%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of primary human lymphoblastic leukemia cells in the absence of serum or hematopoietic growth factors.</a> Exp hematol. 37, 376-385 (2009).</li>
<li>Knudsen, E. S., Wang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+mechanisms+for+the+inhibition+of+E2F+binding+to+RB+by+cyclin-dependent+kinase-mediated+RB+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Dual mechanisms for the inhibition of E2F binding to RB by cyclin-dependent kinase-mediated RB phosphorylation.</a> Mol Cell Bio. 17, 5771-5783 (1997).</li>
<li>Malumbres, M., Barbacid, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cyclin-dependent+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+biochem+sci%22%5BJournal%5D)">Mammalian cyclin-dependent kinases.</a> Trends biochem sci. 30, 630-641 (2005).</li>
<li>Liang, H., Hittelman, W., Nagarajan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitous+expression+and+cell+cycle+regulation+of+the+protein+kinase+PIM-1%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+biochem+biophys%22%5BJournal%5D)">Ubiquitous expression and cell cycle regulation of the protein kinase PIM-1.</a> Arch biochem biophys. 330, 259-265 (1996).</li>
<li>Sen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+gene+encoding+a+tRNA+synthetase-like+protein+is+enhanced+in+tumorigenic+human+myeloid+leukemia+cells+and+is+cell+cycle+stage-+and+differentiation-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Expression of a gene encoding a tRNA synthetase-like protein is enhanced in tumorigenic human myeloid leukemia cells and is cell cycle stage- and differentiation-dependent.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 94, 6164-6169 (1997).</li>
<li>Ly, T., Endo, A., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+the+response+to+cell+cycle+arrests+in+human+myeloid+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of the response to cell cycle arrests in human myeloid leukemia cells.</a> eLife. 4, (2015).</li>
</ol>

יעקב לוי Kothari נמצאת כרגע המחלקה של התא וביולוגיה מולקולרית בבית החולים סנט ג'וד לילדים מחקר.

תארנו שיטה להשגת ראשי כל התאים בשלבים שונים של מחזור התא באמצעות להרדים. בתנאים אופטימליים אוכלוסיה בעיקרו של דבר טהור של תאים בשלב G1 ואת אוכלוסיה מועשר של תאים בשלבים G2/M יכול בקלות להשיג תשואה מעולה, התאים מועשרים מאוד בשלב זה גם ניתן להשיג אם רצונך בכך. התוצאות המובאות כאן התקבלו באמצעות ראשי אחד שכל תרבות (ליתר דיוק, כל-5) ותוצאות במהותה זהה הושגו עם תרבות עצמאית, כל-215. בנוסף, כל שאר ראשי בכל התרבויות בדק את תאריך יש טווחים צפיפות דומה במהלך צמיחה אסינכרוני, צפויה לבצע באופן דומה כאשר נתון...

