Name: הערכת במבחנה נזק לדנ א שימוש Assay שביט (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: למדו להעריך נזק ל-DNA בתאי סרטן באמצעות שיטת Comet Assay. טכניקה זו מאפשרת זיהוי שבירות DNA בודדות וכפולות ברמת התא הבודד, ומסייעת במחקר גנטוטוקסיות ובהערכת יעילות טיפולי כימותרפיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי תוכנית מחקר מגזר של NIH, NCI, CCR. כל המחברים קיבל מענק מחקר מגזר NIH, NCI, CCR.

1. להכין ריאגנטים <ol><li>1 x PBS <ol><li>לדלל PBS 10 x 100 מ עם 900 מל dH 2 O ולהתאים את ה-pH ל 7.4 באמצעות מד pH. חנות בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol></li> <li>פירוק פתרון (LS) <ol><li>להכין 2.5 M NaCl, EDTA ניתרן 100 מ מ, 10 מ מ טריס בסיס ו-200 מ מ NaOH 900 מל dH 2 O; זה בדרך כלל לוקח בערך 20 דקות כדי לאפשר את התערובת עד התמוססות מלאה. להתאים את ה-pH 10 באמצעות מד pH. להוסיף 1% נתרן לאוריל sarcosinate ו 1% X-100 טריטון, ולכוונן את העוצמה הסופי 1,000 מ ל. מגניב עד 4 ° C במשך לפחות 30 דקות לפני השימוש.</li>
	</ol></li> <li>הפתרון אלקטרופורזה אלקליין (AES), pH &gt; 13 <ol><li>להכין 200 מ"מ NaOH, 1 מ ניתרן EDTA 800 מ ל dH 2 O. התאם את ה-pH, לוודא כי זה pH &gt; 13. לכוון את עוצמת הקול הסופי 1,000 מ. להפוך טריים לפני השימוש. ומגניב עד 4 ° C במשך לפחות 30 דקות לפני השימוש.</li>
	</ol></li> <li>Sollution אלקטרופורזה נייטרלי (נס) <ol><li>מאגר אלקטרופורזה נייטרלי mL 1,000 להכין על ידי ערבוב 100 מ מ טריס 300 מ"מ, בסיס סודיום אצטט 1,000 מ ל dH 2 O. התאם את ה-pH ל 9.0 עם חומצה אצטית. מגניב עד 4 ° C במשך לפחות 30 דקות לפני השימוש.</li>
	</ol></li> <li>DNA משקעים פתרון (DPS) <ol><li>הכנה של 10 מ ל 7.5 מ' אמוניום אצטט מניות. עבור 50 מל ' של ה-DNA משקעים פתרון, מערבבים 6.7 מ ל 7.5 מ' אמוניום אצטט עם 43.3 מ ל 95% אתנול. חנות בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol></li> <li>Staining פתרון <ol><li>µL 1 להוסיף 10,000 x כתם ירוק ניאון חומצת גרעין (למשל, SYBR Green) ב 30 מ ל טריס-EDTA מאגר (טריס-HCl, EDTA ניתרן 1 מ מ, 10 מ מ pH 7.4) וחנות ב-4 ° C. הגן על מ אור-</li>
	</ol></li> <li>1% נמוך נמס agarose <ol><li>להמיס התכה נקודת agarose (1 גרם 100 מ ל dH 2 O) במיקרוגל נמוכה 1%. מערבולת agarose כל 15-20 s כדי לוודא agarose מותך לחלוטין. מניחים את agarose באמבט מים 37 º C למשך לפחות 20 דקות לפני השימוש.</li>
	</ol></li> <li>פיפטה חם מראש טיפים <ol><li>לחתוך את הקצוות הצרים של P200 פיפטה טיפים על ידי 3 מ מ וחמים ב 37 מעלות צלזיוס לפני pipetting agarose.</li>
	</ol></li></ol> 2. להכין שביט שקופיות <ol><li>שקופית ציפוי <ol><li>להמיס 1% agarose (1 גרם 100 מ ל dH 2 O) במיקרוגל למשך 2-3 דקות או עד agarose זה לגמרי מותכת. טובלים את שקופיות מיקרוסקופ זכוכית לתוך agarose ונגב בצד אחד של השקופית באמצעות מגבון נטולת מוך.</li>
		<li>להניח את השקופיות על משטח שטוח מילה נהדרת או חום ב 50 מעלות צלזיוס לייבוש מהיר יותר; סרט שקוף agarose צריך להיווצר לאחר הייבוש. מקם את השקופיות מצופה ב- 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.</li>
	</ol></li> <li>הכנה של תא בודד המתלים <ol><li>התרבות ועל לטיפול התא glioma <ol><li>התרבות התאים מ ג U251 F-12 DMEM-חזיר בינוני בתוספת 10% FBS, פניצילין U/mL 100 ו- 10 סטרפטומיצין µg/mL-37 &amp; # 176; C עם 5% CO 2.</li>
			<li>לעכל את התאים באמצעות טריפסין 1 מ"ל למשך 3 דקות, ולנטרל טריפסין באמצעות DMEM-חזיר F-12 בינוני עם FBS. לאסוף בצינור 15 מ"ל, ספין ב g x 300 במשך 4 דקות, תשאף המדיום, וכן להשעות תאים בחלק 2 x 10 5 תאים למ"ל ב- PBS 1 x. 
			הערה: המדגם התא צריך להיות מוכן מיד לפני תחילת וזמינותו ויש לטפל כל דוגמאות בסביבה כהה או מעומעמים כדי למנוע נזק לדנ א של אור-</li>
			<li>לשלב התליה תא עם 1% agarose נקודת התכה נמוכה מותכת (ב 37 מעלות צלזיוס) ביחס של 1:10 (v/v), לערבב בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה, מיד פיפטה µL 30 לשקופית. השתמש בצד כף הטיפ פיפטה להפיץ את התערובת תא agarose על מנת להבטיח את היווצרות שכבה דקה.</li>
