הכנה של תאים לוקמיה לימפובלסטית חריפה העיקרית בשלבים שונים של מחזור התא על ידי צנטריפוגלי Elutriation

המטרה הכוללת של הליך זה, היא לבודד תאים לשלבי מחזור תאים שונים באמצעות השפכה צנטריפוגלית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הטיפולים בסרטן. מכיוון שבידוד התאים לשלבים נפרדים, מאפשר חקירה של השפעות תלויות פאזה של תרכובות אנטי סרטניות.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת הפרדת תאים לשלבים ספציפיים באמצעות תכונות פיזיקליות, ולא הפרעות כימיות. כדי להתחיל את הניסוי, התקן את מכלול ה-strobe לתוך הצנטריפוגה כך שכבל החשמל מוזן מהתא דרך היציאה משמאל. כוונן את הבזק הבזק lamp כך שיתיישר עם viewחלון, כאשר הצנטריפוגה סגורה.

אבטח את המכלול במקומו, על ידי הידוק שני ברגי ראש פיליפס, בחלק העליון של כל תושבת. ואז על ידי הידוק ברגי האגודל בתחתית התושבת. חבר את כבל החשמל ליציאת החשמל המהבהבת, הממוקמת בחלק האחורי של הצנטריפוגה.

לאחר מכן, הנח את הרוטורים ישר כלפי מטה על רכזת הנעת הצנטריפוגה, ואבטח אותו היטב עם מפתח משושה ידית T. לאחר מכן, הנח את המכלול המכיל את תא הפליטה, איזון נגד, מכלול האיטום המסתובב ולוחית הרכבה על הרוטור. דחוף כלפי מטה באופן שווה, הנח יד אחת על תא הפליטה, ואת היד השנייה על האיזון, עד שהברגים ברוטור ייכנסו למקומם.

הנח את הסיכה, הממוקמת בקצה אחד של הכבל, לתוך החור במכלול האיטום המסתובב. ואבטח את חור העין, בקצה השני, עם אחד מברגי ראש הפיליפס, המוצמד לתושבת כדי לחבר את כבל העיגון. כדי להרכיב את מערכת הזרימה, כדי לשאוב חיץ לתוך ומחוץ לתא הפליטה, חבר צינורות בגודל 16 למשאבה במהירות משתנה.

הכנס קצה חופשי אחד של צינור זה דרך יציאה בפינה השמאלית העליונה של תא הצנטריפוגה, כך שהוא ייכנס לתא. חבר אביזר לקצה החופשי של צינור זה, ולאחר מכן הכנס את האביזר לחור הכניסה של מכלול האיטום המסתובב. לבסוף, הכנס את צינור הפלט, דרך יציאה, כדי לחבר אותו לצינור ההעברה בחלק העליון של מכלול האיטום המסתובב.

לאחר הרכבת מערכת השטיפה, יש לעקר אותה על ידי הנחת הקצה החופשי השני של צינור הכניסה לבקבוק של 500 מיליליטר, מלא באקונומיקה של 5%. והנחת צינור הפלט לבקבוק פסולת ריק של ליטר אחד. לאחר מכן, הפעל את המשאבה ואפשר לאקונומיקה לזרום כל הדרך דרך מערכת הפליטה, עד שהיא נשאבת החוצה לבקבוק האשפה.

כעת, הפעל את הצנטריפוגה ואפשר לה להגיע למהירות המקסימלית המיועדת כדי לשחרר בועות ולחץ אחורי. לאחר הגעה למהירות שנקבעה, עצור את הצנטריפוגה. לאחר שהרוטור נעצר לחלוטין, פתח את המכסה ובדוק את החדר לאיתור נזילות.

לאחר מכן, באופן דומה, כפי שתואר קודם לכן, העבירו מים סטריליים דרך המערכת למשך 10 דקות. לאחר שטיפה במים, החלף את מאגר המים בבקבוק זכוכית סטרילי מלא ב-100 מיליליטר של מאגר פליטה. הנח את צינור הכניסה לבקבוק זה, כך שיהיה בתחתיתו.