תאים בתרבית בדרך כלל לגדול באופן אסינכרוני, תאים בודדים נמצאים בשלבים שונים של מחזור התא. אורגניזמים מסוימים ייתקלו מחזורי תאים סינכרונית באופן טבעי או ניתן לסנכרן באמצעות ספציפית לגירויים פיזיולוגיים. לדוגמה, גרעינים בתוך plasmodia ענק התבנית רפש Physarum polycephalum לחלק אופנה מאוד סינכרונית1, וכן תאים של האצות הירוק שניתן לסנכרן Desmodesmus quadricauda , לסירוגין כהה תקופות2. בעוד אורגניזמים כגון מציעים תכונות ניסויית ייחודית, הם מודל כראוי המורכבות של תאי יונקים. היכולת לסנכרן באופן מלאכותי בתרבית של תאים אוכלוסיות כבר מרכזי לקידום ההבנה שלנו של מחזור התא רגולציה, הבסיס המולקולרי של מחזור התא מחסומים. שיטות נפוצות כוללות מניעת סרום, בלוק כימי, שחרור, או ניצול מאפיינים פיזיים3,4. נסיגה של סרום גורם לעתים קרובות תאים להזין תרדמה ולאחר התוספת מחדש של סרום מקדם החזרה מחזור התא לתוך שלב G15. מעכבי כימי כוללות סוכני כגון עודף תימידין הידרוקסיוראה החוסמות תאים על הגבול G1/S, או מעכבי microtubule אשר בדרך כלל לעצור התאים ב-3,שלב4מ'. גישות לנצל תכונות פיזיות כוללות mitotic לנער את אשר יכול לשמש כדי להעשיר תאים mitotic מכיוון שהן פחות חסיד מאשר לאטמוספרה תאים6. אולם, כל הטכניקות הללו יש החסרונות פוטנציאל. לדוגמה, לא כל סוגי תאים לשמור על הכדאיות העדר של סרום או הנוכחות של מעכבי כימי, וכן את התשואה של התאים לאחר mitotic לנער-לא מוגבל ללא סינכרון מוקדמת עם מעכבי mitotic.
למעט בתחילת מחזורי תאים עובריים, שבו תאים בהדרגה להקטנת גודל כפי הם מחלקים7, רוב התאים לקדם באמצעות המחזור עוברים שלבי גידול ולהיות גדול יותר. מאפיין זה הוא לנצל את הטכניקה של counterflow צנטריפוגלי elutriation (להרדים), אשר יכול לשמש כדי להפריד בין תאים שונות בגודל, ומכאן במחזור התא שלב8,9. במהלך. להרדים, התאים נמצאים תחת ההשפעה של שני כוחות מנוגדים: כוח צנטריפוגלי, אשר כוננים התאים מחוץ לציר הסיבוב, והמהירות נוזל (counterflow), אשר מניע את התאים לכיוון לציר הסיבוב (איור 1). תאים במחסנית elutriation להגיע למשרת שיווי משקל שבו כוחות אלה הם שווים. גורמי מפתח מכתיב את מיקום שיווי משקל הם התא קוטר וצפיפות. כמו הזרם גדל קצב של הפתרון מאגר כוח גרירה counterflow עולה הדיסקה, נוצר שיווי משקל חדש, גרימת שינוי בעמדה של תאים בתוך החדר. כל התאים יוזזו לכיוון היציאה קאמרית, וכתוצאה מכך הקטנים עוזב את החדר קודם, ואילו התאים גדול יותר להישאר בתוך החדר עד שער counterflow הוא גדל מספיק כדי לקדם את היציאה שלהם. ניתן לאסוף תאי בריחה תא elutriation עם עליות רצופות קצב counterflow בחלקים ספציפיים ומכיל כל השבר תאים ברצף הולך וגובר גדלים. במקום ניצוח elutriation עם עליות מצטבר counterflow קצב, ירידות רציפים כוח צנטריפוגלי על ידי הפחתת מהירות צנטריפוגה תוכלו להשיג את אותה תוצאה. התהליך של elutriation דורש אופטימיזציה בהתאם סוג התא, מאגר elutriation המועסקים מנגנון ספציפי משמש. הקצב של שיקוע של תאים בתנאים אלה מתואר על ידי חוק סטוקס מיטב: SV = [d2(ρp- ρמ') / 18η] .ω2r, איפה SV = מהירות שיקוע; d = קוטר של החלקיק; Ρp = צפיפות של החלקיק; Ρm = צפיפות של המאגר; Η = צמיגות של המאגר; Ω = מהירות זוויתית של הרוטור; ו- r = רדיאלי המיקום של החלקיק. לפיכך, SV הוא יחסי התא קוטר וצפיפות, מאז קוטר הוא בחזקת השני, תורם יותר משמעותית מאשר צפיפות אשר הוא בדרך כלל קבוע דרך מחזור התא.
יתרון חשוב של להרדים הוא תאים לא נתון את התנאים הקשים של טיפול כימי או מחסור תזונתי, ניתן לשחזר בעיקרו בשלוות נפש מעולה כממוצע. דרישה הוא בתאים עוברים עלייה משמעותית בקוטר לפחות 30%, כפי שהם חוצים את מחזור התא. החיסרון העיקרי הוא העלות של צנטריפוגה מיוחדים, רוטור, אביזרים. למרות זאת, היכולת להכין תאים מועשר בשלבים מסוימים מחזור התא על-ידי. להרדים במידה רבה הנחתה את מחזור התא במחקר האורגניזמים שמרים בתרבית של תאים9,10. יתר על כן, ההתקדמות מתרחבים שימושים הפרדת תאים מן בריא לעומת רקמה סרטנית, ההפרדה של סוגי תאים שונים בתערובות הטרוגניות ולאחר לייצור של סוגי תאים ספציפיים חיסוני9.
האינטרס העיקרי שלנו כבר בהבנת מנגנון הפעולה של microtubule מיקוד סוכנים (MTAs) כגון וינקה אלקלואידים, taxanes. תרופות אלו נחשבו לפעול באופן בלעדי מיטוזה, חסימת צירים microtubule פונקציה11,12, אך לאחרונה העדויות שהם גם עשויים למקד לאטמוספרה microtubules13,14. לאחרונה דיווחנו כי ראשי לוקמיה לימפובלסטית חריפה (ALL) תאים עוברים מוות בכל שלב G1 או ב- M שלב כאשר שטופלו vincristine ו MTAs אחרים באופן תלוי-מחזור התא15. היכולת להפריד בין כל התאים לשלבים שונים מחזור התא על ידי להרדים היה אינסטרומנטלי להגיע מסקנה זו. במאמר זה, אנו מתארים את הפרטים הטכניים, מציעים טיפים מעשיים עבור היישום של. להרדים הכנת ראשי כל התאים בשלבים שונים של מחזור התא.