			<li>למקם את השקופית שטוח 4 ° C בחושך במשך 10 דקות הגדלת הזמן ג'לי 30 דקות משפר את דבקותה של דגימות בסביבות לחות גבוהה.</li>
			<li>לטבול את השקופית ב 4 ° C LS בחושך 1 h ללון.</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 3. יחיד אלקטרופורזה תא <ol><li>להמשיך לשלב אלקליין (3.2) או נייטרלי (שלב 3.3) שביט assay</li> <li>עבור assay שביט אלקליין <ol><li>להסיר בעדינות שקופיות LS לנקז עודף מאגר, בעדינות לטבול AES עבור 1 h-4 ° C כדי לאפשר רגיעה הדנ א. לשמור את השקופיות בחושך.</li>
		<li>הוסף AES טרום מקורר במגש שקופית אלקטרופורזה, לא יעלה על 0.5 ס מ מעל השקופיות (זה תלוי בגודל של היחידות אלקטרופורזה), מקום של שקופיות בתוך ולכסות עם כובע. הגדר המתח V 1/ס מ (האורך בין האלקטרודות) ולהפעיל למשך 30 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס</li>
		<li>ניקוז עודפי אלקטרופורזה פתרון משקופית לשקופית. בעדינות לטבול פעמיים בשקופיות dH 2 O עבור 5 דקות כל בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>לטבול בעדינות שקופיות אתנול 70% למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. המשך לשלב 4.</li>
	</ol></li> <li>עבור שביט נייטרלי assay <ol><li>בעדינות להסיר את השקופיות האם לנקז עודף מאגר, בעדינות לטבול נס למשך 30 דקות ב-4 ° C. לשמור השקופית בחושך.</li>
		<li>הוסף מאגר מראש צוננת אלקטרופורזה נייטרלי במגש שקופית אלקטרופורזה, לא יעלה על 0.5 ס מ מעל שקופיות (זה תלוי בגודל של היחידות אלקטרופורזה), מקום של שקופיות בתוך ולכסות עם כובע. הגדר המתח V 1/ס מ (האורך בין האלקטרודות) ולהפעיל למשך 45 דקות ב-4 מעלות צלזיוס</li>
		<li>ניקוז מאגר עודף מהשקופיות. בעדינות לטבול בשקופיות DPS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>לטבול בעדינות את השקופיות אתנול 70% למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. המשך לשלב 4.</li>
	</ol></li></ol> 4. כתם כוכב השביט שקופיות <ol><li>יבש שקופיות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות בחושך.</li>
	<li>במקום 50-100 µL ירוק ניאון חומצת גרעין מכתים פתרון על גבי כל אחד מיובש agarose, הכתם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.</li>
	<li>שוטפים את השקופיות בקצרה dH 2 O ומייבשים לחלוטין ב 37 מעלות צלזיוס בחושך. להמשיך ייבוא תמונות וניתוח.</li>
</ol> 5. תמונה של רכישת ניתוח הערה: ויזואליזציה של כימות של ה-DNA מעברי מבוססים על מיקרוסקופ epifluorescence את התוכנה assay שביט (ראה טבלה של חומרים) 12 .
<ol><li>מקום השקופיות על המיקרוסקופ עם בעל שקופיות. ודא שהג'ל agarose פונה על העדשה אובייקטיבי. באופן אקראי ללכוד תמונות משקופיות שביט מוכתם באמצעות מיקרוסקופ זריחה עם עדשה המטרה 10 x. להימנע הקצוות ואזורים סביב כל בועות האוויר.</li>
	זנב השביט <li>ודא כל מופץ בצורה אופקית. שביט ראשי צריכה לנבוע שמימין ואת הזנב מימין.</li>
	<li>לשמור כל תמונה בפורמט TIF בינארי עם כתם בהיר דנ א, רקע כהה. טעינת תמונות באמצעות התוכנה " בחר קבצים כדי לנתח " כפתור, הנמצא בצד השמאל של סרגל הכלים. חלון התצוגה של התמונה אמורה להופיע ( איור 1).</li>
	<li>לצייר מסגרת מדידה על המסך ולהתאים את גודלו לפי כוכב השביט של התא. לחץ " התאם " כפתור כדי להגדיר את הסף של הראש, שביט, הזנב לפי התמונה ולאחר מכן לחץ על " להתחיל מדידות " לחצן ( איור 1).</li>
	<li>בחר תא באמצעות המסגרת ולהפעיל את המדידה על ידי לחיצה עם העכבר על " Assay כוכב השביט " לחצן; עוצמת של התמונה מופיע " פרופילים " חלון עם הפרמטרים מדידה שנבחרה. ניתן לשמור את התוצאות על-ידי לחיצה " לאחסן תוצאות " לחצן ( איור 1). 
	הערה: התוכנה מחשבת את הפרמטרים כולל אורך הזנב שביט, האחוז של ה-DNA זנב, מהרגע הזנב (TM) וברגע הזנב זית (OTM). הרגעים הזנב מחושבים לפי הנוסחאות כדלקמן: <img alt="משוואת חישוב TM, ניתוח DNA, נוסחה למומנט הזנב בהערכת נזק ל-DNA." src="/files/ftp_upload/56450/56450eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> <img alt="נוסחת חישוב OTM; משוואה לניתוח נזקי DNA בבדיקת שביט." src="/files/ftp_upload/56450/56450eq2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 2"></li> <li>לנתח לפחות 50 תאים לכל טיפול.</li>
</ol>

