פיתוח assay על כימות תוכן גבוהה של היווצרות צבירה של מוטציה בחלבון Sod1 בתאים חיים

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לפתח מבחן לחקר ההשפעה של מולקולות קטנות בוויסות הצבירה של חלבונים לא מקופלים בצורה תלוית זמן ומינון. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות המפתח לפיתוח בדיקה סלולרית, והשימוש בה הוא לטכניקות סינון בעלות תוכן גבוה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא לספק שיטה פשוטה לאיתור וכימות צבירת חלבונים המתרחשת במספר הפרעות ניווניות.

ההשלכה של טכניקה זו משתרעת על טיפול פוטנציאלי במחלות ניווניות, כגון ALS, מכיוון שהיא מציעה שיטה פשוטה המאפשרת לפתח בדיקה תאית ולבצע הקרנה למנחי מולקולות קטנות. כדי להתחיל בייצור הנגיף, לפני טרנספקציה של פלסמיד פיצלו תאי HEK-293 T במפגש של 30 עד 40% בצלחת תרבית רקמה של 10 סנטימטר ו-10 מיליליטר של מדיום תרבית תאים. דגרו את צלחת התרבות באינקובטור פחמן דו חמצני של 5% בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

למחרת, הכינו תמיסת העברת DNA עם אריזות פלסמידים וקטור לנטיוויראלי, 125 מיקרוליטר של סידן כלורי מולארי אחד והוסיפו מים מזוקקים כדי להתאים את הנפח ל-500 מיקרוליטר. מוסיפים בעדינות 500 מיקרוליטר של מאגר HEPS 0.05 מולרי ודוגרים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, החלף את מדיום תאי ה-T HEK-293 במדיום תרבית טרי ללא אנטיביוטיקה של 10 מיליליטר מעורבב עם מיליליטר אחד של תמיסת העברת DNA.

דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני במהלך הלילה. החלף את התא במדיום תרבית טרי למחרת ודגר שוב למשך הלילה. לבסוף, למחרת קצרו את הסופרנטנט והעבירו לצינור של 15 מיליליטר.

כדי להסיר את התאים המתים והפסולת, צנטריפוגה את הצינור ב 500 פעמים גרם למשך חמש דקות. כדי לטהר עוד יותר את הסופרנטן, העבירו אותו דרך פילטר של 0.45 מיקרומטר באמצעות מזרק של 60 מיליליטר. לאחר מכן, מחלקים מיד את הסופרנטנט המסונן לתוך 300 מיקרוליטר לשימוש חד פעמי.

כדי להכין את התאים להתמרה יש לפצל אותם כך שיידבקו במפגש של 60% בצלחת תרבית רקמה בת שש בארות בשני מיליליטר DMAM בתוספת 10% FBS. דגרו את התאים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני למשך הלילה. למחרת, יש להפשיר כמות אחת של וירוס הלנטי הקפוא על קרח לכל שימוש.

בינתיים, יש לחמם את מדיום תרבית התאים המכיל את הסרום התואם לקו התאים המעניין. לאחר שהנגיף מופשר במלואו, יש לדלל אותו ב-DMEM בצינורות מיקרו-צנטריפוגות חדשים של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן התאם את עוצמת הקול למיליליטר אחד עם מדיום סרום מופחת.

לאחר מכן, הוסף שני מיקרוליטר פוליברן למיליליטר אחד של וירוס למדיום וערבב היטב על ידי פיפטינג. מוסיפים מיליליטר אחד מתערובת זו לתאים ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לאחר הדגירה, הסר את המדיום המכיל את הנגיף והחלף אותו ב-DMEM רגיל בתוספת 10% FBS והחזיר את התאים לחממה.

עקוב אחר צמיחת התאים והחלף את המדיום כל יומיים כאשר התאים מגיעים למפגש, הרחב כל באר של צלחת שש הבארות לצלחת תרבית רקמה של 10 סנטימטרים. העבירו את הצלחות לחממה. לבסוף, חסוך 1.5 כפול 10 עד 4 תאים לבאר ו -50 מיקרוליטר של DMEM על 384 לוחות בדיקת באר.

לאחר מכן בדוק את רמת הביטוי של החלבון המתויג YFP תחת המיקרוסקופ. אם הביטוי מראה יחס אות לרעש שווה או גדול משלוש, הכן מלאי תאים עבור שורת התאים המתאימה. להעברת התרכובת, על צלחת פוליפרופילן לאחסון של 384 בארות, הוסף דילולים סדרתיים של תרכובות על ידי סדרת הדילול הסטנדרטית אחת עד שלוש.

לאחר מכן, באמצעות מטפל בנוזלים המצויד בראש נימי 384, פזרו 0.25 מיקרוליטר של מעכבי פרוטאזום על צלחות בדיקה שחורות ריקות עם תחתית שטוחה עם 384 בארות. לאחר מכן זרע 1.5 כפול 10 לתאים הרביעיים בצלחות אלה. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 24 שעות.

