שיטות מחקר לשינויים הגלום צבירת חלבון עם הגיל ב Caenorhabditis elegans

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לזהות שינויים בחוסר מסיסות החלבון עם הגיל ב-C.elegans ולהעריך כיצד הפלת גנים ממוקדת משפיעה על סמן ההזדקנות הזה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ההזדקנות ופרוטאוסטזיס, כגון מדוע אורגניזמים לא מצליחים לשמור על פרוטאום בריא עם הגיל. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא ההזדמנות לחקור צבירת חלבונים במהלך הזדקנות רגילה בהיעדר תהליכי מחלה.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי צבירת חלבונים ב-C.elegans, ניתן להתאים אותה גם לאורגניזמים מודלים אחרים, למשל לחקר אי מסיסות חלבון הקשורה לגיל בעכבר. כדי להתחיל בטיפול, הוסף 207.45 מיליליטר של מדיה בזאלית S עם ריאגנטים נוספים כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה לבקבוק תרבית פרנבך של 2,800 מיליליטר. הוסף ריכוז סופי של 50 מיקרוגרם למיליליטר קרבניצילין ומילימולר אחד של IPTG וסגור את הבקבוק עם מכסה בורג ממברנה.

הוציאו את ה-L1 מהחממה של 25 מעלות צלזיוס והעבירו אותם לצינורות של 15 מיליליטר. צנטריפוגה L1 ב-1, 900 פעמים גרם למשך שלוש דקות. לאחר הסיבוב, הסר את הסופרנטנט.

תחת מיקרוסקופ, ספרו את ה-L1 לשני מיקרוליטר וממוצע את המספרים המתקבלים מתשע טיפות לפחות. לאחר מכן, הוסיפו 50,000 תולעים לאוסף התולעים הצעירות ו-100,000 תולעים לאוסף התולעים המבוגרות לארבע צלוחיות תרבית פרנבך שהוכנו בשלב הקודם. לאחר מכן, הוסיפו חיידקי RNAi בקרה וחיידקי RNAi עבור הגן המעניין באופן פרופורציונלי למספר התולעים.

לאחר הוספת חיידקים, השלימו תרבית תולעים עם S Basal כדי להביא את הנפח הכולל ל-300 מיליליטר. דגרו את תרבית התולעים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בחממה רועדת עם 150 סל"ד עד לאיסוף. אסוף תולעים צעירות ביום השני או השלישי כדי למדוד את רמות החלבון הבסיסיות.

שופכים את התולעים מבקבוק אחד למשפך הפרדה ונותנים לתולעים לשקוע במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שקיעת התולעים, פתח את זין העצירה וטפטף את התולעים לתוך צינור אחד של 50 מיליליטר. לאחר מכן, פצלו את כדור התולעת לשני צינורות של 15 מיליליטר.

מלאו את הצינורות עד 15 מיליליטר ב- M9 וצנטריפוגה את התולעים. כדי לשטוף את התולעים, הסר את הסופרנטנט ומלא את הצינור עד 15 מיליליטר ב-M9. חזור על הצנטריפוגה. לאחר השלמת הכביסה, העבירו את התולעים לשני צינורות של 50 מיליליטר והשתמשו ב-M9 קר כקרח כדי למלא את הנפח הכולל ל-20 מיליליטר.

כדי להסיר חיידקים ותולעים מתות, הוסיפו את שני כדורי התולעת המדוללים של 20 מיליליטר לשני צינורות של 50 מיליליטר מלאים ב-20 מיליליטר סוכרוז קר כקרח 60%. צנטריפוגה מהירה של הצינורות. בעזרת פיפטה של 25 מיליליטר, הסר בזהירות עד 15 מיליליטר משכבת התולעת העליונה.

מניחים את שכבת התולעת העליונה ישירות לתוך 37 מיליליטר M9 בתוספת אוקטוקסינול-9 שהוכן על קרח. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינורות ב-2, 700 פעמים גרם למשך שלוש דקות בתאוצה של ארבע מעלות צלזיוס תשע והאטה שבע. לאחר השלכת הסופרנטנט, העבירו את הכדור לארבעה צינורות של 15 מיליליטר ושטפו אותם פעמיים עם M9 קר כקרח בתוספת אוקטוקסינול-9.

לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינורות. הסר את הסופרנטנט ומלא את הצינורות עד לסימון 15 מיליליטר ב-M9 קר כקרח בתוספת אוקטוקסינול-9. שטפו את התולעים ב-M9 קר כקרח ושלבו את ארבעת הצינורות לשני צינורות.

מלאו את הצינורות ל -15 מיליליטר וצנטריפוגה. הסר את הסופרנטנט, מלא את שני הצינורות ב- M9 בטמפרטורת החדר לנפח כולל של ארבעה מיליליטר וסובב אותם על מערבל אגוזים בחום של 25 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות. לאחר האגוז, שטפו את התולעים פעמיים עם M9 קר כקרח בתוספת אוקטוקסינול-9.

לאחר מכן, שטפו אותם פעמיים עם M9 והעבירו את התולעים לצינור אחד. שטפו את התולעים בהרכבה מחדש או במאגר מיצוי מלח גבוה RAB ללא מעכבים לפני האיסוף. הסר את הסופרנטנט עד שאין נוזל על גבי כדור התולעת.

