אסיית ההגירה של טרנסוול
העברת תאים בתגובה לרמזים כימיים חיונית להתפתחות, חסינות ומדינות מחלות כגון סרטן. כדי לכמת את נדידת התאים, ב-1961 פותחה ב-1961 נדידת תאים פשוטה על ידי…
נדידת טרנסוול היא טכניקה קלאסית המאפשרת למדענים לכמת את תנועת התאים. העברה מתייחסת ליכולתו של תא לנוע בנפרד או באשכולות. תנועות תאים מתאפשרות באמצעות ארגון מחדש מדויק של הציטוסקלטון שלהם והנדידה מתרחשת בדרך כלל בתגובה לגירויים הפועלים כרמזים.
היום, נדון בבחינת ההגירה הטרנסוולית, שמשתמשת במערך תא פשוט כדי להעריך הגירה בתגובה לרמזים מושכים.
נתחיל על ידי מתן קצת מידע רקע על תא transwell.
המנגנון תוכנן לראשונה על ידי ד"ר סטיבן בוידן בשנת 1961, שהשתמש בו כדי לחקור את הגירת הלויקוציטים. לכן, שיטה זו ידועה גם בשם אסאי חדר בוידן.
בתא בויידן פשוט, הקיר החיצוני הוא של בארות, כמו אלה של צלחת 96-באר. בתוך כל באר, טרנסוול, שהוא תוספת גלילית, ממוקם. לתוספת יש קרום פוליקרבונט בגודל נקבובית מוגדר. כאשר הוא ממוקם בבאר, הוא מחלק את התא לשני תאים. התא העליון הוא המקום שבו תאים שהתנהגות הנדידה שלהם היא להיחקר יהיה זרע, ואת המאגר התחתון הוא המקום שבו הפתרון של chemoattractant ממוקם. בהגדרה, כימותרפיה היא מולקולה שיש לה את היכולת לקדם תנועתיות תאים על ידי "משיכת תאים".
בשל כוחות אטרקטיביים אלה, תאים בתא העליון נודדים דרך הנקבוביות אל המאגר התחתון. אם לתאים יש תכונות דבקות, כמו כמה תאי מלנומה, בעקבות התנועה הם "מקל" לחלק התחתון של הממברנה. במקרה זה, ניתן לתקן את הממברנה, להכתים אותה, וניתן לספור תאים מתחת למיקרוסקופ. מצד שני, תאים שאינם דבקים, כמו זרע, יעברו למאגר התחתון. במקרה זה, תאים בפתרון המאגר ניתן לספור בעזרת המוציטומטר.
למרות ההתקנה עבור מבחן זה הוא פשוט, ישנם כמה דברים שאתה צריך לשקול לפני הניסוי. בואו נעבור על כמה מהם.
החל מפתרון הזריעה, עליך לוודא שהצפיפות ממוטבת כדי לצפות בנדידת תאים. מעט מדי תאים יכולים לגרום לנדידה בלתי ניתנת לגילוי, וצפיפות גדולה יותר תאכלס יתר על המידה את הממברנה, מה שמקשה על הספירה של ההגירה. השיקול השני הוא גודל הנקבבובית של ההוספה. יש לבחור אותו בקפידה בהתאם לסוג התא. אם גודל הנקבבובית קטן מדי, התאים לא יוכלו לעבור דרכם.
לחלופין, אם גודל הנקבבובית גדול מדי, תאים פשוט ייפלו, וזה לא העברה. לבסוף, יש לשים לב לריכוז הכימותרפי וזמן הדגירה שיש לאפשר הגירה, שכן אלה תלויים זה בזה. ריכוז אופטימלי עם זמן דגירה מתאים שבמהלכו ריכוז הדרגתי נשמר בין התאים, גורמת לנדידת תאים בשל המשיכה הכימותרפית. לעומת זאת, דגירה ממושכת עשויה להיות מלווה בשיווי משקל של כימותרפיה בכל התא המוביל לאובדן שיפוע כימי, אשר יכול לבלבל את ניתוח התוצאות שהושגו.
