Name: Overexpression וטיהור האדם Cis פרנליטרונפרפרז ב Escherichia coli (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: למד להביע יתר ולטהר את האנזים האנושי cis-prenyltransferase ב-Escherichia coli בתנאי אי-דנטורציה. שיטה זו מאפשרת חקר סינתזת איזופרנואידים והבנת מנגנון רטיניטיס פיגמנטוזה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי המרכז למצוינות מחקר של מכון המדעים הישראלי (I-CORE) בביולוגיה תאית מבנית (1775/12) והקרן למדע ישראל מעניקה 1721/16 ו - 2338/16 (YH) ו - 825/14 (DK ). התמיכה של הקרן נכסי פילדס DK הוא מוערך מאוד. עבודה זו בוצעה על ידי אילן אדרי ומיכל גולדנברג בהגשמה חלקית של דרישות התזה של הפקולטה לרפואה ע&quot;ש סאקלר, אוניברסיטת תל-אביב.

1. שיבוט של CIS -PT עבור Overexpression ב E. coli <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השגת וקטור ביטוי pet-32b, המיועד שיבוט ביטוי ברמה גבוהה של רצפי חלבון התמזגו עם 109 thaoedoxin (TRX) חלבון 17 , ו E. coli קידון אופטימיזציה 18 רצף קידוד של אורך מלא CIS -PT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תשמור על עצמך כדי להיות אתר מחשוף TEV-פרוטאז (טבק לחרוט וירוס פרוטאז) (ENLYFQ / G, שבו &quot;/&quot; מציין את הנקודה מהחשוף) 9 ואחריו ומקשר גמיש קצר (SGSGSG, כדי לשפר את האתר מחשוף נגישות) במעלה זרם של CIS רצף -PT ( איור 1 א ). כמו כן, הוסף מתאים 5 &#39;ו 3&#39; אתרי הגבלה לשיבוט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשכפל את הדנ&quot;א מסונתז לבנות לתוך וקטור pET-32b באמצעות טכניקות קשירת תקן 10 . </li></ol> 2. OverexpreSsion של האדם DHDDS ב E. coli <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרה E. coli T7 להביע תאים המוסמכת עם DXDS TRX- היתוך לבנות בהתאם להוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט התאים השתנו בהתאם להוראות היצרן על LB אגר בתנאים סלקטיבי ampicillin (200 מ&quot;ג / L). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן מושבות שנבחרו לתוך 100 מ&quot;ל של מדיום LB ב 250 מ&quot;ל צלוחיות Starter תרבויות עם 100 מ&quot;ג / L אמפיצילין ו דגירה לילה ב 37 ° C עם רועד מתמיד בסל&quot;ד 200. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 80 מ&quot;ל של התרבות לתוך שתי 5 צלוחיות L (40 מ&quot;ל לכל בקבוק), כל אחד המכיל 1.5 ליטר בינוני YT 2x (16 גרם / L טריפטון, 10 גרם / l תמצית שמרים, 5 גרם / L NaCl) עם 100 מ&quot;ג / L אמפיצילין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התרבות ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד מתמיד ב 180 סל&quot;ד עד להגיע OD 600 ננומטר = 0.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיכים את הטמפרטורה ל 16 מעלות צלזיוס וגורמים לתאים על ידי הוספת 0.5 מ&quot;מ isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). ConTinue דוגרים תחת אותו מצב עבור 16-20 שעות עבור ביטוי חלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר התאים על ידי צנטריפוגה (10,000 x גרם במשך 10 דקות). הערה: ניתן להפסיק את הפרוטוקול כאן; התאים גלולה צריך להישמר ב -80 מעלות צלזיוס עד טיהור. </li></ol> 3. טיהור האדם DHDDS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים במאגר A (25 מ&quot;מ טריס HCl, pH 7.5, 150 מ&quot;מ NaCl, 0.1% Triton X-100, 10 מ&quot;מ β-mercaptoethanol), 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​DNase אני, תערובת מעכב פרוטאז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize התאים באמצעות homogenizer זכוכית טפלון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבש את התאים באמצעות microfluidizer או שווה ערך ב 12,000 - 15,000 psi 11 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה lysate התא ב XG 40,000 במשך 45 דקות ב 4 ° C. לשחזר את supernatant, המכיל את החלק המסיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את supernatant על 5-10 מ&quot;ל קובלט משותקת מתכת כרומטוגרפיה זיקה (Co 2 + -IMAC) 12 טור עם 10MM imidazole, ואחריו כביסה יסודית עם חיץ ו 10 מ&quot;מ imidazole כדי להפחית מחייב חלבון לא ספציפי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute את חלבונים overexpressed עם חיץ בתוספת של 250 מ&quot;מ imidazole. