יישום של מיקרוסקופיית מהירות רזולוציה סופר מהיר ב ריסי העיקרי בשידור חי
January 16th, 2018
לאחרונה אנחנו ממופה המיקומים מרחבי תלת מימדי (3D) של נתיבי תחבורה חלבונים שונים translocating בתוך ראשי cilia בתאים חיים. כאן זה פרטים נייר את הגדרת הניסוי, התהליך של דגימות ביולוגיות, הניתוחים נתונים עבור קרינה פלואורסצנטית הרזולוציה סופר 3D הדמיה הגישה לאחרונה המוחלת בחיים cilia העיקרי.
המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לזהות נתיבי הובלת חלבון בריסים ראשוניים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הריסים, כגון הבדלים בנתיב הובלת חלבון בריסים תקינים ולא מתפקדים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שיש לה רזולוציה גבוהה מספיק כדי לראות נתיבי הובלת חלבון תת-עקיפה בתאים חיים.
כדי להתחיל, יש להפשיר מלאי קפוא של תאי NIH-3T3 שהונדסו במיוחד ב-37 מעלות צלזיוס, שבוע וחצי לפני הניסוי. העבירו את התאים המופשרים לבקבוק תרבית תאים בגודל 25 סנטימטר רבוע המכיל שלושה מיליליטר של מדיה מחוממת מראש. שמור על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5% פחמן דו חמצני.
תרבית התאים עד שהם מגיעים למפגש של 80% ואז מפצלים את התאים. על מנת לפצל את התאים, נסה אותם עם 0.25%טריפסין למשך שתי דקות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה הקצרה, שאפו את הטריפסין והחליפו אותו בשני מיליליטר של מצע תרבית מחומם מראש.
שלח את המדיה כדי לפרק את כל אשכולות התאים, ולאחר מכן הסר 75% מהתאים מהבקבוק והחזיר את הנפח הכולל של המדיה לשלושה מיליליטר. פצלו את התאים לפחות שלוש פעמים לפני הניסוי כדי להבטיח הומוגניות של מחזור התא שלהם. יומיים לפני הניסוי, פצלו את התאים וצלחו אותם בצלחת 60-70% מפגש על צלחת תחתונה מזכוכית 35 מילימטר עם 1.5 מיליליטר מאותו מדיום תרבית.
לאחר מכן, יום אחד לפני הניסוי, העבירו כימית את התאים עם הפלסמיד הרצוי. מערבבים 500-1000 ננוגרם של הפלסמיד ביחס של אחד ל-2.5 עם מגיב טרנספקציה ו-0.25 מיליליטר של מדיה מופחתת בסרום ללא אנטיביוטיקה למשך 30 דקות. לאחר שנוצר קומפלקס הטרנספקציה, שאפו את המדיה מהצלחת התחתונה מזכוכית 35 מילימטר והחליפו אותה בתערובת הטרנספקציה של 0.25 מילימטר ועוד 1.25 מילימטרים של מדיה מופחתת בסרום ללא אנטיביוטיקה והחזירו את הצלחת לחממה.
עבור תאים עם מבנה SSTR3 עם תווית חיצונית, הסר את המדיה מהצלחת התחתונה של הזכוכית שעה לפני הניסוי. שטפו את התאים חמש פעמים עם מיליליטר אחד של PBS והוסיפו מיליליטר אחד של מדיה מופחתת בסרום בתוספת מיקרו-מולרית אחת של סטרפטווידין מצומד Alexa 647. לא יותר מ-15 דקות לפני הניסוי, הוציאו את המדיה מכלי הזכוכית התחתון ושטפו את התאים חמש פעמים במיליליטר אחד של PBS.
לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד ממאגר ההדמיה לתוך צלחת הזכוכית התחתונה. הצמד את לוחית הזכוכית התחתונה לבמה במיקרוסקופ. מצא תא GFP אקספרס באמצעות ערכת מסנני GFP ואתר תא המבטא כראוי SSTR3-GFP בריסים ראשוניים.
לאחר שנמצא תא מתאים, יישר את נקודת ה-NPHP4-mCherry בבסיס הריסים הראשוניים עם המיקום במישור ההדמיה המתאים לתאורת הנקודה היחידה של הלייזר. באמצעות פונקציית ההצמדה, בכרטיסיית המצלמה של חלון פקדי המיקוד, צלם תמונת אפיפלואורסצנציה של חלבוני NPHP4-mCherry ו-SSTR3 המתויגים בחלבון פלואורסצנטי ירוק. לאחר קבלת תמונות הייחוס, הפחיתו באופן מקומי את ריכוז המולקולות הבודדות המסומנות על ידי הלבנת פוטו של אזור המעבר עם תאורת לייזר של מיליוואט אחד למשך 20 שניות.