<ol><li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).</li>
<li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Exp Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).</li>
<li>Tice, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+gel%2Fcomet+assay%3A+guidelines+for+in+vitro+and+in+vivo+genetic+toxicology+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Mol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Single cell gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing.</a> Environ Mol Mutagen. 35 (3), 206-221 (2000).</li>
<li>Shah, A. J., Lakkad, B. C., Rao, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotoxicity+in+lead+treated+human+lymphocytes+evaluated+by+micronucleus+and+comet+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Genotoxicity in lead treated human lymphocytes evaluated by micronucleus and comet assays.</a> Indian J Exp Biol. 54 (8), 502-508 (2016).</li>
<li>Azqueta, A., Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essential+comet+assay%3A+a+comprehensive+guide+to+measuring+DNA+damage+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol%22%5BJournal%5D)">The essential comet assay: a comprehensive guide to measuring DNA damage and repair.</a> Arch Toxicol. 87 (6), 949-968 (2013).</li>
<li>Goldstein, M., Kastan, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+damage+response%3A+implications+for+tumor+responses+to+radiation+and+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">The DNA damage response: implications for tumor responses to radiation and chemotherapy.</a> Annu Rev Med. 66, 129-143 (2015).</li>
<li>Gavande, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+repair+targeted+therapy%3A+The+past+or+future+of+cancer+treatment%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">DNA repair targeted therapy: The past or future of cancer treatment?</a> Pharmacol Ther. 160, 65-83 (2016).</li>
<li>Torgovnick, A., Schumacher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+repair+mechanisms+in+cancer+development+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA repair mechanisms in cancer development and therapy.</a> Front Genet. 6, 157(2015).</li>
<li>Weston, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PARP+inhibitor+olaparib+induces+significant+killing+of+ATM-deficient+lymphoid+tumor+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The PARP inhibitor olaparib induces significant killing of ATM-deficient lymphoid tumor cells in vitro and in vivo.</a> Blood. 116 (22), 4578-4587 (2010).</li>
<li>Brown, J. S., O'Carrigan, B., Jackson, S. P., Yap, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+DNA+Repair+in+Cancer%3A+Beyond+PARP+Inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Targeting DNA Repair in Cancer: Beyond PARP Inhibitors.</a> Cancer Discov. 7 (1), 20-37 (2017).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensitivity+of+IDH1-Mutated+Gliomas+Due+to+an+Impairment+in+PARP1-Mediated+DNA+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Chemosensitivity of IDH1-Mutated Gliomas Due to an Impairment in PARP1-Mediated DNA Repair.</a> Cancer Res. 77 (7), 1709-1718 (2017).</li>
<li>Konca, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cross-platform+public+domain+PC+image-analysis+program+for+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">A cross-platform public domain PC image-analysis program for the comet assay.</a> Mutat Res. 534 (1-2), 15-20 (2003).</li>
<li>Valverde, M., Rojas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+and+occupational+biomonitoring+using+the+Comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Environmental and occupational biomonitoring using the Comet assay.</a> Mutat Res. 681 (1), 93-109 (2009).</li>
<li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+for+DNA+damage+and+repair%3A+principles%2C+applications%2C+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations.</a> Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).</li>
<li>Karbaschi, M., Cooke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+for+the+high-throughput+processing+of+slides+for+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Novel method for the high-throughput processing of slides for the comet assay.</a> Sci Rep. 4, 7200(2014).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