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר imidazole באמצעות טור 53 מ&quot;ל desalting prepal equilibrated עם חיץ א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 6xHis- מתויג פרוטאז TEV (1 מ&quot;ג TEV פרוטאז לכל 50 מ&quot;ג חלבון) כדי חלבונים eluted להסיר 6xHis שלהם מתויג TRX היתוך חלבון ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את החלבונים שנקטפו על עמודה Co + 2 -IMAC, equilibrated עם חיץ בתוספת 5 imidazole מ&quot;מ, כדי להסיר את 6x מתויג שלו מתויג TRX חלבון היתוך פרוטאז TEV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הזרימה דרך ולהתרכז 3 - 4 מ&quot;ל באמצעות 30 kDa משקל מולקולרי לחתוך מסנן צנטריפוגלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את החלבון מרוכזים על גבי סופרדקס-200 גודל-הטור כרומטוגרפיה עמודה equilibrated עם חיץ A לטיהור הסופי. חלבון elutes כמו דימר (~ 76 kDa). </Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר שברים רלוונטיים על ידי השוואת פרופיל elution לעקומת כיול עמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את טוהר ההכנה באמצעות SDS-PAGE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת ריכוז החלבון הדרוש לניסוי במורד הזרם ואת aliquots פלאש להקפיא של חלבונים מטוהרים מרוכזים בחנקן נוזלי בחנות ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. </li></ol> 4. אנליזה אנליטית של גודל כרומטוגרפיה (SEC) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח את היכולת של החלבון לסבול להקפיא להפשיר מחזורי, להפשיר aliquot של חלבונים קפואים צנטריפוגות ב 21,000 x גרם במשך 10 דקות כדי להסיר אגרגטים מסיסים. לאסוף את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את החלבונים על עמודה אנליטית superdex-200 מראש equilibrated עם 25 מ&quot;מ טריס HCl, pH 7.5, 150 מ&quot;מ NaCl, 0.02% Triton X-100, 10 מ&quot;מ β- mercaptoethanol, באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים אולטרה 13 , 14 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג פלואורס טריפטופן(Λ ex = 280 nm, λ em = 350 ננומטר) כדי לזהות את פרופיל elution eluting חלבונים. הקפד להיות עקומת כיול תקף להערכת משקל מולקולרי - עקומות כאלה זמינים דרך היצרנים טור ה- SEC. </li></ol> 5. אנזים קינטיקה - פעילות תלויית זמן 15 , 16 , 17 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח את פעילות החלבון מטוהרים, לערבב 5 מיקרומטר של DHDDS מטוהרים עם 10 מיקרומטר FPP ו 50 מיקרומטר 14 C-IPP ליזום את התגובה במאגר עם 0.5 מ&quot;מ MgCl 2 ב 22-30 מעלות צלזיוס. הערה: תנאי התגובה המדויקים עשויים להשתנות עם ההכנות של CIS -PTs שונים מ DHDDS. יתר על כן, הפעילות של DHDDS גם תלוי בטמפרטורה [Mg 2 + ]. זהירות: 14 C-IPP הוא רדיואקטיבי ויש להשתמש בו בהתאם לתקנות הבטיחות המקומיות. </Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> משיכה 15 דגימות μL מהתגובה ב 0, 2, 4 ו 6 שעות, לאחר מרווה מיידית של התגובה על ידי תוספת של 15 חיץ μL 20 מ&quot;ל EDTA בתוספת (לריכוז סופי של 10 מ&quot;מ EDTA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל H 2 O- רווי 1-butanol ו מערבולת ביסודיות כדי לחלץ את מוצרי התגובה. הערה: פרוטוקול ניתן לעצור כאן את דגימות ניתן לשמור לקריאה מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף קוקטייל scintillation על דגימות, באמצעות מונה נצנץ, לכמת מוצרים התגובה בשלב butanol המקיף 14 C, יחד עם רדיואקטיביות של 15 μL מתערובת התגובה, המייצג את הרדיואקטיביות הכוללת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפחת את הקריאות רקע נמדד באמצעות 0 ד דוגמאות מכל נקודת זמן לחשב את אחוז 14 C-IPP מנוצל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב נטו 14 C-IPP שילוב בכל נקודת זמן על ידי חישוב אחוז מנוצל בסך הכל 14 </Sup&gt; C-IPP ריכוזים, ואת העלילה את התוצאות כפונקציה של זמן. עלייה של 14 נטו C-IPP שילוב עם הזמן צפוי. </li></ol>