<table><tbody><tr><td>תמיסת מלח מאוזנת של הנקס</td><td>לונזה</td><td>10-508Q</td><td>בקבוק 1 ליטר</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי פלוס</td><td>Atlas Biologicals</td><td>FP-0500-A</td><td>בקבוק 500 מ"ל</td></tr><tr><td>2-napthol-6,8-חומצה דיסולפונית מלח דיפוטסיום</td><td>Acros Organics</td><td>212-672-4</td><td>100 גרם אבקה</td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות קונציאליים</td><td>Denville Scientifics</td><td>C1062-P</td><td>500/מארז</td></tr><tr><td>PES ממברנה 0.22 ומיקרו; m יחידת סינון</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>250/חבילה</td></tr><tr><td>Avanti J-26S XPI עם Elut. ללא IVD - 50/60 הרץ, 200/208/240V</td> צנטריפוגה <td>בקמן קולטר</td><td>B14544</td><td>תואמת למערכת אלוטריאציה</td></tr><tr><td>JE 5.0 ערכת רוטור</td><td>בקמן קולטר</td><td>356900</td><td>ערכת רוטור הכוללת את הרוטור, מפתח משושה ידית T, מכלול השחרור המהיר (ללא תא הפליטה), כבל העיגון ותא מכלול ה-strobe</td></tr><tr><td>, סטנדרטי, 4 מ"ל, "A"</td><td>Beckman Coulter</td><td>356943</td><td>תא אלוטריאציה סטנדרטי&nbsp;</td></tr><tr><td>Masterflex L/S ראש משאבת עומס קל</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07518-10</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S כונן במהירות משתנה</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07528-10</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex BioPharm צינורות משאבת סיליקון מרפא פלטינה, L/S 16</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-96420-16</td><td></td></tr><tr><td>25 G x 1.5 מחט Precision Glide</td><td>BD</td><td>305127</td><td>סטריליות, מחטים חד פעמיות</td></tr><tr><td>10 מ"ל Luer-Lok מזרק</td><td>BD</td><td>309604</td><td>מזרקים סטריליים לשימוש חד פעמי</td></tr><tr><td>Vi-Cell XR</td><td>בקמן קולטר</td><td>383556</td><td></td></tr><tr><td>PI/RNase מאגר צביעה</td><td>BD Pharmingen</td><td>550825</td><td>propidium iodide/RNase מאגר צביעה</td></tr><tr><td>ציקלין B1 (GNS1) עכבר חד-שבטי נוגדן IgG</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-245</td><td></td></tr><tr><td>cyclin D1 (DCS-6) נוגדן IgG חד-שבטי</td><td>עכבר סנטה Cruz Biotechnology</td><td>sc-20044</td><td></td></tr><tr><td>P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR ארנב נוגדן חד שבטי</td><td>טכנולוגיית איתות תאים</td><td>8516s</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (14C10) נוגדן חד שבטי ארנב</td><td>טכנולוגיית איתות תאים</td><td>2118s עיזים</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר IgG (H+L)-HRP מצומד</td><td>BioRad</td><td>170-6516</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד ארנב IgG (H+L)-HRP מצומד</td><td>BioRad</td><td>170-6515</td><td></td></tr></tbody></table>