וזמינותו שביט הוא כלי יעיל למדידת יחיד כפול-גדיל DNA ומעברי ברמה התאית. וזמינותו הוחל נרחב בתור "תקן הזהב" מחקרים בנוגע genotoxicity, אפידמיולוגיה סביבתית13, החל נגעים הבסיס, DNA crosslinks, פיתוח תרופות, ואתרים אלקליות רגיש. במחקר הנוכחי, הראנו שני פרוטוקולים ברורים צעד אחר צעד עבור מבחני שביט אלקליין ונייטרלי, בהתאמה. שילוב של תא בודד אלקטרופורזה מיקרוסקופ פלואורסצנטי, פרשנות התמונה, בשני מבחני שביט אלקליין ונייטרלי מספקים גישות כמותיים כדי להעריך את מידת ה-DNA נזק במבחנה.
<p class=...

וזמינותו שביט פותחה לראשונה על ידי Ostling ג'והנסון בשנת 1984 על ידי הפגנת שההעברה של ה-DNA שברים הגרעינים תחת מצב ניטראלי1. הטכניקה פותחה מאוחר יותר על ידי סינג. et al., מראה כי תנאי בסיסי גדל באופן משמעותי את ירידה לפרטים ואת הפארמצבטית assay2. מאז, וזמינותו שביט ניטרלי משמש בעיקר כדי לזהות כפול גדילי DNA מעברי, בעוד וזמינותו שביט אלקליין רגיש יותר עבור כמויות קטנות יותר של ה-DNA נזק, לרבות יחיד כפול גדיל DNA שובר, אתרי אלקלי-יציב, DNA-DNA או חלבון-דנ א cross-linking, מעברי יחיד-גדיל DNA המשויך כריתה לא שלם תיקון אתרי3,4. שני מבחני לאפשר ויזואליזציה של DNA מפוצלים, מספקים דרך פשוטה באופן כמותי להעריך נזק לדנ א. וזמינותו שביט נחשבת שיטה רגישה מחקרים רעילות גנטיים בתוך חוץ גופית וויוו , החלים על שטחי מחקר שונים, כגון מבחר סמים-המועמד מוקדם, ניטור סביבתי, אפידמיולוגיה סביבתית אנושית, ו הבסיסית מחקר נזק לדנ א ותיקון5.
עקרון וזמינותו היא תחת שדה חשמלי, DNA מפוצלים נודד אל מחוץ לגוף נוקלאואיד (הידוע גם בשם "ראש שביט") יוצרת כתם DNA הג'ל agarose (הידוע גם בשם "זנב השביט"). עם נוקלאוטיד מכתים, ניתן לכמת את מידת נזק לדנ א על-ידי ניתוח "שביט" שהוקמה על ידי אלקטרופורזה תא בודד זה. חישוב של הרגע הזנב יכול לסייע עוד יותר להשוות נזק לדנ א בין קבוצות שונות ניסיוני. לעומת שיטות מסורתיות של זיהוי ה-DNA נזק, וזמינותו שביט היא ישירה, רגיש, זולות, פשוטות יחסית.
הקרנות chemotherapies נמצאים אסטרטגיות נפוצות לטיפול בסרטן על ידי יצירת לחוט אחד, שובר זוגי גדיל DNA כרומוזום6. ההתקדמות האחרונה ב- DNA תיקון מעכבי מאפשר השפעה genotoxic יעיל יותר על-ידי שילוב כימותרפיה, לכן, פוטנציאל מפחית את תופעות מערכתיות כגון אנמיה, דלקת ו מח עצם דיכוי7, 8. במחקר זה, הראנו החקירה של מעכב פולימראז (PARP) פוליפוני (ADP-ריבוז), olaparib (אולה)9. PARP הוא חלבון גרעיני בשפע והוא אחראי על DNA כריתה הבסיס לתקן על ידי יצירת פולימר פוליפוני (ADP-ריבוז)10. Temozolomide (TMZ) הוא סוכן החומר זמין, כבר בשימוש נרחב לטיפול החולה glioma. באמצעות וזמינותו שביט לכמת נזק לדנ א, נדגים שילוב olaparib עם temozolomide עמוקות מגבירה את הנזק ה-DNA בתאי glioma, אשר מציע טיפול משולב olaparib/temozolomide היא אסטרטגיית יעיל לטיפול glioma, לעומת לבד temozolomide11.