<ol><li>Grabinska, K. A., Park, E. J., Sessa, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cis-Prenyltransferase%3A+New+Insights+into+Protein+Glycosylation%2C+Rubber+Synthesis%2C+and+Human+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">cis-Prenyltransferase: New Insights into Protein Glycosylation, Rubber Synthesis, and Human Diseases.</a> J Biol Chem. 291 (35), 18582-18590 (2016).</li>
<li>Ogura, K., Koyama, T., Sagami, H. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/chapter/10.1007/978-1-4615-5901-6_3">Polyprenyl diphosphate synthases.</a> Subcell Biochem. 28, 57-87 (1997).</li>
<li>Ogura, K., Koyama, T. Enzymatic Aspects of Isoprenoid Chain Elongation. Chem Rev. 98 (4), 1263-1276 (1998).</li>
<li>Imperiali, B., O'Connor, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+N-linked+glycosylation+on+glycopeptide+and+glycoprotein+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Effect of N-linked glycosylation on glycopeptide and glycoprotein structure.</a> Curr Opin Chem Biol. 3 (6), 643-649 (1999).</li>
<li>Bukhtiyarov, Y. E., Shabalin, Y. A., Kulaev, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubilization+and+characterization+of+dehydrodolichyl+diphosphate+synthase+from+the+yeast+Saccharomyces+carlsbergensis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Solubilization and characterization of dehydrodolichyl diphosphate synthase from the yeast Saccharomyces carlsbergensis.</a> J Biochem. 113 (6), 721-728 (1993).</li>
<li>Adair, W. L., Cafmeyer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+cis-prenyltransferase+required+for+dolichyl+phosphate+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Saccharomyces cerevisiae cis-prenyltransferase required for dolichyl phosphate biosynthesis.</a> Arch Biochem Biophys. 259 (2), 589-596 (1987).</li>
<li>Zelinger, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+missense+mutation+in+DHDDS%2C+encoding+dehydrodolichyl+diphosphate+synthase%2C+is+associated+with+autosomal-recessive+retinitis+pigmentosa+in+Ashkenazi+Jews%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">A missense mutation in DHDDS, encoding dehydrodolichyl diphosphate synthase, is associated with autosomal-recessive retinitis pigmentosa in Ashkenazi Jews.</a> Am J Hum Genet. 88 (2), 207-215 (2011).</li>
<li>Zuchner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-exome+sequencing+links+a+variant+in+DHDDS+to+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Whole-exome sequencing links a variant in DHDDS to retinitis pigmentosa.</a> Am J Hum Genet. 88 (2), 201-206 (2011).</li>
<li>Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+soluble+His%286%29-tagged+TEV+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease.</a> Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).</li>
<li>Crouse, G. F., Frischauf, A., Lehrach, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+and+simplified+approach+to+cloning+into+plasmids+and+single-stranded+phages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">An integrated and simplified approach to cloning into plasmids and single-stranded phages.</a> Methods Enzymol. 101, 78-89 (1983).</li>
<li>Middelberg, A. P. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/073497509502007P">Process-scale disruption of microorganisms.</a> Biotechnol Adv. 13 (3), 491-551 (1995).</li>
<li>Block, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilized-metal+affinity+chromatography+%28IMAC%29%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review.</a> Methods Enzymol. 463, 439-473 (2009).</li>
<li>Sachyani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+a+Kv7.1+potassium+channel+gating+module%3A+studies+of+the+intracellular+c-terminal+domain+in+complex+with+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural basis of a Kv7.1 potassium channel gating module: studies of the intracellular c-terminal domain in complex with calmodulin.</a> Structure. 22 (11), 1582-1594 (2014).</li>
<li>Shuart, N. G., Haitin, Y., Camp, S. S., Black, K. D., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+for+3%3A1+subunit+stoichiometry+of+rod+cyclic+nucleotide-gated+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism for 3:1 subunit stoichiometry of rod cyclic nucleotide-gated ion channels.</a> Nat Commun. 2, 457(2011).</li>
<li>Chang, S. Y., Tsai, P. C., Tseng, C. S., Liang, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refolding+and+characterization+of+a+yeast+dehydrodolichyl+diphosphate+synthase+overexpressed+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Refolding and characterization of a yeast dehydrodolichyl diphosphate synthase overexpressed in Escherichia coli.</a> Protein Expr Purif. 23 (3), 432-439 (2001).</li>
<li>Chang, S. Y., Ko, T. P., Liang, P. H., Wang, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+mechanism+revealed+by+the+crystal+structure+of+undecaprenyl+pyrophosphate+synthase+in+complex+with+sulfate%2C+magnesium%2C+and+triton%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Catalytic mechanism revealed by the crystal structure of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with sulfate, magnesium, and triton.</a> J Biol Chem. 278 (31), 29298-29307 (2003).</li>
<li>Guo, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+undecaprenyl+pyrophosphate+synthase+in+complex+with+magnesium%2C+isopentenyl+pyrophosphate%2C+and+farnesyl+thiopyrophosphate%3A+roles+of+the+metal+ion+and+conserved+residues+in+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with magnesium, isopentenyl pyrophosphate, and farnesyl thiopyrophosphate: roles of the metal ion and conserved residues in catalysis.</a> J Biol Chem. 280 (21), 20762-20774 (2005).</li>
<li>Collins, F. S., Green, E. D., Guttmacher, A. E., Guyer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vision+for+the+future+of+genomics+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A vision for the future of genomics research.</a> Nature. 422 (6934), Institute, U.S.N.H.G.R. 835-847 (2003).</li>
<li>Freeze, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+human+glycosylation+disorders%3A+biochemistry+leads+the+charge%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Understanding human glycosylation disorders: biochemistry leads the charge.</a> J Biol Chem. 288 (10), 6936-6945 (2013).</li>
<li>LaVallie, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thioredoxin+gene+fusion+expression+system+that+circumvents+inclusion+body+formation+in+the+E.+coli+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%28N+Y%29%22%5BJournal%5D)">A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm.</a> Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).</li>
<li>Elena, C., Ravasi, P., Castelli, M. E., Peiru, S., Menzella, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+codon+optimized+genes+in+microbial+systems%3A+current+industrial+applications+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Expression of codon optimized genes in microbial systems: current industrial applications and perspectives.</a> Front Microbiol. 5, 21(2014).</li>
<li>Vincentelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+protein+expression+screening+and+purification+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli.</a> Methods. 55 (1), 65-72 (2011).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הפרוטוקול המתואר כאן לטיהור של DHDDS תפקודית האדם בתאי coli הוא פשוט ויעיל, המאפשר אחד overexpress ולטהר את החלבון ב 3 - 4 ימים לאחר מבנה מתאים זמין. פרוטוקולים כאלה עבור טיהור חלבון הם בעלי משמעות מיוחדת בהתחשב פריצות דרך ברצף הגנום, אשר סיפקה שפע של מידע לגבי הגנטיקה של מחלות רבות 18 , ובכך מחייב את הפיתוח של שיטות תפוקה גבוהה לאפיין מנגנונים פתוגניים ברמת החלבון 19 . <p class="jove_content" style=";text-align:right;di...