בהתחשב בשיקולים אלה, בואו נדון בפרוטוקול המשמש למדידת הגירה של תאים חסידים.
תאים שיש לתחקר מוכנים במדיום נטול פרוטאז, שכן פרוטאזים יכולים להוקיע קולטני ממברנה חשובים, ובסופו של דבר להשפיע על ההגירה. לאחר תאים מוכנים, ההשעיה צריכה להיות מדוללת לצפיפות זריעה אופטימלית. על מנת להכין את התא, transwells ממוקמים בארות על צלחת multiwell. מתלה תא צריך להיות pipetted לתוך transwell מבלי לגעת בממברנה או החדרת בועות אוויר.
פתרון Chemoattractant הוא pipetted לתוך המאגר התחתון, מוודא הפתרון נוגע בקרום של הכנס. זמן הדגירה של הנדידה יהיה תלוי בשיקולים הניסיוניים. לאחר הדגירה, הממברנות קבועות על ידי טבילת ההוספה לתוך 70% אתנול. לאחר מתן אפשרות לתוספת להתייבש, נוסף תמיסת כתמי תאים.
לאחר מכן, תאים הם דגירה במשך כ 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, התוספות נשטפות בעזרת חוצץ כביסה. לבסוף, ניתן לחתוך את הממברנה ולהניח אותה על שקופית מיקרוסקופ. תאים בחלק התחתון של הממברנה מייצגים את מספר התאים שהיגרו בנוכחות ובהיעדר כימותרפיה.
מאז, עכשיו יש לך תחושה של הפרוטוקול, בואו נסתכל בקצרה על איך חוקרים משתמשים בשיטה זו בחקירות שלהם.
אחד היישומים הנפוצים ביותר של זה assay הוא להעריך תכונות chemoattractant של תרכובות לא ידועות. כאן, מדענים התעניינו בבחינת נתיבי שחייה של זרע צפרדע בנוכחות אלורין, שהוא חומר המופרש על ידי ביצי דו-חיים. כדי לעשות זאת, הם העבירו תחילה זרע צפרדע פעיל לחלק העליון של התוספות הטרנסווליות. לתחתית, הם הוסיפו אלורין. לאחר שאפשרו לתאים לנדוד, הם ספרו זרע בתמיסת המאגר תחת מיקרוסקופ. באמצעות טכניקה זו, הם הצליחו ליצור עקומת תגובת ריכוז המתארת את ההשפעה של ריכוז אלורין על נדידת זרע.
כאשר תא מותקף על ידי פתוגנים, הוא שולח כימותרפיה לגייס תאים חיסוניים הנודדים, לצרף, ולאחר מכן לפתור זיהום. כדי לבחון את התופעה, מדענים אלה תרבדו תאי אפיתל בצד התחתון של התוספות. לאחר מכן, הם הדביקו תאים אלה בזנים שונים של חיידקים. לבסוף, הם הכניסו תאי חיסון לתא העליון. ידוע כי התאים הנגועים מייצרים מספר כימותרפיה הגורמת לנדידת תאי החיסון. תוצאות ניסוי זה הדגימו דרגות שונות של נדידת נויטרופילים בתגובה לסוגים שונים של זיהום חיידקי.
לבסוף, פלישת תאים סרטניים וחלטה דרך המטריצה החוץ תאית תמיד סיקרנו ביולוגים של תאים. כאן, מדענים רצו לקבוע כיצד כימותרפיה ספציפית יכולה לתרום לנדידה כזו באמצעות מטריצה תלת-ממדית. הם מהונדסים גנטית שתי בריכות נפרדות של תאים: אחת המבטאת פלואורסצנטית ירוקה, והאחר פלואורסצנטי אדום, חלבון. לאחר מכן הם העבירו מטריצה-חיקוי חוץ-תאית לראש הטרנסוולים.