<table><tbody><tr><td><חזק>ריאגנטים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x PBS(Ca++, Mg++ free)</td><td>TEKnova</td><td>P0196</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>TEKnova</td><td>E0308</td><td></td></tr><tr><td>בסיס Trizma</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>נתרן לאוריל סרקוזינאט</td><td>סיגמא</td><td>L7414</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>סיגמא</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אצטט</td><td>סיגמא</td><td>32318</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית קרחונית</td><td>סיגמא</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום אצטט</td><td>סיגמא</td><td>A1542</td><td></td></tr><tr><td>SYBR ירוק</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>נמוך נקודת התכה אגרוז</td><td>Invitrogen</td><td>16520</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500</td><td></td></tr><tr><td>95% אתנול</td><td>WARNER-GRAHAM</td><td>#64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>GIBICO</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Name</strong</td><td>>Company</td><td>Catalog</td><td>Comments</חזק</td></tr><tr><td>><חזק>חומרים מתכלים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>זכוכית שקופיות רקמת</td><td>אלקטרונים</td><td>63422-11</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>KIMberly-Clark</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>DENVILLE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>טיפים לפיפטות</td><td>חד<</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חזק>שם</חזק></td><td>חברה</td><td>מספר קטלוגי</td><td>הערות</td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microwave</td><td>Avanti</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>PRECISION</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תא אלקטרופורזה אופקי</td><td>TREVIGEN</td><td>Cometassay ES II</td><td></td></tr><tr><td>ספק כוח</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Quincy Lab</td><td>דגם 12-140E</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>מיקרופיפטור</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הערכת במבחנה נזק לדנ א שימוש assay שביט

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

נזק לדנ א היא תופעה נפוצה עבור כל תא במהלך תוחלת החיים שלה, מוגדר שינוי של המבנה הכימי של הדנ א. טיפולים בסרטן, כגון רדיו, כימותרפיה, להציג כמות עצומה של נזק לדנ א נוסף, המוביל אפופטוזיס של מחזור התא מעצר כדי להגביל את התקדמות סרטן. הערכה כמותית של נזק לדנ א במהלך טיפול ניסיוני בסרטן היא צעד המפתח כדי להצדיק את האפקטיביות של סוכן genotoxic. במחקר זה, אנו מתמקדים assay אלקטרופורזה תא בודד, ידוע גם בשם השביט וזמינותו, אשר יכולים לכמת יחיד, כפול-גדיל DNA שובר במבחנה. וזמינותו שביט היא שיטה כימות של ה-DNA נזק יעיל, קל לביצוע, ויש לו דרישות הזמן/תקציב נמוך ו הפארמצבטית גבוהה. כאן, אנחנו להדגיש את התועלת של שביט וזמינותו למחקר פרה על ידי הערכת אפקט genotoxic של טיפול משולב olaparib/temozolomide לתאים glioma U251.

בפרוטוקול הנוכחי מתאר צעד אחר צעד זרימת עבודה כדי להפוך את כוכב השביט וזמינותו של ביצוע ניתוח נתונים (איור 1). תוצאות מבחני שביט אלקליין ונייטרלי הראה כי זנב השביט של תאים U251 שטופלו דוקסורוביצין (1 מיקרומטר, 20 h) היה ארוך וכי היה בעוצמה גבוהה יותר דנ א, רומז הצטברות משמעותית של DNA מפוצלים עקב כימותרפיה (איור 2).
ניתוח כמותי עבור וזמינותו שביט אלקליין או נייטרלי או ה...

שביט וזמינותו היא שיטה יעילה לאיתור נזק לדנ א כולל יחיד, כפול גדילי ה-DNA שובר. אנו מתארים שביט אלקליין ונייטרלי מבחני למדוד נזק לדנ א בתאים סרטניים כדי להעריך את השפעת טיפולי כימותרפיה.