Prenyltransferases הם קבוצה של אנזימים כי להאיץ שרשרת הארכה של diphosphate allylic באמצעות diphosphate isopentenyl (IPP) באמצעות תגובות עיבוי מרובים 1 , 2 . אנזימים מסוג Z לזרז את ההיווצרות של קשרים כפולים cis מן תגובת הדחיסה, בעוד אנזימי E-סוג מזרזי היווצרות קשר כפול טרנס 3. Cis- perrenyltransferases ( CIS -PT, Z- סוג אנזימים) מסווגים באופן קלאסי על פי אורך שרשרת המוצר שלהם לתוך שרשרת קצר (C 15 ), שרשרת בינונית (C 50-55 ), שרשרת ארוכה (C 70-120 ) 4 . DHDDS (synthase דיפוספט dehydrodolichyl) הוא -PT cis ארוך שרשרת איקריוטיים מזרז התארכות שרשרת של דיפוספט farnesyl (FPP, גידול דיפוספט allylic) באמצעות condensations המרובה עם דיפוספט isopentenyl (IPP) 1, 5 , 6 . התוצאה היא היווצרות של dhydosphate dehydrodolichyl, C 55-100 poliprenyl diphosphate המשמש מבשר עבור dolichylpyrophosphate, המולקולה המוביל glycosyl מעורב N- חלבון glycosylation 1 . בקרב היהודים האשכנזים, מוטציה שאינה שמרנית (K42E) ב- DHDDS גורמת לרטוסניטיס רסיסיבי pigmentosa 7 , 8 . לכן, הפרוטוקול הנוכחי פותח על מנת לרכוש מטוהרים DHDDS מתאים ללימודי מכניסטית. Escherichia coli נחשב המארח הנוח ביותר וחסכוני עבור ביטוי חלבון רקומביננטי, ולכן הוא גם המארח הנפוץ ביותר. עם זאת, כאשר אחד מנסה heterologously overexpress חלבונים E. coli , חלבון ספציפי שיקולים צריך להיעשות. קבלת מקופל כראוי, פעילE חלבונים רקומביננטי מ E. coli , הוא לא עניין פשוט בשל תכונות שונות של חלבונים שונים. גישות רבות פותחו כדי להתגבר על משוכות אלה. כאן, השימוש של היתוך חלבון, אופטימיזציה התנאים התרבות אופטימיזציה קודון שימשו כדי לאפשר overexpression וטיהור של DHDDS האדם פעיל מבחינה תפקודית E. קולי . ראוי לציין, ניסיון קודם overexpress שמרים cis- PT ללא היתוך חלבון לא הצליח בשל חוסר מסיסות מלאה אפילו בנוכחות של חומר ניקוי 12 . הפרוטוקול המתואר הוא פשוט, חסכוני, זמן חוסך ומאפשר אחד כדי לקבל DHDDS ההכנות מתאים ללימודי מכניסטית. בהינתן ההומולוגיה של CIS -PT בין המינים השונים, אנו מציעים כי פרוטוקול זה עשוי להיות מיושם עבור אחרים cis- eukaryotic גם כן.

