Overexpression וטיהור האדם Cis פרנליטרונפרפרז ב Escherichia coli

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לבטא יתר על המידה ולטהר את cis-prenyltransferase אנושי מותאם לקודון בתנאים שאינם דנטורציה ולבחון את פעילותו האנזימטית. ההליך מודגם עם cis-prenyltransferase dehydrodolichyl diphosphate synthase, או DHDDS. שיטה זו יכולה לקדם את ההבנה שלנו לגבי סינתזת איזופרנואידים ולספק תובנות מפתח לגבי המנגנון הפתופיזיולוגי של רטיניטיס פיגמנטוזה הקשורה למוטציות ב-DHDDS.

היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא פשוטה, חסכונית וחוסכת זמן. ניתן גם להכליל אותו לייצור בכמויות גבוהות של חלבוני cis-prenyltransferase אחרים. התחל הליך זה בשיבוט ביטוי של DHDDS אנושי, כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

השעו מחדש את התאים במאגר A, מיקרוגרם אחד למיליליטר של DNase I, ותערובת מעכבי פרוטאז. לאחר מכן, הומוגניזציה של התאים התלויים באמצעות הומוגנייזר טפלון מזכוכית. לשבש את התאים עם מיקרופלואידיזר או שווה ערך ב-12,000 עד 15,000 psi.

לאחר מכן, צנטריפוגה של התא ליזאט ב -40, 000 פעמים גרם למשך 45 דקות בארבע מעלות צלזיוס. שחזר את הסופרנטנט המכיל את החלק המסיס. טען את הסופרנטנט על עמוד כרומטוגרפיה של מתכת משותקת של 5 עד 10 מילימטר עם אימידזול של 10 מילי-מולרי.

לאחר הטעינה למכונת כרומטוגרפיה נוזלית מהירה של חלבון, בצע שטיפה יסודית של העמודה עם מאגר A באימידזול של 10 מילי-מולר על מנת להפחית את קשירת החלבון הלא ספציפית. התחל את תוכנית FPLC. לחסל את החלבונים המתבטאים יתר על המידה עם בופר A בתוספת 250 מילי-מולארי אימידזול.

לאחר הפליטה, הסר את האימידזול באמצעות 53 מיליליטר של עמוד התפלה מכין מאוזן עם מאגר A.לאחר מכן, הוסף פרוטאז TEV מתויג הקסהיסטידין לחלבונים המנופחים כדי להסיר את היתוך התיורדוקסין DHDDS המתויג בהקסהיסטידין. דוגרים על התערובת בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר מכן, טען את החלבונים המפוצלים על עמודת כרומטוגרפיה של זיקה מתכתית משותקת קובלט מאוזנת עם מאגר A בתוספת אימידזול של חמישה מילי-מולריות.

אסוף את הזרימה כדי להסיר את התיורדוקסין והפרוטאז TEV המתויגים בהקסהיסטידין. רכז את הזרימה בין שלושה לארבעה מיליליטר באמצעות מסנן צנטריפוגלי מנותק במשקל מולקולרי של 30 קילודלטון. לאחר מכן, טען את החלבון המרוכז על עמודת כרומטוגרפיה של אי הכללה בגודל Superdex 200 המאוזנת עם מאגר A לטיהור סופי.

מניחים את הדגימות במתלה של 96 בארות בקולט שברים. החלבון נפלט כדימר. בחר שברים רלוונטיים על ידי השוואת פרופיל הפליטה לעקומת כיול עמודות.

בשלב זה, העריכו את טוהר התכשיר באמצעות SDS-PAGE. לבסוף, קבע את ריכוז החלבון הדרוש לניסויים במורד הזרם והקפאת בזק של חלבונים מרוכזים מטוהרים בחנקן נוזלי. אחסן את המינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

כדי להבטיח את יכולתו של החלבון לעמוד במחזורי הקפאה-הפשרה, יש להפשיר כמות גדולה של החלבונים הקפואים. צנטריפוגה את האליקוט ב 21, 000 פעמים גרם למשך 10 דקות להסרת אגרגטים בלתי מסיסים. לאחר הצנטריפוגה, אספו את הסופרנטנט.

לאחר מכן, טען את החלבונים על עמודה אנליטית Superdex 200 מאוזנת מראש עם TNXB באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד. עקוב אחר הקרינה של הטריפטופן כדי לזהות את פרופיל הפליטה של החלבון. הקפד על עקומת כיול תקפה להערכת משקל מולקולרי, הזמינה דרך יצרני עמודות ה-SEC.

כדי להבטיח את פעילות החלבון המטוהר, יש לערבב תחילה חמישה מיקרו-מולרים של DHDDS מטוהרים עם 10 FPP מיקרו-מולרי ו-50 מיקרו-מולרי C14 IPP. התחל את התגובה במאגר A עם 0.5 מילי-מולרי מגנזיום כלוריד בטמפרטורה של 22 עד 30 מעלות צלזיוס. משוך 15 דגימות מיקרוליטר מהתגובה באפס, שעתיים, ארבע ושש שעות לאחר הכיבוי המיידי של התגובה על ידי תוספת של 15 מיקרוליטר של מאגר A בתוספת 20 מילי-מולרי EDTA.

לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של 1-בוטנול רווי מים ומערבולת ביסודיות כדי לחלץ את תוצרי התגובה. ניתן לעצור את הפרוטוקול כאן, וניתן לשמור את הדגימות לקריאה מאוחרת יותר. לאחר מכן, הוסף את קוקטייל הנצנוץ לדגימות.

באמצעות מונה נצנוץ, כמת תוצרי תגובה בשלב הבוטנול המקיף C14 יחד עם רדיואקטיביות של 15 מיקרוליטר של התגובה, המייצגים את הרדיואקטיביות הכוללת. לבסוף, חשב את שילוב ה-IPP נטו של C14 בכל נקודת זמן על ידי חישוב האחוז המנוצל מסך ריכוזי ה-IPP של C14 ושרטט את התוצאות כפונקציה של זמן. עלייה בהתאגדות ה-IPP נטו של C14 צפויה עם הזמן.

הדגימות המתקבלות בכל שלב טיהור מוצגות כאן. ניתוח SDS-PAGE זה מראה את הטיהור ההדרגתי של DHDDS, והתוצאה היא מוצר מטוהר מאוד. כרומטוגרמה זו מייצגת את התוצאות של כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל אנליטי של האנזים המטוהר, ומגלה כי החלבון נצפה רק כהומודימר.

כאן, החץ מציין את נפח הריק. בדיקת פעילות מייצגת תלוית זמן מגלה כי שילוב C14 IPP עולה בבירור במשך שש שעות, ומאמת שהאנזים המטוהר מתפקד. לאחר השליטה, ניתן לבצע את ההכנה הפשוטה הזו תוך יומיים-שלושה, והתוצאה היא אנזים טהור ופעיל ביותר.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבטא יתר על המידה ולטהר את cis-prenyltransferase אנושי מ-E.coli ולמדוד את פעילותו באופן תלוי זמן.