הערכת במבחנה נזק לדנ א שימוש Assay שביט

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לחקור את יעילותם של חומרים גנוטוקסיים בתאים סרטניים באמצעות בדיקת אלקטרופורזה של תא בודד, הנקראת גם בדיקת שביט. הליך זה הוא חוש למדידת ארבעת המחקרים הטוקסיקולוגיים הגנטיים. וזה ישים לערכים שונים, כגון בחירת מועמדים לתרופה מוקדמת יותר והמחקר הבסיסי בנזק ל-DNA ותיקון.טכניקה זו מספקת דרך ישירה להעריך כמותית את הנזק ל-DNA. וזה יעיל, קל לביצוע וזול יחסית. הכינו את האגרוז לציפוי שקופיות על ידי המסת אחוז אחד של אגרוז במיקרוגל למשך שתיים-שלוש דקות או עד שהאגרוז נמס לחלוטין.טבלו שקופית מיקרוסקופ זכוכית לתוך האגרוז והשתמשו במגבון נטול מוך כדי לנגב צד אחד של השקופית. הנח את השקופית על משטח ישר לייבוש באוויר. יש ליצור סרט אגרוז שקוף לאחר הייבוש.מניחים את השקופיות המצופות ב-37 מעלות צלזיוס לפני השימוש. ההשפעה הטיפולית של כימותרפיה מוערכת בתאי גליומה U251 שגודלו במדיום DMEM/Ham F-12 בתוספת 10% FBS, 100 יחידות למיליליטר פניצילין ו-10 מיקרוגרם למיליליטר סטרפטומיצין. עכל את התאים באמצעות מיליליטר אחד של טריפסין במשך שלוש דקות, ולאחר מכן נטרל את הטריפסין באמצעות מדיום DMEM/Ham F-12 עם FBS.אוספים את התאים בצינור של 15 מיליליטר. וסובב ב -300 פעמים G למשך ארבע דקות. שאפו את המדיום.ולהשעות את התאים פעמיים פי 10 עד חמישית תאים למיליליטר ב-1x PBS. תאים ויש להכין אותם מיד לפני תחילת הבדיקה. ויש לטפל בזה בחושך.הכל באור עמום כדי למנוע נזק. שלב את תרחיף התאים עם אחוז אחד מותך, נקודת התכה נמוכה ביחס נפח של אחד ל -10. מערבבים בעדינות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.ומיד פיפטה 30 מיקרוליטר על מגלשה. השתמש בשקופית של קצה הפיפטה כדי לפזר את תערובת האגרוז כדי להבטיח היווצרות שכבה דקה. הניחו את המגלשות שטוחות בארבע מעלות צלזיוס, בחושך, למשך 10 דקות.טבלו את המגלשות בתמיסת ליזה של ארבע מעלות צלזיוס, בחושך למשך שעה עד לילה. לבדיקת השביט האלקליין, הסר בעדינות שקופיות מתמיסת הליזיס, נקז עודפי נוזלים וטבל בעדינות שקופיות ב-AES, בחושך בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה כדי לאפשר ל-DNA להירגע. הוסף AES מקורר מראש במגש ההחלקה של האלקטרופורזה.אין לחרוג מ-0.5 ס"מ מעל המגלשות. מניחים את השקופיות בפנים ומכסים במכסה. הגדר את מתח אספקת החשמל לוולט אחד לסנטימטר והפעל בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.לאחר השלמת האלקטרופורזה, רוקנו עודפי AES מהשקופיות. טבלו בעדינות את השקופיות פעמיים במים מזוקקים בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות בכל פעם. לאחר מכן, טבלו בעדינות את השקופיות באתנול 70% בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.לבדיקת השביט הנייטרלי, הסר בעדינות את השקופיות מתמיסת הליזיס, נקז עודפי נוזלים וטבול בעדינות ב-NES בחושך, בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הוסף NES מקורר מראש במגש שקופיות האלקטרופורזה, שלא יעלה על 0.5 סנטימטרים מעל השקופיות. מניחים את השקופיות בפנים ומכסים במכסה.הגדר את מתח אספקת החשמל לוולט אחד לסנטימטר והפעל בארבע מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. מסננים את המאגר העודף מהשקופיות. טבלו בעדינות את השקופיות בתמיסת משקעי DNA בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.לאחר 30 דקות, טבלו בעדינות את השקופיות באתנול 70% בחדר ממוזג למשך 30 דקות. התחל הליך זה על ידי ייבוש השקופיות בחושך ב -37 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות. לאחר מכן, הניחו 50-100 מיקרוליטר של תמיסת צביעת חומצת גרעין פלואורסצנטית ירוקה על האגרוז המיובש של כל שקופית, וצבעו במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.שוטפים את השקופיות לזמן קצר במים מזוקקים, ומייבשים לחלוטין בחום של 37 מעלות צלזיוס בחושך. בצע רכישת תמונות וניתוח מיד לאחר צביעת שקופיות השביט. הנח שקופית מתחת למיקרוסקופ פלורסנט עם מחזיק שקופיות.בחר את עדשת האובייקט 10X וודא שג'ל האגרוז פונה לעדשת האובייקטיב. צלם באופן אקראי תמונות מכל שקופית שביט מוכתמת. הימנע מהקצוות ומהאזורים סביב בועות אוויר.ודא שכל זנב שביט מפוזר אופקית. ראשי שביט צריכים להגיע משמאל, והזנב מימין. שמור כל תמונה בפורמט בינארי עם כתם DNA בהיר ורקע כהה.לניתוח תמונה, טען תחילה את כל התמונות לתוכנת בדיקת השביט, באמצעות כפתור בחירת קבצים לניתוח, הממוקם בצד שמאל של סרגל הכלים. חלון תצוגת תמונה אמור להופיע. צייר מסגרת מדידה על המסך, והתאם את גודלה בהתאם לשביט התא.לחץ על התאם כדי להגדיר את סף הראש, השביט והזנב, בהתאם לתמונה. ולאחר מכן לחץ על התחל מדידות. בחר תא באמצעות המסגרת והפעל את המדידה על ידי לחיצה על כפתור Assay the Comet.תמונת עוצמה תופיע בחלון הפרופילים, עם פרמטרי המדידה שנבחרו. שמור את התוצאות על ידי לחיצה על כפתור תוצאות החנות. נתח לפחות 50 תאים בכל טיפול.תוצאות מבדיקות השביט האלקליין והנייטרלי מראות כי זנבות השביט של תאי UT51 שטופלו בדוקסורוביצין היו ארוכים יותר ובעלי עוצמת DNA גבוהה יותר, מה שמרמז על הצטברות משמעותית של DNA מקוטע. ניתוח כמותי עבור בדיקת השביט האלקליין או הנייטרלי, הראה היווצרות מוגברת משמעותית של זנב השביט, לאחר טיפולי דוקסורוביצין, מה שמצביע על נזק ל-DNA. טיפול משולב של מעכב PARP, אולפוריב וחומר אלקילטי, טמוזולומיד, שיפר משמעותית את נזק ה-DNA בתאי גליומה, המשתקף באורך ובעוצמה המוגברים של אות זנב השביט.אולפוריב לבדו לא גרם נזק לדנ"א. כאשר זה הגביר את ההשפעה הגנוטוקסית של טמוזולומיד. תמונות מייצגות של תאי גליומה בטיפולים בודדים ומשולבים, הראו את זנבות השביט הארוכים והעוצמתיים יותר של תאים שטופלו בטמוזולומיד ואולפורב.לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך חמש שעות, אם היא מבוצעת כראוי. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הגנוטוקסיות למדוד שבירות מחרוזת DNA בסוגים רבים של תאים אוקריוטיים. כגון תאים מתורבתים או תאים מבודדים מאורגניזמים.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש במבחן השביט כדי לחקור את היעילות של חומר גנוטוקסי ברמת התא הבודד. אל תשכח שעבודה עם מגיב הנזק עלולה להיות מסוכנת ביותר. ותמיד יש לנקוט באמצעי הזהירות, כגון לבישת מעיל מעבדה וכפפות, בעת ביצוע הליך זה.