לפני הדמיית קו התאים המטופל במעכבי פרוטאזום, יש להוסיף 10 מיקרוליטר של DMEM מחומם מראש עם תמיסת צביעה ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר הצביעה, הפעל את תוכנת ההפעלה האוטומטית של המיקרוסקופ על ידי בחירה בלשונית המיקרוסקופ. ראשית, בחר בכרטיסיית התצורה ולאחר מכן בחר 20 פעמים מטרה בסוג הצלחת הנכון.

כדי לאפשר מיקוד נכון עם סוגי צלחות שונים, ודא שהמתקשר מוגדר לערך הנכון במטרה. לאחר מכן, בחר חשיפה אחת. הגדר את גובה המיקוד לאפס מיקרומטר ולאחר מכן בחר מיקוד.

ברגע שהיא ממוקדת, חשוף את המצלמה הראשונה. כדי לייעל את מישור החשיפה, התאם את גובה המיקוד ולחץ על גובה צילום. שנה את זמני החשיפה ואת עוצמת הלייזר לעוצמת פיקסלים מקסימלית של כ-3000 וחסוך בפרמטרי חשיפה.

בחר בכרטיסיית הגדרת ניסוי, צור פריסה ופריסת משנה. לאחר מכן, גרור ושחרר את חשיפת הפריסה, תמונת ההתייחסות, קובץ חיתוך ההטיה ופריסת המשנה הרלוונטיים. לאחר מכן, שמור את הניסוי.

לבסוף, בחר לשונית ניסוי אוטומטית ורכוש תמונות. לתמונות דו-ערוציות, בחר תחילה באלגוריתם התוכנה כדי לפלח את האובייקטים העיקריים, כגון גרעינים, ציטוזול ואגרגטים. ראשית, יש להפיץ 0.25 מיקרוליטר של מעכב פרוטאזום מומס ב-100% DMSO או DMSO על צלחות בעלות תחתית שטוחה של 384 בארות.

באותה צלחת, זרעו ידנית 1.5 פעמים 10 עד התאים הרביעיים לבאר ב -50 מיקרוליטר DMEM. לאחר מכן הגדר את יחידת הבקרה הסביבתית של מערכת המיקרוסקופ ל-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. הפעל את המיקרוסקופ במצב פלורסנט בשדה רחב וכהגדרות תוכנה, בחר LWD 20 פעמים במצב לא קונפוקלי אובייקטיבי, ארבעה שדות לבאר ולכידת מרווח של שעה.

לאחר מכן, בחר את האלגוריתם המתאים לפלח את האובייקט העיקרי כגון ציטוזול ואגרגטים. התאם את סף הרקע ופרמטרי הניגודיות במידת הצורך. קווי התאים שנבדקו שהומרו עם SOD-1 wild type ומוטציה SOD-1 A4V נותרו בריאים, הראו רמות ביטוי גבוהות ותיוג phi רחב לטווח ארוך ללא קשר לצורת ה-SOD.

טיפול במעכב פרוטאזום ALLN במשך 24 שעות קידם הצטברות של אגרגטים SOD-1 A4V YFP בתאי HEK-293 אך לא בתאים מותמרים SOD-1 Wild Type YFP. יתר על כן, היו רמות נמוכות מאוד של צבירה בקווי התאים U2 OS ו-SH-SY5Y SOD-1 A4V YFP שהומרו עם אותם וקטורים. לאחר זריעת התאים בנוכחות או בהיעדר ALLN, הם נוטרו להיווצרות מצטבר לתקופה של 50 שעות.

היווצרות האגרגט של ALLN הגיעה לרמה לאחר 24 שעות ונשארה יציבה במהלך 12 השעות הבאות. יתר על כן, צפיפות התאים ירדה משמעותית לאחר 28 שעות כתוצאה מההשפעה הציטוטוקסית של ALLN, בעוד שמספר התאים גדל בביקורת השלילית שטופלה ב-DMSO. תאי SOD-1 A4V YFP שגודלו בנוכחות מעכבי פרוטאזום במשך 24 שעות נצבעו בתמיסת Hoechst.

הרעילות היחסית של שלושה מעכבי פרוטאזום שונים הותאמה על ידי מדידת מספר קווי התאים הדבקים שנותרו בבאר המסומנת בצבע הוכסט. מספר התאים הכולל ירד בתגובה למינון מוגבר של מעכבי פרוטאז. הפוך, אחוז התאים המבטאים אגרגטים SOD-1 A4V גדל עם ריכוז מעכב הפרוטאז.

בעת ביצוע תהליך זה חשוב לזכור שאיכות התא תשפיע באופן דרסטי על התוצאה שלך. לכן חשוב לקבוע שהתאים נטולי מיקרופלזמה ובריאים לאורך כל השלבים. לאחר תהליך זה, ניתן להשתמש בשיטת הדמיה נוספת על מנת לענות על שאלות נוספות הנוגעות לפירוק החלבון או לאינטראקציה של החלבון עם אחרים באמצעות העברת אנרגיית תהודה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור את הכלים לבדיקת גורל החלבון בתאים חיים מרובים באמצעות ניתוח תמונה בעל תוכן גבוה. כך ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי צבירת חלבונים כפי שהיא מתרחשת במודלים תאיים פשוטים. ניתן ליישם אותו גם על מערכות אחרות כגון תאי עצב מובחנים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים ספציפיים למטופל.