לאחר מכן, העריכו את נפח כדור התולעת והוסיפו נפח זהה של RAB עם מעכבים. הכינו צינור של 50 מיליליטר מלא בחנקן נוזלי על קרח יבש ובעזרת פיפטה פסטר, ציירו את התולעים וטפטפו אותן לאט לתוך הצינור. הניחו לחנקן הנוזלי להתאדות ואחסנו את התולעים הקפואות במינוס 80 מעלות צלזיוס עד להמשך עיבוד.

יש לקרר את המרגמה עם חנקן נוזלי ולבצע את שיבוש בעלי החיים על קרח יבש. מעבירים את התולעים הקפואות למרגמה שהתקררה מראש וטוחנים אותן למשך 2.5 דקות. מוסיפים לאבקה 100 מיליליטר חנקן נוזלי וטוחנים עוד 2.5 דקות.

השתמשו במיקרוסקופ כדי לבדוק שגופי התולעים שבורים לחתיכות קטנות. לאחר מכן, העבירו את האבקה לשני צינורות מיליליטר ואחסנו אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס. על קרח יבש, שקלו פי 2 350 מיליגרם של תולעי קרקע לנקודת זמן ולכל חיידקי RNAi לתוך שני צינורות מיליליטר.

כדי להסיר את החלבונים המסיסים במלח גבוה, הוסף שני נפחים למשקל של RAB שכבר הוכן עם מעכבים, PMSF מילי-מולרי אחד, 200 יחידות למיליליטר DNase I ו-100 מיקרוגרם למיליליטר RNase A לכל צינור והמיס את האבקה על קרח. משכו את המתלה למזרק מיליליטר 15 פעמים ודגרו אותו על קרח למשך 10 דקות. צנטריפוגה ב 18, 400 פעמים גרם למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

עברו דרך שכבת השומן ואספו את הסופרנטנט המכיל חלבונים מסיסים במלח לתוך שפופרת אחת של שני מיליליטר לכל מצב. הסר את השומן והשליך אותו. Aliquot חלבונים מסיסים במלח להקפאה במינוס 80 מעלות צלזיוס.

כדי להשליך שומנים, יש להמיס את הגלולה עם 700 מיקרוליטר RAB עם מעכבים המכילים סוכרוז מולארי אחד ללא DNase I ו-RNase A.משוך את התרחיף למזרק 10 פעמים ודגר אותו על קרח למשך חמש דקות. הקפד להסיר את כל הסופרנטנטים והשומנים ולהשליך אותם. כדי להסיר חלבונים מסיסים ב-SDS, יש להמיס את הגלולה עם 700 מיקרוליטר של מאגר RIPA.

משכו את המתלה למזרק 10 פעמים ודגרו אותו למשך 10 דקות על קרח. צנטריפוגה בחום 18, 400 גרם למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. אסוף את הסופרנטנט המכיל חלבונים מסיסים ב-SDS והקפיא להקפאה במינוס 80 מעלות צלזיוס.

אסוף שתי דגימות מכל מצב יחד לאחר המסה של כל כדור עם 500 מיקרוליטר של מאגר RIPA ושאב את התרחיף למזרק 10 פעמים. היזהר להסיר את כל הסופרנטנט ולהשליך אותו. מסיסים את הגלולה הסופית המכילה חלבונים בלתי מסיסים מאוד עם 400 מיקרוליטר 70% חומצה פורמית ומשכו את התרחיף למזרק 20 פעמים.

דגרו את המתלה למשך 20 דקות על קרח. צנטריפוגה את התרחיף בצינורות אולטרה-צנטריפוגה להסרת פסולת ציפורן תולעת. אסוף את הסופרנטנט המכיל חלבונים בלתי מסיסים מאוד והקפיא אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס.

צביעת חלבון כוללת של תכולת חלבון בלתי מסיס של תולעים צעירות ומבוגרות חשפה עלייה חזקה הקשורה לגיל ברמות חלבון בלתי מסיס מאוד בחיות ביקורת ולא בבעלי חיים ארוכי חיים. צביעת נוגדנים של PAB-1, חלבון קושר RNA עם תחום דמוי פריון חזוי, אישרה נתוני ספקטרומטריית מסה שבעלי חיים ארוכים שמרו על PAB-1 מסיס עם הגיל. ניתוח in vivo בוצע של בעלי חיים טרנסגניים המבטאים tagRFP PAB-1 בשרירי הלוע.

בבעלי חיים צעירים, tagRFP PAB-1 היה ממוקם בעיקר באופן מפוזר ברחבי הלוע. עם הגיל, הצטברות מתקדמת בפונקטה בהירה המתחילה בנורת הלוע האחורית. במהלך ההזדקנות, ראינו גם הצטברות בפקעת הלוע הקדמית במספר הולך וגדל של בעלי חיים.

כימות של רמות צבירה שונות של tagRFP PAB-1 עם גיל בסוג בר ורקע מוטנטי daf-2 חושף צבירת תגRFP PAB-1 מאוחרת מאוד עם הגיל בבעלי חיים ארוכים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לאסוף מספר רב של תולעים למיצוי חלבון וכיצד לבודד אגרגטים גדולים בלתי מסיסים מאוד לניתוח נוסף על ידי ספקטרומטריית מסה או דף SDS.