evaluating-in-vitro-dna-damage-using-comet-assay

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

בסרטון זה, אנו מדגימים בדיקת אלקטרופורזה חד-תאית בסיסית כדי לכמת הפסקות דנ"א חד-גדילי ודו-גדילי בתאים שטופלו בדוקסורוביצין. תנאים בסיסיים משבשים את קשרי המימן בין זוגות בסיסי דנ"א, וכתוצאה מכך מתרופפים ונפרדים לחלוטין גדילי הדנ"א. זה מאפשר נדידה דיפרנציאלית של מקטעי DNA לא פגומים ופגועים בג'ל אגרוז על אלקטרופורזה, חושף מבנה בצורת שביט של דנ"א נודד לאט שלא ניזוק ויוצר את ראש השביט המעגלי, ונדידה מהירה של מקטעי DNA פגומים היוצרים את זנב השביט המוארך.

אלקטרופורזה ג'ל אלקליין חד-תאי: טכניקה רגישה להערכה כמותית של נזק לדנ"א בתאי סרטן בודדים לאחר כימותרפיה

הסרטון מדגים את בדיקת השביט לאיתור נזק לדנ"א בעקבות חשיפה לחומרים מזיקים. בתנאים בסיסיים, הדנ"א משתחרר ומתפרק, ועם אלקטרופורזה, הדנ"א שלא ניזוק וניזוק נודד באופן שונה בג'ל האגרוז, ויוצר מבנה בצורת שביט. הדנ"א הנודד לאיטו ללא נזק יוצר את ראש השביט המעגלי, בעוד שמקטעי הדנ"א הפגומים הנודדים במהירות יוצרים את זנב השביט המוארך.