הכנה של תאים לוקמיה לימפובלסטית חריפה העיקרית בשלבים שונים של מחזור התא על ידי צנטריפוגלי elutriation

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

היכולת לסנכרן את התאים כבר מרכזי לקידום ההבנה שלנו של מחזור התא רגולציה. טכניקות נפוצות המועסקים כוללים קיפוח סרום; כימיקלים אשר לעצור תאים בכל שלבי מחזור התא שונים; או השימוש mitotic לנער-off המנצלת שדבקו מופחת. אולם, כל אלה יש חסרונות. לדוגמה, סרום הרעבה עובד היטב עבור תאים נורמליים, אבל פחות טוב של תאים סרטניים עם מחזור התא פרוץ המחסומים בשל אובדן משתיק קול ההפעלה או גידול אונקוגן. באופן דומה, אוכלוסיות תאים טיפול כימי יכול הנמל נזק שיכרון ולהראות שינויים הקשורות במתח. טכניקה אשר עוקף בעיות אלה הוא counterflow elutriation צנטריפוגליות (להרדים), שבו תאים נחשפים שני הכוחות המנוגדים, כוח צנטריפוגלי, מהירות נוזלים, כשהתוצאה היא ההפרדה של תאים על בסיס גודל וצפיפות. מאז תאים לקדם באמצעות המחזור בדרך כלל להגדיל, להרדים יכול לשמש כדי להפריד בין תאים לשלבים שונים של מחזור התא. כאן אנו מיישמים את הטכניקה הזו לתאים העיקרי לוקמיה לימפובלסטית חריפה. בתנאים אופטימליים, אוכלוסיה בעיקרו של דבר טהור של תאים בשלב G1 ואת אוכלוסיה מועשר של תאים בשלבים G2/M ניתן להשיג תשואה מעולה. אוכלוסיות תאים אלה מתאימים באופן אידיאלי עבור לימוד תלויי-מחזור התא מנגנוני הפעולה של תרופות נגד סרטן, יישומים אחרים. אנחנו גם להראות כיצד שינויים הליך סטנדרטי יכול לגרום בביצועים שיוצרת ולדון את המגבלות של הטכניקה. המתודולוגיה מפורט שהוצג צריך לאפשר יישום וחקירה של הטכניקה סוגים אחרים של תאים.

ראשית כל התאים (3-4 x 108) היו נתון elutriation צנטריפוגלי ונאספים שני שברים שטיפת ושברים הראשי עשרים, כמפורט בפרוטוקול. טבלה 1 מציגה את הנתונים נציג איפה המספר הכולל של תאים כל שבר, כמו גם את מהירות הרוטור המתאימים מוצגים. בסך הכל התשואה היה בדרך כלל מעל 80%. מדידה של התא קוטר בחלקים בודדים אישר את קוטר תא גדל עם קידום elutriation (איור 2). תוצאות אלו מייצגים ממוצעים של שני האישושים עצמאית ומשקפים רמה גבוהה של נתונים הפארמצבטית. שברים הבא היו נתונ...

פרוטוקול זה מתאר את השימוש elutriation צנטריפוגלי כדי להפריד בין תאים לוקמיה לימפובלסטית חריפה העיקרי לשלבים שונים של מחזור התא.

הכנה של תאים לוקמיה לימפובלסטית חריפה העיקרית בשלבים שונים של מחזור התא על ידי צנטריפוגלי Elutriation