<table><tbody><tr><td>pET-32b</td><td>Novagen</td><td>69016-3</td><td></td></tr><tr><td>T7 Express&nbsp; lysY&nbsp; מוכשרים&nbsp; E. coli&nbsp; (יעילות גבוהה)</td><td>NEB</td><td>C3010I</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, קוקטייל מעכב פרוטאז נטול EDTA רוש</td><td></td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>שרף TALON-superflow GE</td><td>Healthcare</td><td>28-9574-99</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep 26/10 עמוד התפלה&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17508701</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 16/60 superdex-200&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28989335</td><td></td></tr><tr><td>superdex-200 עולה ב-5/150 GL&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28990945</td><td></td></tr><tr><td>14C-איזופנטניל פירופוספט</td><td>פרקין-אלמר</td><td>NEC773050UC&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>טראנס, טראנס-פרנזיל פירופוספט</td><td>סיגמא</td><td>44270-10MG</td><td></td></tr></tbody></table>

overexpression וטיהור האדם cis פרנליטרונפרפרז ב escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) הם קבוצה של אנזימים כי להאיץ שרשרת הארכה של diphosphate allylic באמצעות dophosphate isopentenyl (IPP) באמצעות תגובות עיבוי מרובים. DHDDS (synthase דיפוספט dehydrodolichyl) הוא -PT cis ארוכי שרשרת איקריוטיים (להרכיב קשרים כפולים cis מן תגובת דחיסה) המזרז התארכות שרשרת של דיפוספט farnesyl (FPP, גידול דיפוספט allylic) באמצעות condensations מרובים עם דיפוספט isopentenyl (IPP). DHDDS הוא בעל חשיבות ביו רפואית, כמו מוטציה לא שמרנית (K42E) בתוצאות האנזים ב רטיניטיס pigmentosa , ובסופו של דבר מוביל לעיוורון. לכן, פרוטוקול זה פותח על מנת לרכוש כמויות גדולות של DHDDS מטוהרים, מתאים ללימודי מכניסטית. כאן, השימוש של היתוך חלבון, אופטימיזציה התנאים התרבות אופטימיזציה קודון שימשו כדי לאפשר overexpression וטיהור של DHDDS האדם פעיל מבחינה תפקודית <eM&gt; E. Coli. הפרוטוקול המתואר הוא פשוט, חסכוני זמן חוסך. ההומולוגיה של CIS -PT בין מינים שונים מצביעה על כך שפרוטוקול זה עשוי להיות מיושם גם עבור CIS- eukaryotic אחרים, כמו אלה, כגון אלה המעורבים בסינתזה של גומי טבעי.

סקירה כללית של מבנה המשמש כאן תהליך טיהור מוצגים באיור 1 . הדגימות המתקבלות בכל שלב טיהור מוצגות באיור 2 . זה ניתוח SDS-PAGE מראה טיהור בשלבים של DHDDS, וכתוצאה מכך מוצר מטוהרים מאוד. איור 3 מציג את התוצאות של ה- SEC האנליטי של האנזים מטוהרים, חושפים כי החלבון הוא ציין רק כ homodimer. איור 4 מציג assay פעילות זמן תלוי מייצג. ...

