הערכת במבחנה נזק לדנ א שימוש Assay שביט

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לחקור את יעילותם של חומרים גנוטוקסיים בתאים סרטניים באמצעות בדיקת אלקטרופורזה של תא בודד, הנקראת גם בדיקת שביט. הליך זה הוא חוש למדידת ארבעת המחקרים הטוקסיקולוגיים הגנטיים. וזה ישים לערכים שונים, כגון בחירת מועמדים לתרופה מוקדמת יותר והמחקר הבסיסי בנזק ל-DNA ותיקון.

טכניקה זו מספקת דרך ישירה להעריך כמותית את הנזק ל-DNA. וזה יעיל, קל לביצוע וזול יחסית. הכינו את האגרוז לציפוי שקופיות על ידי המסת אחוז אחד של אגרוז במיקרוגל למשך שתיים-שלוש דקות או עד שהאגרוז נמס לחלוטין.

טבלו שקופית מיקרוסקופ זכוכית לתוך האגרוז והשתמשו במגבון נטול מוך כדי לנגב צד אחד של השקופית. הנח את השקופית על משטח ישר לייבוש באוויר. יש ליצור סרט אגרוז שקוף לאחר הייבוש.

מניחים את השקופיות המצופות ב-37 מעלות צלזיוס לפני השימוש. ההשפעה הטיפולית של כימותרפיה מוערכת בתאי גליומה U251 שגודלו במדיום DMEM/Ham F-12 בתוספת 10% FBS, 100 יחידות למיליליטר פניצילין ו-10 מיקרוגרם למיליליטר סטרפטומיצין. עכל את התאים באמצעות מיליליטר אחד של טריפסין במשך שלוש דקות, ולאחר מכן נטרל את הטריפסין באמצעות מדיום DMEM/Ham F-12 עם FBS.

אוספים את התאים בצינור של 15 מיליליטר. וסובב ב -300 פעמים G למשך ארבע דקות. שאפו את המדיום.

ולהשעות את התאים פעמיים פי 10 עד חמישית תאים למיליליטר ב-1x PBS. תאים ויש להכין אותם מיד לפני תחילת הבדיקה. ויש לטפל בזה בחושך.

הכל באור עמום כדי למנוע נזק. שלב את תרחיף התאים עם אחוז אחד מותך, נקודת התכה נמוכה ביחס נפח של אחד ל -10. מערבבים בעדינות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.

ומיד פיפטה 30 מיקרוליטר על מגלשה. השתמש בשקופית של קצה הפיפטה כדי לפזר את תערובת האגרוז כדי להבטיח היווצרות שכבה דקה. הניחו את המגלשות שטוחות בארבע מעלות צלזיוס, בחושך, למשך 10 דקות.

טבלו את המגלשות בתמיסת ליזה של ארבע מעלות צלזיוס, בחושך למשך שעה עד לילה. לבדיקת השביט האלקליין, הסר בעדינות שקופיות מתמיסת הליזיס, נקז עודפי נוזלים וטבל בעדינות שקופיות ב-AES, בחושך בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה כדי לאפשר ל-DNA להירגע. הוסף AES מקורר מראש במגש ההחלקה של האלקטרופורזה.

אין לחרוג מ-0.5 ס"מ מעל המגלשות. מניחים את השקופיות בפנים ומכסים במכסה. הגדר את מתח אספקת החשמל לוולט אחד לסנטימטר והפעל בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

לאחר השלמת האלקטרופורזה, רוקנו עודפי AES מהשקופיות. טבלו בעדינות את השקופיות פעמיים במים מזוקקים בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות בכל פעם. לאחר מכן, טבלו בעדינות את השקופיות באתנול 70% בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

לבדיקת השביט הנייטרלי, הסר בעדינות את השקופיות מתמיסת הליזיס, נקז עודפי נוזלים וטבול בעדינות ב-NES בחושך, בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הוסף NES מקורר מראש במגש שקופיות האלקטרופורזה, שלא יעלה על 0.5 סנטימטרים מעל השקופיות. מניחים את השקופיות בפנים ומכסים במכסה.