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

המטרה הכוללת של הליך זה, היא לבודד תאים לשלבי מחזור תאים שונים באמצעות השפכה צנטריפוגלית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הטיפולים בסרטן. מכיוון שבידוד התאים לשלבים נפרדים, מאפשר חקירה של השפעות תלויות פאזה של תרכובות אנטי סרטניות.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת הפרדת תאים לשלבים ספציפיים באמצעות תכונות פיזיקליות, ולא הפרעות כימיות. כדי להתחיל את הניסוי, התקן את מכלול ה-strobe לתוך הצנטריפוגה כך שכבל החשמל מוזן מהתא דרך היציאה משמאל. כוונן את הבזק הבזק lamp כך שיתיישר עם viewחלון, כאשר הצנטריפוגה סגורה.אבטח את המכלול במקומו, על ידי הידוק שני ברגי ראש פיליפס, בחלק העליון של כל תושבת. ואז על ידי הידוק ברגי האגודל בתחתית התושבת. חבר את כבל החשמל ליציאת החשמל המהבהבת, הממוקמת בחלק האחורי של הצנטריפוגה.לאחר מכן, הנח את הרוטורים ישר כלפי מטה על רכזת הנעת הצנטריפוגה, ואבטח אותו היטב עם מפתח משושה ידית T. לאחר מכן, הנח את המכלול המכיל את תא הפליטה, איזון נגד, מכלול האיטום המסתובב ולוחית הרכבה על הרוטור. דחוף כלפי מטה באופן שווה, הנח יד אחת על תא הפליטה, ואת היד השנייה על האיזון, עד שהברגים ברוטור ייכנסו למקומם.הנח את הסיכה, הממוקמת בקצה אחד של הכבל, לתוך החור במכלול האיטום המסתובב. ואבטח את חור העין, בקצה השני, עם אחד מברגי ראש הפיליפס, המוצמד לתושבת כדי לחבר את כבל העיגון. כדי להרכיב את מערכת הזרימה, כדי לשאוב חיץ לתוך ומחוץ לתא הפליטה, חבר צינורות בגודל 16 למשאבה במהירות משתנה.הכנס קצה חופשי אחד של צינור זה דרך יציאה בפינה השמאלית העליונה של תא הצנטריפוגה, כך שהוא ייכנס לתא. חבר אביזר לקצה החופשי של צינור זה, ולאחר מכן הכנס את האביזר לחור הכניסה של מכלול האיטום המסתובב. לבסוף, הכנס את צינור הפלט, דרך יציאה, כדי לחבר אותו לצינור ההעברה בחלק העליון של מכלול האיטום המסתובב.לאחר הרכבת מערכת השטיפה, יש לעקר אותה על ידי הנחת הקצה החופשי השני של צינור הכניסה לבקבוק של 500 מיליליטר, מלא באקונומיקה של 5%. והנחת צינור הפלט לבקבוק פסולת ריק של ליטר אחד. לאחר מכן, הפעל את המשאבה ואפשר לאקונומיקה לזרום כל הדרך דרך מערכת הפליטה, עד שהיא נשאבת החוצה לבקבוק האשפה.כעת, הפעל את הצנטריפוגה ואפשר לה להגיע למהירות המקסימלית המיועדת כדי לשחרר בועות ולחץ אחורי. לאחר הגעה למהירות שנקבעה, עצור את הצנטריפוגה. לאחר שהרוטור נעצר לחלוטין, פתח את המכסה ובדוק את החדר לאיתור נזילות.לאחר מכן, באופן דומה, כפי שתואר קודם לכן, העבירו מים סטריליים דרך המערכת למשך 10 דקות. לאחר שטיפה במים, החלף את מאגר המים בבקבוק זכוכית סטרילי מלא ב-100 מיליליטר של מאגר פליטה. הנח את צינור הכניסה לבקבוק זה, כך שיהיה בתחתיתו.