הפעל את הצנטריפוגה ואפשר למאגר לזרום דרך המערכת. לאחר שבקבוק המיכל קרוב לריק, והמים נשטפים במלואם מהמערכת, העבר את צינור הפלט מבקבוק הפסולת למאגר כך שהמאגר ימוחזר ברציפות דרך המערכת. לבסוף, הפעל את ה-strobe lamp, וסובב את כפתור הביטוי לקצה השמאלי.

כעת, כוונן את viewחלון על ידי סיבוב איטי של הכפתור ימינה, כך שתא הפליטה נראה בבירור, והאור המהבהב יהיה מסונכרן עם מהירות הרוטור. הכן את דוגמת התא כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הוסף את התאים התלויים לבקבוק המאגר המכיל את מאגר המיחזור.

אפשר לתאים להיכנס למערכת ולהגיע לשיווי משקל בתוך תא הפליטה. כדי להבטיח שכל התאים יישמרו בתא, קח טיפה של חומר הניקוי על שקופית זכוכית וצפה בה במיקרוסקופ. אם הדגימה נטולת תאים שלמים, היא מאשרת את השמירה בתא.

לאחר שכל התאים נכנסו לתא, ונראה גבול ברור בחלק הלבן ביותר של החדר, המכיל תאים ושיווי משקל, התחילו לאסוף שברים. העבר את צינור הפלט לצינור חרוטי מקורר מראש של 50 מיליליטר, שכותרתו W1. אסוף 50 מיליליטר של מאגר פליטה בשפופרת זו ואחסן על קרח. זמן קצר לאחר איסוף שבר W1, הורד את מהירות הצנטריפוגה ל-821 G.והעבר את צינור הפלט לצינור החרוטי, המסומן W2, ואסוף עוד 50 מיליליטר במהירות זו.

המשך לשנות את המהירות ולאסוף שברים. וודאו שיש מדיום במיכל המאגר, ואחסנו תמיד את השברים שנאספו על קרח. לאחר איסוף כל השברים, עצרו את הצנטריפוגה ואספו 50 מיליליטר בצינור חרוטי, המסומן עצירה.

תאי גלולה שנאספו בכל אחד מהשברים, ומשתמשים בניתוח במורד הזרם, כגון ציטומטריית זרימה, או כתמים מערביים, לפי הצורך. מוצג גרף קו המציג את הקוטר הממוצע של תאים בשברי הבהרה עוקבים. שימו לב שככל שקוטר התא גדול יותר, כך מספר השבר שבו הוא נפלט גבוה יותר.

תוצאות מניתוח מיון תאים מופעלים פלואורסצנטיים, מראות את תכולת ה-DNA של התאים בכל אחד מ-20 שברי הפליטה. שברים מוקדמים, F1 עד F5, מכילים כמעט אך ורק תאים עם תכולת DNA של 2N המייצגים תאים בשלב G1. תערובת של תאים בשלבים G1 ו-S, נצפתה בשברי ביניים, F6 עד F9. ותאים עם תכולת DNA של 4N, המייצגים תאים ב-G2 עד M, נצפו החל מ-F10.

מוצגות כאן, תוצאות הכתם המערבי מחקירת רמות החלבונים הקשורים למחזור התא בשברים מאוגדים של תאים בשלב G1, ובשלב G2 עד M. במאגר G2 עד M היו רמות גבוהות יותר של פוספו-Rb וציקלין B one, בהשוואה למאגר G1, כצפוי. אות ציקלין D אחד היה חלש, אך בכל זאת היה ניתן לזיהוי במאגר G1, ולא ניתן היה לגילוי בבריכת G2 ל-M.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלוש שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לקחת את הזמן, ולוודא שמערכת הניקוי מורכבת כהלכה, ושכל החומרים והפתרונות מוכנים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון ניתוח מחזור התא, מבחני כדאיות תאים ו-immunoblots על מנת לחקור כיצד תרכובות טיפוליות עשויות לפעול באופן תלוי שלב במחזור התא.