לאחר שהתגבשו, הם הקימו את הטרנסוול וזרעו שתי בריכות תאים לחלק התחתון של הממברנה. לאחר מכן, הם החליפו את ההחדרה לתוך צלחת multiwell והכניסו את הפתרון הכימותרפי לתא העליון. זה גרם לתאים בתחתית לנוע למעלה ודרך מטריצת 3D. בעזרת הדמיה קונפוקלית, חוקרים אלה שיחזרו את העברת התאים בתלת-ממד, והבחינו בין דפוסי ההעברה של שתי קבוצות תאים.
הרגע צפית בסרטון של ג'וב על מבדת ההגירה של טרנסוול. עם ההבנה של הרכיבים והפרוטוקול של שיטה זו, עכשיו אתה יודע למה זה נמצא בשימוש נרחב כל כך על ידי ביולוגים תא. למרות הפשטות של התקנה זו, מגוון התצורות שיטה זו יכולה להתאים עושה את זה הכרחי עבור מחקרי תנועתיות התא. כמו תמיד, תודה שצפית!
נדידת טרנסוול היא טכניקה קלאסית המאפשרת למדענים לכמת את תנועת התאים. העברה מתייחסת ליכולתו של תא לנוע בנפרד או באשכולות. תנועות תאים מתאפשרות באמצעות ארגון מחדש מדויק של הציטוסקלטון שלהם והנדידה מתרחשת בדרך כלל בתגובה לגירויים הפועלים כרמזים.
היום, נדון בבחינת ההגירה הטרנסוולית, שמשתמשת במערך תא פשוט כדי להעריך הגירה בתגובה לרמזים מושכים.
נתחיל על ידי מתן קצת מידע רקע על תא transwell.
המנגנון תוכנן לראשונה על ידי ד"ר סטיבן בוידן בשנת 1961, שהשתמש בו כדי לחקור את הגירת הלויקוציטים. לכן, שיטה זו ידועה גם בשם אסאי חדר בוידן.
בתא בויידן פשוט, הקיר החיצוני הוא של בארות, כמו אלה של צלחת 96-באר. בתוך כל באר, טרנסוול, שהוא תוספת גלילית, ממוקם. לתוספת יש קרום פוליקרבונט בגודל נקבובית מוגדר. כאשר הוא ממוקם בבאר, הוא מחלק את התא לשני תאים. התא העליון הוא המקום שבו תאים שהתנהגות הנדידה שלהם היא להיחקר יהיה זרע, ואת המאגר התחתון הוא המקום שבו הפתרון של chemoattractant ממוקם. בהגדרה, כימותרפיה היא מולקולה שיש לה את היכולת לקדם תנועתיות תאים על ידי "משיכת תאים".
בשל כוחות אטרקטיביים אלה, תאים בתא העליון נודדים דרך הנקבוביות אל המאגר התחתון. אם לתאים יש תכונות דבקות, כמו כמה תאי מלנומה, בעקבות התנועה הם "מקל" לחלק התחתון של הממברנה. במקרה זה, ניתן לתקן את הממברנה, להכתים אותה, וניתן לספור תאים מתחת למיקרוסקופ. מצד שני, תאים שאינם דבקים, כמו זרע, יעברו למאגר התחתון. במקרה זה, תאים בפתרון המאגר ניתן לספור בעזרת המוציטומטר.
למרות ההתקנה עבור מבחן זה הוא פשוט, ישנם כמה דברים שאתה צריך לשקול לפני הניסוי. בואו נעבור על כמה מהם.
החל מפתרון הזריעה, עליך לוודא שהצפיפות ממוטבת כדי לצפות בנדידת תאים. מעט מדי תאים יכולים לגרום לנדידה בלתי ניתנת לגילוי, וצפיפות גדולה יותר תאכלס יתר על המידה את הממברנה, מה שמקשה על הספירה של ההגירה. השיקול השני הוא גודל הנקבבובית של ההוספה. יש לבחור אותו בקפידה בהתאם לסוג התא. אם גודל הנקבבובית קטן מדי, התאים לא יוכלו לעבור דרכם.