הגדר את מתח אספקת החשמל לוולט אחד לסנטימטר והפעל בארבע מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. מסננים את המאגר העודף מהשקופיות. טבלו בעדינות את השקופיות בתמיסת משקעי DNA בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.

לאחר 30 דקות, טבלו בעדינות את השקופיות באתנול 70% בחדר ממוזג למשך 30 דקות. התחל הליך זה על ידי ייבוש השקופיות בחושך ב -37 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות. לאחר מכן, הניחו 50-100 מיקרוליטר של תמיסת צביעת חומצת גרעין פלואורסצנטית ירוקה על האגרוז המיובש של כל שקופית, וצבעו במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.

שוטפים את השקופיות לזמן קצר במים מזוקקים, ומייבשים לחלוטין בחום של 37 מעלות צלזיוס בחושך. בצע רכישת תמונות וניתוח מיד לאחר צביעת שקופיות השביט. הנח שקופית מתחת למיקרוסקופ פלורסנט עם מחזיק שקופיות.

בחר את עדשת האובייקט 10X וודא שג'ל האגרוז פונה לעדשת האובייקטיב. צלם באופן אקראי תמונות מכל שקופית שביט מוכתמת. הימנע מהקצוות ומהאזורים סביב בועות אוויר.

ודא שכל זנב שביט מפוזר אופקית. ראשי שביט צריכים להגיע משמאל, והזנב מימין. שמור כל תמונה בפורמט בינארי עם כתם DNA בהיר ורקע כהה.

לניתוח תמונה, טען תחילה את כל התמונות לתוכנת בדיקת השביט, באמצעות כפתור בחירת קבצים לניתוח, הממוקם בצד שמאל של סרגל הכלים. חלון תצוגת תמונה אמור להופיע. צייר מסגרת מדידה על המסך, והתאם את גודלה בהתאם לשביט התא.

לחץ על התאם כדי להגדיר את סף הראש, השביט והזנב, בהתאם לתמונה. ולאחר מכן לחץ על התחל מדידות. בחר תא באמצעות המסגרת והפעל את המדידה על ידי לחיצה על כפתור Assay the Comet.

תמונת עוצמה תופיע בחלון הפרופילים, עם פרמטרי המדידה שנבחרו. שמור את התוצאות על ידי לחיצה על כפתור תוצאות החנות. נתח לפחות 50 תאים בכל טיפול.

תוצאות מבדיקות השביט האלקליין והנייטרלי מראות כי זנבות השביט של תאי UT51 שטופלו בדוקסורוביצין היו ארוכים יותר ובעלי עוצמת DNA גבוהה יותר, מה שמרמז על הצטברות משמעותית של DNA מקוטע. ניתוח כמותי עבור בדיקת השביט האלקליין או הנייטרלי, הראה היווצרות מוגברת משמעותית של זנב השביט, לאחר טיפולי דוקסורוביצין, מה שמצביע על נזק ל-DNA. טיפול משולב של מעכב PARP, אולפוריב וחומר אלקילטי, טמוזולומיד, שיפר משמעותית את נזק ה-DNA בתאי גליומה, המשתקף באורך ובעוצמה המוגברים של אות זנב השביט.

אולפוריב לבדו לא גרם נזק לדנ"א. כאשר זה הגביר את ההשפעה הגנוטוקסית של טמוזולומיד. תמונות מייצגות של תאי גליומה בטיפולים בודדים ומשולבים, הראו את זנבות השביט הארוכים והעוצמתיים יותר של תאים שטופלו בטמוזולומיד ואולפורב.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך חמש שעות, אם היא מבוצעת כראוי. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הגנוטוקסיות למדוד שבירות מחרוזת DNA בסוגים רבים של תאים אוקריוטיים. כגון תאים מתורבתים או תאים מבודדים מאורגניזמים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש במבחן השביט כדי לחקור את היעילות של חומר גנוטוקסי ברמת התא הבודד. אל תשכח שעבודה עם מגיב הנזק עלולה להיות מסוכנת ביותר. ותמיד יש לנקוט באמצעי הזהירות, כגון לבישת מעיל מעבדה וכפפות, בעת ביצוע הליך זה.