פרוטוקול פשוט overexpression וטיהור של קודון אופטימיזציה, CIS- perrenyltransferase אדם, בתנאים שאינם denaturing, מ Escherichia Coli , מתואר, יחד עם assay פעילות אנזימטית. פרוטוקול זה ניתן להכליל לייצור של חלבונים אחרים cis- prenyltransferase בכמות ואיכות מתאים ללימודי מכניסטית.

Overexpression וטיהור האדם Cis פרנליטרונפרפרז ב Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לבטא יתר על המידה ולטהר את cis-prenyltransferase אנושי מותאם לקודון בתנאים שאינם דנטורציה ולבחון את פעילותו האנזימטית. ההליך מודגם עם cis-prenyltransferase dehydrodolichyl diphosphate synthase, או DHDDS. שיטה זו יכולה לקדם את ההבנה שלנו לגבי סינתזת איזופרנואידים ולספק תובנות מפתח לגבי המנגנון הפתופיזיולוגי של רטיניטיס פיגמנטוזה הקשורה למוטציות ב-DHDDS.היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא פשוטה, חסכונית וחוסכת זמן. ניתן גם להכליל אותו לייצור בכמויות גבוהות של חלבוני cis-prenyltransferase אחרים. התחל הליך זה בשיבוט ביטוי של DHDDS אנושי, כמתואר בפרוטוקול הטקסט.השעו מחדש את התאים במאגר A, מיקרוגרם אחד למיליליטר של DNase I, ותערובת מעכבי פרוטאז. לאחר מכן, הומוגניזציה של התאים התלויים באמצעות הומוגנייזר טפלון מזכוכית. לשבש את התאים עם מיקרופלואידיזר או שווה ערך ב-12,000 עד 15,000 psi.לאחר מכן, צנטריפוגה של התא ליזאט ב -40, 000 פעמים גרם למשך 45 דקות בארבע מעלות צלזיוס. שחזר את הסופרנטנט המכיל את החלק המסיס. טען את הסופרנטנט על עמוד כרומטוגרפיה של מתכת משותקת של 5 עד 10 מילימטר עם אימידזול של 10 מילי-מולרי.לאחר הטעינה למכונת כרומטוגרפיה נוזלית מהירה של חלבון, בצע שטיפה יסודית של העמודה עם מאגר A באימידזול של 10 מילי-מולר על מנת להפחית את קשירת החלבון הלא ספציפית. התחל את תוכנית FPLC. לחסל את החלבונים המתבטאים יתר על המידה עם בופר A בתוספת 250 מילי-מולארי אימידזול.לאחר הפליטה, הסר את האימידזול באמצעות 53 מיליליטר של עמוד התפלה מכין מאוזן עם מאגר A.לאחר מכן, הוסף פרוטאז TEV מתויג הקסהיסטידין לחלבונים המנופחים כדי להסיר את היתוך התיורדוקסין DHDDS המתויג בהקסהיסטידין. דוגרים על התערובת בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר מכן, טען את החלבונים המפוצלים על עמודת כרומטוגרפיה של זיקה מתכתית משותקת קובלט מאוזנת עם מאגר A בתוספת אימידזול של חמישה מילי-מולריות.אסוף את הזרימה כדי להסיר את התיורדוקסין והפרוטאז TEV המתויגים בהקסהיסטידין. רכז את הזרימה בין שלושה לארבעה מיליליטר באמצעות מסנן צנטריפוגלי מנותק במשקל מולקולרי של 30 קילודלטון. לאחר מכן, טען את החלבון המרוכז על עמודת כרומטוגרפיה של אי הכללה בגודל Superdex 200 המאוזנת עם מאגר A לטיהור סופי.מניחים את הדגימות במתלה של 96 בארות בקולט שברים. החלבון נפלט כדימר. בחר שברים רלוונטיים על ידי השוואת פרופיל הפליטה לעקומת כיול עמודות.בשלב זה, העריכו את טוהר התכשיר באמצעות SDS-PAGE. לבסוף, קבע את ריכוז החלבון הדרוש לניסויים במורד הזרם והקפאת בזק של חלבונים מרוכזים מטוהרים בחנקן נוזלי. אחסן את המינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.כדי להבטיח את יכולתו של החלבון לעמוד במחזורי הקפאה-הפשרה, יש להפשיר כמות גדולה של החלבונים הקפואים. צנטריפוגה את האליקוט ב 21, 000 פעמים גרם למשך 10 דקות להסרת אגרגטים בלתי מסיסים. לאחר הצנטריפוגה, אספו את הסופרנטנט.לאחר מכן, טען את החלבונים על עמודה אנליטית Superdex 200 מאוזנת מראש עם TNXB באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד. עקוב אחר הקרינה של הטריפטופן כדי לזהות את פרופיל הפליטה של החלבון. הקפד על עקומת כיול תקפה להערכת משקל מולקולרי, הזמינה דרך יצרני עמודות ה-SEC.כדי להבטיח את פעילות החלבון המטוהר, יש לערבב תחילה חמישה מיקרו-מולרים של DHDDS מטוהרים עם 10 FPP מיקרו-מולרי ו-50 מיקרו-מולרי C14 IPP. התחל את התגובה במאגר A עם 0.5 מילי-מולרי מגנזיום כלוריד בטמפרטורה של 22 עד 30 מעלות צלזיוס. משוך 15 דגימות מיקרוליטר מהתגובה באפס, שעתיים, ארבע ושש שעות לאחר הכיבוי המיידי של התגובה על ידי תוספת של 15 מיקרוליטר של מאגר A בתוספת 20 מילי-מולרי EDTA.לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של 1-בוטנול רווי מים ומערבולת ביסודיות כדי לחלץ את תוצרי התגובה. ניתן לעצור את הפרוטוקול כאן, וניתן לשמור את הדגימות לקריאה מאוחרת יותר. לאחר מכן, הוסף את קוקטייל הנצנוץ לדגימות.באמצעות מונה נצנוץ, כמת תוצרי תגובה בשלב הבוטנול המקיף C14 יחד עם רדיואקטיביות של 15 מיקרוליטר של התגובה, המייצגים את הרדיואקטיביות הכוללת. לבסוף, חשב את שילוב ה-IPP נטו של C14 בכל נקודת זמן על ידי חישוב האחוז המנוצל מסך ריכוזי ה-IPP של C14 ושרטט את התוצאות כפונקציה של זמן. עלייה בהתאגדות ה-IPP נטו של C14 צפויה עם הזמן.הדגימות המתקבלות בכל שלב טיהור מוצגות כאן. ניתוח SDS-PAGE זה מראה את הטיהור ההדרגתי של DHDDS, והתוצאה היא מוצר מטוהר מאוד. כרומטוגרמה זו מייצגת את התוצאות של כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל אנליטי של האנזים המטוהר, ומגלה כי החלבון נצפה רק כהומודימר.כאן, החץ מציין את נפח הריק. בדיקת פעילות מייצגת תלוית זמן מגלה כי שילוב C14 IPP עולה בבירור במשך שש שעות, ומאמת שהאנזים המטוהר מתפקד. לאחר השליטה, ניתן לבצע את ההכנה הפשוטה הזו תוך יומיים-שלושה, והתוצאה היא אנזים טהור ופעיל ביותר.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבטא יתר על המידה ולטהר את cis-prenyltransferase אנושי מ-E.coli ולמדוד את פעילותו באופן תלוי זמן.