הפעל את הצנטריפוגה ואפשר למאגר לזרום דרך המערכת. לאחר שבקבוק המיכל קרוב לריק, והמים נשטפים במלואם מהמערכת, העבר את צינור הפלט מבקבוק הפסולת למאגר כך שהמאגר ימוחזר ברציפות דרך המערכת. לבסוף, הפעל את ה-strobe lamp, וסובב את כפתור הביטוי לקצה השמאלי.כעת, כוונן את viewחלון על ידי סיבוב איטי של הכפתור ימינה, כך שתא הפליטה נראה בבירור, והאור המהבהב יהיה מסונכרן עם מהירות הרוטור. הכן את דוגמת התא כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הוסף את התאים התלויים לבקבוק המאגר המכיל את מאגר המיחזור.אפשר לתאים להיכנס למערכת ולהגיע לשיווי משקל בתוך תא הפליטה. כדי להבטיח שכל התאים יישמרו בתא, קח טיפה של חומר הניקוי על שקופית זכוכית וצפה בה במיקרוסקופ. אם הדגימה נטולת תאים שלמים, היא מאשרת את השמירה בתא.לאחר שכל התאים נכנסו לתא, ונראה גבול ברור בחלק הלבן ביותר של החדר, המכיל תאים ושיווי משקל, התחילו לאסוף שברים. העבר את צינור הפלט לצינור חרוטי מקורר מראש של 50 מיליליטר, שכותרתו W1. אסוף 50 מיליליטר של מאגר פליטה בשפופרת זו ואחסן על קרח. זמן קצר לאחר איסוף שבר W1, הורד את מהירות הצנטריפוגה ל-821 G.והעבר את צינור הפלט לצינור החרוטי, המסומן W2, ואסוף עוד 50 מיליליטר במהירות זו.המשך לשנות את המהירות ולאסוף שברים. וודאו שיש מדיום במיכל המאגר, ואחסנו תמיד את השברים שנאספו על קרח. לאחר איסוף כל השברים, עצרו את הצנטריפוגה ואספו 50 מיליליטר בצינור חרוטי, המסומן עצירה.תאי גלולה שנאספו בכל אחד מהשברים, ומשתמשים בניתוח במורד הזרם, כגון ציטומטריית זרימה, או כתמים מערביים, לפי הצורך. מוצג גרף קו המציג את הקוטר הממוצע של תאים בשברי הבהרה עוקבים. שימו לב שככל שקוטר התא גדול יותר, כך מספר השבר שבו הוא נפלט גבוה יותר.תוצאות מניתוח מיון תאים מופעלים פלואורסצנטיים, מראות את תכולת ה-DNA של התאים בכל אחד מ-20 שברי הפליטה. שברים מוקדמים, F1 עד F5, מכילים כמעט אך ורק תאים עם תכולת DNA של 2N המייצגים תאים בשלב G1. תערובת של תאים בשלבים G1 ו-S, נצפתה בשברי ביניים, F6 עד F9. ותאים עם תכולת DNA של 4N, המייצגים תאים ב-G2 עד M, נצפו החל מ-F10.מוצגות כאן, תוצאות הכתם המערבי מחקירת רמות החלבונים הקשורים למחזור התא בשברים מאוגדים של תאים בשלב G1, ובשלב G2 עד M. במאגר G2 עד M היו רמות גבוהות יותר של פוספו-Rb וציקלין B one, בהשוואה למאגר G1, כצפוי. אות ציקלין D אחד היה חלש, אך בכל זאת היה ניתן לזיהוי במאגר G1, ולא ניתן היה לגילוי בבריכת G2 ל-M.לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלוש שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לקחת את הזמן, ולוודא שמערכת הניקוי מורכבת כהלכה, ושכל החומרים והפתרונות מוכנים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון ניתוח מחזור התא, מבחני כדאיות תאים ו-immunoblots על מנת לחקור כיצד תרכובות טיפוליות עשויות לפעול באופן תלוי שלב במחזור התא.