לחלופין, אם גודל הנקבבובית גדול מדי, תאים פשוט ייפלו, וזה לא העברה. לבסוף, יש לשים לב לריכוז הכימותרפי וזמן הדגירה שיש לאפשר הגירה, שכן אלה תלויים זה בזה. ריכוז אופטימלי עם זמן דגירה מתאים שבמהלכו ריכוז הדרגתי נשמר בין התאים, גורמת לנדידת תאים בשל המשיכה הכימותרפית. לעומת זאת, דגירה ממושכת עשויה להיות מלווה בשיווי משקל של כימותרפיה בכל התא המוביל לאובדן שיפוע כימי, אשר יכול לבלבל את ניתוח התוצאות שהושגו.
בהתחשב בשיקולים אלה, בואו נדון בפרוטוקול המשמש למדידת הגירה של תאים חסידים.
תאים שיש לתחקר מוכנים במדיום נטול פרוטאז, שכן פרוטאזים יכולים להוקיע קולטני ממברנה חשובים, ובסופו של דבר להשפיע על ההגירה. לאחר תאים מוכנים, ההשעיה צריכה להיות מדוללת לצפיפות זריעה אופטימלית. על מנת להכין את התא, transwells ממוקמים בארות על צלחת multiwell. מתלה תא צריך להיות pipetted לתוך transwell מבלי לגעת בממברנה או החדרת בועות אוויר.
פתרון Chemoattractant הוא pipetted לתוך המאגר התחתון, מוודא הפתרון נוגע בקרום של הכנס. זמן הדגירה של הנדידה יהיה תלוי בשיקולים הניסיוניים. לאחר הדגירה, הממברנות קבועות על ידי טבילת ההוספה לתוך 70% אתנול. לאחר מתן אפשרות לתוספת להתייבש, נוסף תמיסת כתמי תאים.
לאחר מכן, תאים הם דגירה במשך כ 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, התוספות נשטפות בעזרת חוצץ כביסה. לבסוף, ניתן לחתוך את הממברנה ולהניח אותה על שקופית מיקרוסקופ. תאים בחלק התחתון של הממברנה מייצגים את מספר התאים שהיגרו בנוכחות ובהיעדר כימותרפיה.
מאז, עכשיו יש לך תחושה של הפרוטוקול, בואו נסתכל בקצרה על איך חוקרים משתמשים בשיטה זו בחקירות שלהם.
אחד היישומים הנפוצים ביותר של זה assay הוא להעריך תכונות chemoattractant של תרכובות לא ידועות. כאן, מדענים התעניינו בבחינת נתיבי שחייה של זרע צפרדע בנוכחות אלורין, שהוא חומר המופרש על ידי ביצי דו-חיים. כדי לעשות זאת, הם העבירו תחילה זרע צפרדע פעיל לחלק העליון של התוספות הטרנסווליות. לתחתית, הם הוסיפו אלורין. לאחר שאפשרו לתאים לנדוד, הם ספרו זרע בתמיסת המאגר תחת מיקרוסקופ. באמצעות טכניקה זו, הם הצליחו ליצור עקומת תגובת ריכוז המתארת את ההשפעה של ריכוז אלורין על נדידת זרע.
כאשר תא מותקף על ידי פתוגנים, הוא שולח כימותרפיה לגייס תאים חיסוניים הנודדים, לצרף, ולאחר מכן לפתור זיהום. כדי לבחון את התופעה, מדענים אלה תרבדו תאי אפיתל בצד התחתון של התוספות. לאחר מכן, הם הדביקו תאים אלה בזנים שונים של חיידקים. לבסוף, הם הכניסו תאי חיסון לתא העליון. ידוע כי התאים הנגועים מייצרים מספר כימותרפיה הגורמת לנדידת תאי החיסון. תוצאות ניסוי זה הדגימו דרגות שונות של נדידת נויטרופילים בתגובה לסוגים שונים של זיהום חיידקי.