overexpression-purification-human-cis-prenyltransferase-escherichia

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

פרוטוקול של חמישה ימים זה מתאר את כל השלבים, ציוד ותוכנה נוספת דרושה ליצירה והפעלת מערכת ביטוי תא ללא TX-TL מאפס חיידקי Escherichia אנדוגני יעילים מבוססים. עם חומרים כימיים, הפרוטוקול לוקח 8 שעות או פחות להגדרת תגובה, לאסוף, ולעבד נתונים.

פרוטוקולים ליישום חיידקי Escherichia בהתבסס TX-TL סלולרי ללא ביטוי של ביולוגיה סינתטית

גישה יעילה לבדיקות סקר לאיתור הביטוי של חלבונים בממברנה רקומביננטי בcoli Escherichia מבוסס על היתוך לחלבון פלואורסצנטי ירוק מוצגת.

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

ביטוי משותף של חלבונים הוא אלטרנטיבה רבת עוצמה לבנייה מחדש במבחנה של קומפלקסים של חלבונים, והוא מסייע בביצוע בדיקות ביוכימיות וגנטיות in vivo. כאן אנו מדווחים על השימוש בביטוי משותף של חלבונים ב-Escherichia coli כדי להשיג קומפלקסים של חלבונים, ולכוונן את תדירות המוטציות של התאים.

תועלת רבה פנים של Co-ביטוי חלבון ב<em&gt; Coli Escherichia</em

תחומים אבץ אצבע הם מיסוד תא חדיר ומסוגל תיווך משלוח חלבון למגוון רחב של סוגי יונקים תא. כאן, פרוטוקול צעד-אחר-צעד מפורט ליישום טכנולוגית אבץ-אצבע למסירת חלבון תאית מוצג.