preparation-primary-acute-lymphoblastic-leukemia-cells-different-cell

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

סרטון זה מתאר שיטה להפרדה מרחבית של שלוש תת-אוכלוסיות של תאים לוקמיים: תאי לוקמיה מרחפים המרחפים בחופשיות במדיה, תאי לוקמיה בהירי פאזה שנצמדו לפני השטח של חד-שכבה של תאי סטרומה מזנכימליים, ותאי לוקמיה עמומים בפאזה שנדדו מתחת לחד-שכבה של תאי סטרומה מזנכימליים מתרבית דו-ממדית.

קציר תת-אוכלוסיות לוקמי: שיטה להפרדה מרחבית של תת-אוכלוסיות תאים לוקמיים מתרבית משותפת דו-ממדית

סרטון זה מתאר את הטכניקה של בידוד תאי לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL) מדם היקפי. באמצעות פרוטוקול זה, נבודד תאי CLL מדגימת דם של מטופלים אנושיים לצורך יצירה יעילה לאחר מכן של שברים גרעיניים וציטופלזמיים.

צנטריפוגת שיפוע צפיפות: שיטה לבידוד תאי CLL מדם היקפי

סרטון זה מתאר את הכנת השברים התת-תאיים מתאים לוקמיים, שהיא שיטה ליצירת שברים תאיים וגרעיניים מתאים לוקמיים. ניתן להשתמש בשברים הגרעיניים והציטופלזמיים לניתוח נוסף במורד הזרם.

הכנת שברים תת-תאיים מתאים לוקמיים: שיטה ליצירת שברים תאיים וגרעיניים מתאים לוקמיים

יכולים להיות מבודדים הכרומוזומים מתאי חיים כגון לימפוציטים או fibroblasts עור, ומאורגניזמים כולל בני אדם או עכברים. הכנות כרומוזום אלה יכולים להיות מנוצלים נוספים עבור ה-G-פסים שיגרתי ונהלים ציטוגנטית מולקולריים כגון הקרינה הכלאה באתרו (FISH), הכלאה השוואתית גנומית (CGH), וkaryotyping ספקטרלי (SKY).

הכנת כרומוזום מתאים בתרבית

הדוח הנוכחי מסכם פרוטוקול שניתן להשתמש בו כדי לדגמן את ההשפעה של נישת המיקרו-סביבה של מח העצם על תאים לוקמיים עם דגש על העשרת תת-האוכלוסייה העמידה ביותר לכימותרפיה.

לוקמיה עמידה דוגמנות כימותרפיה<em&gt; במבחנה</em

נויטרופילים הם הסוג הנפוץ ביותר של תאי דם לבנים. בידוד הנויטרופילים מדם אנושי בשיטת הפרדת שיפוע צפיפות והתמיינות של תאים פרומילוציטיים אנושיים (HL60) לאורך המסלול הגרנולוציטי מתוארים כאן; לבחון את תפקידם ברגישות של תאי לימפומה לחומרים אנטי-לימפומה.

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

שיטת תמוגה תאי דם אדומה פשוט לצורך ביסוס B-LCLS פותחה עם יעילות גבוהה הנצחה, מחייב כמות קטנה של דם חיסכון בזמן מן החניכה cryopreservation.

תא דם אדום פשוט שיטת תמוגה להקמת שורות תאי B Lymphoblastoid

לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL) הוא הלוקמיה הנפוץ ביותר בעולם המערבי. גורמי שעתוק NFAT הן הרגולטורים חשוב של פיתוח והפעלה סוגי תאים רבים. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול לשימוש של כרומטין immunoprecipitation (ChIP) בתאי CLL אדם לזיהוי גנים היעד הרומן של NFAT2.

כרומטין Immunoprecipitation Assay לזיהוי NFAT2 הרומן גנים היעד בלוקמיה לימפוציטית כרונית

פרוטוקול זה מאפשר אופטימיזציה ולאחר מכן הדור יעיל של שברים גרעיניים ו cytoplasmic מתאי לוקמיה לימפוציטית כרונית ראשית. דגימות אלה משמשות כדי לקבוע לוקליזציה חלבונים, כמו גם שינויים בסחר בחלבונים המתרחשים בין התאים הגרעיניים cytoplasmic על גירוי התא וטיפול בסמים.

שבירה משנית של תאים לוקמיה לימפוציטית כרונית ראשונית לניטור גרעיני/Cytoplasmic סחר בחלבונים

פרוטוקול זה מתאר השתלת ביצית של תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה B ו-T (ALL) שמקורם בחולה, המתרחשת 4 ימים לאחר ההזרקה.

ב Ovo Xenografting של תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה (ALL) שמקורם בחולה (PDX-ALL)

הפרוטוקול נועד לתאר מודל עכברי ליצירת הישנות של לוקמיה לימפובלסטית חריפה, בהתבסס על הדינמיקה של התגובה לכימותרפיה אינדוקציה.

מודל עכברי של הישנות לוקמיה לכימותרפיה אינדוקציה ללוקמיה לימפובלסטית חריפה

למד כיצד להפריד תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה לשלבים שונים של מחזור התא באמצעות צנטריפוגלי Elutriation. שיטה זו מאפשרת חקר השפעות תרופות נוגדות סרטן בהתאם לשלב התא.

הכנה של תאים לוקמיה לימפובלסטית חריפה העיקרית בשלבים שונים של מחזור התא על ידי צנטריפוגלי Elutriation

גלה סרטונים נוספים