בדיקת שביט לגילוי נזק לדנ"א בתאים

Assay השביט הוא דרך יעילה לאיתור הפסקות בודדות וגדיל כפול, לרבות אתרים אלקלי רופפים וDNA-DNA/DNA-protein-קישורי צלב שעל ה-DNA בכל התאים, כוללים נוירונים ביפוקמפוס. השיטה מנצלת את הגירת ההפרש של ה-DNA בשדה חשמלי בשל הבדלים בכמות הניזק לדנ"א.

Assaying ניזק לדנ&quot;א בנוירונים ביפוקמפוס שימוש Assay השביט

אנו מתארים כאן פלטפורמה שמאפשרת זיהוי assay שביט של נזק לדנ"א עם תפוקה חסרת תקדים. דפוסי מכשיר תאי יונקים לmicroarray ומאפשר עיבוד מקביל של 96 דגימות. הגישה מאפשרת ניתוח של קינטיקה הנזק לדנ"א רמת בסיס, נזק לדנ"א הנגרם על ידי חשיפה ותיקון DNA.

CometChip: תפוקה גבוהה 96-ובכן פלטפורמה למדידת נזק לדנ&quot;א בתאי Microarrayed אדם

assay שביט מודד הפסקות DNA, הנגרמות על ידי גורמים שונים. אם כל הגורמים (מלבד סטרס חמצונים) גורמים נזק לדנ"א נשמרים קבועים, הסכום של נזק לדנ"א הוא פרמטר עקיף טוב של סטרס חמצונים. המטרה של פרוטוקול זה היא להשתמש assay שביט למדידה עקיפה של סטרס חמצונים.

שביט Assay כאמצעי עקיף של מתח מערכתי חמצוני

בדיקת השביט האלקליין מודדת שבירות גדילי DNA בתאים אוקריוטיים. על ידי הוספת שלב עיכול של אנדונוקלאז III או 8-אוקסוגואנין-DNA-N-גליקוזילאז אנושי, הבדיקה יכולה לזהות ביעילות נזק חמצוני ל-DNA. אנו מתארים שיטות לשימוש במבחנים האלה כדי לזהות נזק לדנ"א בכבד של חולדות.

In vivo אלקליין השביט Assay ואנזים-modified אלקליין השביט Assay עבור מדידת Breaks Strand דנ&quot;א נזק חמצוני דנ&quot;א עכברוש הכבד

פרוטוקול זה מתאר מספר הליכים להכנת דגימות רקמה באיכות גבוהה קפואה בזמן נקרוזה לשימוש במערכת שביט להעריך נזק DNA: 1) רקמות טחון, 2) מגורד תאים אפיתל ממערכת העיכול, ו 3) לקוביות רקמה דגימות, הדורשות הומוגון באמצעות מכשיר משתמש ברקמה.

שימוש ברקמות קפואות בתוך שיטת שביט להערכת נזק לדנ א

בדיקת השביט היא אמצעי פופולרי לאיתור נזק לדנ"א. מחקר זה מתאר גישה להפעלת שקופיות בגרסאות מייצגות של בדיקת השביט. גישה זו הגדילה משמעותית את מספר הדגימות תוך הפחתת זמן הריצה של הבדיקה, מספר מניפולציות השקופיות והסיכון לפגיעה בג'לים.

גישת בדיקת שביט בתפוקה גבוהה להערכת נזק לדנ"א תאי

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה לכימות ההבדל בנזק ל-DNA הנגרם על ידי מעכבים מסוג I וסוג II בתאים מוטנטיים מסוג FLT3 באמצעות יישום מבחן השביט.

בדיקת שביט לכימות נזק ל-DNA בתאי 32D המבטאים מוטציה FLT3 לאחר חשיפה למעכבי FLT3 מסוג I ו-II

פרוטוקול זה מתאר של assay הפוכה הפלישה אנכי יכול לשמש כדי לכמת את יכולות העברת ופלישה של תאים בתוך תפאורה תלת מימדי תוך שמירה על microenvironment תא. Assay הזה מתאים תאים נדירים ו/או רגישים.

נעים כלפי מעלה: פשוט וגמיש במבחנה הפלישה תלת מימדי Assay פרוטוקול

למדו להעריך נזק ל-DNA בתאי סרטן באמצעות שיטת Comet Assay. טכניקה זו מאפשרת זיהוי שבירות DNA בודדות וכפולות ברמת התא הבודד, ומסייעת במחקר גנטוטוקסיות ובהערכת יעילות טיפולי כימותרפיה.

הערכת במבחנה נזק לדנ א שימוש Assay שביט

גלה סרטונים נוספים