משלוח חלבון ישיר לשימוש בתאי יונקי Cys Cell-חדיר<sub&gt; 2</sub&gt; כלי-<sub&gt; 2</sub&gt; Domains אבץ האצבע

זהו פרוטוקול מהיר וחסכוני לייצור חלבוני יונקים מופרשים ומסוכררים וטיהור חד-שלבי לאחר מכן עם תפוקות מספיקות של חלבון הומוגני לקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן ומחקרים ביופיזיקליים אחרים.

ביטוי יעיל יונקים ניידים וטיהור חד צעד של תאי גליקופרוטאינים להתגבשות

ייצור בקנה מידה מעבדתי של חלבונים אוקריוטיים עם שינוי מתאים לאחר התרגום מייצג מחסום משמעותי. להלן פרוטוקול חזק עם התבססות מהירה ותפנית לביטוי חלבון באמצעות מערכת ביטוי יונקים. מערכת זו תומכת בחומצות אמינו סלקטיביות, תיוג סלקטיבי של חלבונים ומודולטורים של מולקולות קטנות של הרכב הגליקן.

ביטוי תשואה גבוהה של חלבונים אנושיים רקומביננטי עם transfection חולף של תאי HEK293 בהשעיה

ניתוחים הביוכימי ומבניים של חלבונים glycosylated דורשים כמויות גדולות יחסית של דגימות הומוגנית. כאן, אנו מציגים שיטה כימית יעילה עבור גליקוזילציה בייעודי לאתר של חומרים מטוהרים של חיידקים על ידי מיקוד תיולים Cys תגובתי.

מכוונת ציסטאין תיולים במבחנה גליקוזילציה בייעודי לאתר של חומרים

ביולוגיה סינתטית מאפשר ההנדסה של חלבונים עם מאפיינים חסרת תקדים באמצעות החדרת חומצות אמינו קאנונית co-translational. . הנה, הצגנו איך spectrally אדום-העביר גרסה של fluorophore GFP-סוג עם מאפייני ספקטרוסקופיות הרומן פלורסצנטיות, הנקרא חלבון פלואורסצנטי "זהב" (GdFP), מופק ב e. coli באמצעות הלחץ הסלקטיבי ההתאגדות (SPI).

הנדסת קרינה פלואורסצנטית 'הזהב' על-ידי הלחץ הסלקטיבי התאגדות של חומצות אמינו קאנונית, אנליזת חלבונים באמצעות ספקטרומטר מסה, קרינה פלואורסצנטית

פרוטוקול זה מתאר טכניקות המשמשות לקביעת יון ערוץ מבנים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הקפאה, כולל מערכת baculovirus שנועדה להביע ביעילות גנים בתאים בתרבית של מינימום מאמץ, רעילות, חלבון החילוץ, טיהור, בדיקת איכות, הכנת הדוגמא רשת ו ההקרנה, כמו גם איסוף נתונים, עיבוד.

הביטוי ולטיהור TRPC3 האדם רגיש השומנים הקטיון ערוץ לקביעת מבניים על-ידי הקפאה יחיד-חלקיקים-מיקרוסקופ

אנו מתארים שיטה לאפיון של מובילי הממברנה המונעת על ידי פרוטון בתכשירים ושלפוחית ממברנה המיוצרים על ידי ביטוי הטרוולוגי ב -E. coli והליזה של תאים באמצעות עיתונות צרפתית.

אפיון מובילי הממברנה על ידי ביטוי הטרוולוגי ב -E. coli וייצור ממברנה ושלפוחיות

מאמר זה מתאר מתודולוגיה לביטוי יתר של Nsp15 רקומביננטי, נוקלאז רעיל, במערכת ביטוי C41(DE3), ואחריה טיהור החלבון המתויג באמצעות כרומטוגרפיה של זיקה והדרת גודל. ניתן להתאים את הפרוטוקולים האלה לחלבונים רעילים מאתגרים אחרים.

שאיבת יתר וטיהור נוקלאז רעיל מ-Escherichia coli

למד להביע יתר ולטהר את האנזים האנושי cis-prenyltransferase ב-Escherichia coli בתנאי אי-דנטורציה. שיטה זו מאפשרת חקר סינתזת איזופרנואידים והבנת מנגנון רטיניטיס פיגמנטוזה.

Overexpression וטיהור האדם Cis פרנליטרונפרפרז ב Escherichia coli

גלה סרטונים נוספים