לבסוף, פלישת תאים סרטניים וחלטה דרך המטריצה החוץ תאית תמיד סיקרנו ביולוגים של תאים. כאן, מדענים רצו לקבוע כיצד כימותרפיה ספציפית יכולה לתרום לנדידה כזו באמצעות מטריצה תלת-ממדית. הם מהונדסים גנטית שתי בריכות נפרדות של תאים: אחת המבטאת פלואורסצנטית ירוקה, והאחר פלואורסצנטי אדום, חלבון. לאחר מכן הם העבירו מטריצה-חיקוי חוץ-תאית לראש הטרנסוולים.
לאחר שהתגבשו, הם הקימו את הטרנסוול וזרעו שתי בריכות תאים לחלק התחתון של הממברנה. לאחר מכן, הם החליפו את ההחדרה לתוך צלחת multiwell והכניסו את הפתרון הכימותרפי לתא העליון. זה גרם לתאים בתחתית לנוע למעלה ודרך מטריצת 3D. בעזרת הדמיה קונפוקלית, חוקרים אלה שיחזרו את העברת התאים בתלת-ממד, והבחינו בין דפוסי ההעברה של שתי קבוצות תאים.
הרגע צפית בסרטון של ג'וב על מבדת ההגירה של טרנסוול. עם ההבנה של הרכיבים והפרוטוקול של שיטה זו, עכשיו אתה יודע למה זה נמצא בשימוש נרחב כל כך על ידי ביולוגים תא. למרות הפשטות של התקנה זו, מגוון התצורות שיטה זו יכולה להתאים עושה את זה הכרחי עבור מחקרי תנועתיות התא. כמו תמיד, תודה שצפית!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the transwell migration assay and why is it used in cell biology?
The transwell migration assay, also called the Boyden chamber assay, is a classical technique designed in 1961 to quantify cell movement in response to chemical cues. It uses a simple chamber setup with a polycarbonate membrane separating two compartments. Scientists seed cells in the top chamber and place chemoattractant solution below, then count migrated cells to measure cell motility and cell invasion and chemo attraction responses.
Q2: How does the transwell chamber separate cells and chemoattractants?
The transwell chamber consists of a cylindrical insert with a polycarbonate membrane of defined pore size placed inside a multiwell plate well. This membrane divides the chamber into two compartments: the top compartment holds cells to be studied, and the bottom reservoir contains chemoattractant solution. Cells migrate through the membrane pores toward the attracting chemical gradient in the lower compartment.
Q3: What factors must be optimized before running a transwell migration assay?
Three critical factors require optimization: cell seeding density must be balanced to detect migration without overpopulation; pore size must match the cell type so cells can pass through without falling through; and chemoattractant concentration with appropriate incubation time must maintain a chemical gradient. Prolonged incubation can equilibrate the chemoattractant throughout the chamber, eliminating the gradient and confounding results.
Q4: How are adherent cells counted after migration in a transwell assay?
After incubation, the transwell membrane is fixed by dipping the insert into 70% ethanol and allowed to dry. Cell staining solution is then applied for approximately 30 minutes at room temperature. Following washing with buffer, the membrane is excised and placed on a microscope slide. Cells on the membrane's underside represent those that migrated and can be counted microscopically.
Q5: Why is protease-free medium used when preparing cells for the transwell assay?
Protease-free medium is essential because proteases can denature important membrane receptors that are critical for cell migration. Damaged receptors would impair the cell's ability to respond to chemoattractant signals, compromising the accuracy of migration measurements and potentially underestimating or misrepresenting the cell's true migratory capacity.
Q6: What are common research applications of the transwell migration assay?
Researchers use the transwell assay to evaluate chemoattractant properties of unknown compounds, test immune cell recruitment in response to infection, and study cancer cell invasion through extracellular matrices. The assay's adaptability allows scientists to examine migration in various contexts, from simple 2D membrane assays to complex 3D matrix invasion studies using fluorescent cell tracking.
Q7: How do adherent and non-adherent cells differ in transwell migration assays?
Adherent cells, like melanoma cells, stick to the membrane's underside after migration and are counted by fixing, staining, and microscopic observation of the membrane. Non-adherent cells, like sperm, migrate into the bottom reservoir solution and are counted using a hemocytometer. The counting method depends on the cell type's inherent adhesive properties.