כדי להתכונן למעקב אחר מולקולות בודדות, הפחיתו את עוצמת תאורת הלייזר ל-0.5 מילי-וואט עבור מולקולות המסומנות באלקסה 647. הגדר את הרווח וההעצמה למקסימום ואת קצב הפריימים לשתי אלפיות השנייה. לאחר מכן לחץ על כפתור הזרם בכרטיסיית המצלמה של חלון פקדי המיקוד והפעל את לייזר התאורה המתאים.
רשום את המולקולות הבודדות המסומנות שאינן מולבנות בפוטו כשהן מועברות דרך האזור הפוטו-מולבן של אזור המעבר. וזכרו להקליט לא יותר משתי דקות של וידאו כדי למנוע את ההשפעות של סחיפה ריסית. לאחר לכידת המולקולות הבודדות, עבד את הסרטונים באמצעות אלגוריתם התאמה גאוס דו-ממדי כגון Glimpse של מעבדת גלס, אשר ממקם במדויק את המרכז של נקודת העירור של כל מולקולה בודדת, פונקציית התפשטות ואזור עניין מקיף.
לבסוף, בחר את כל מיקומי המולקולות הבודדות בדיוק טוב מ-10 ננומטר ותקן את מרכז הריסים על סמך התפלגות מיקומי מולקולות בודדות המצוידים בפונקציה גאוס דו-ממדית. כפי שמתואר בסרטון זה, ניתן להשתמש בתאורה נקודתית אחת כדי לעקוב אחר מולקולת SSTR3 מתויגת AF647 דרך אזור המעבר המסומן על ידי NPHP4-mCherry. לפני ניתוח הנתונים, הצבת הווידיאו של המולקולה הבודדת על תאורת השדה הרחב היא שלב אימות שימושי כדי לוודא שהלייזר מיושר כהלכה, ושיש יחס אות לרעש הולם.
כאן מצולם תא עם ריסון ראשוני המזוהה על ידי הצביעה. IFT20 הוא מרכיב של קומפלקס ההובלה התוך-דגלי הנושא מטען לאורך מיקרו-צינורות בתוך ריסים ראשוניים, המסומנים על ידי Arl13b-mCherry. לאחר הזיהוי, מיקרוסקופ מהירות משמש למעקב אחר חלבוני IFT20-GFP בודדים.
לאחר מכן, ואלגוריתם טרנספורמציה דו-ממדית לתלת-ממדית משמש לייצור התפלגות צפיפות ההסתברות המרחבית של החלבון בתוך ריסים ראשוניים לאורך ממד יחיד. אזור צפיפות גבוהה זה ככל הנראה משתלב עם המיקרו-צינורות האקסונמליים בהסכמה עם המיקום הידוע של נתיב ההובלה התוך-דגלרי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב ליישר במדויק את הדגימה עם הלייזר כדי למזער שגיאה שיטתית.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע מעקב אחר מולקולה בודדת במיקרוסקופ מהירות ותדע כיצד להשיג מסלול הובלה של מולקולה בודדת בריסים ראשוניים.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מחקר זה מתמקד במיפוי המיקום המרחבי התלת-ממדי (3D) של נתיבי הובלת חלבונים בציליה ראשונית באמצעות הדמיית פלואורסצנציה ברזולוציה גבוהה. ההתקנה הניסויית וניתוח הנתונים מפורטים כדי לספק תובנות על הובלת חלבונים בתאים חיים.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- הדמיית פלואורסצנציה
רקע
- ציליה ראשונית ממלאת תפקיד מכריע באיתות תאי.
- הבנת נתיבי הובלת חלבונים יכולה לחשוף הבדלים בין ציליה נורמלית ותפקודית לקויה.
- טכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה חיוניות לחקר תהליכים אלו בתאים חיים.
- מחקר זה תורם להבנה הרחבה יותר של תפקוד וחוסר תפקוד צילירי.
מטרת המחקר
- לזהות נתיבי הובלת חלבונים בציליה ראשונית.
- לחקור הבדלים בנתיבי הובלה בין ציליה נורמלית לתפקודית לקויה.
- ליישם טכניקת הדמיה חדשנית לרזולוציה משופרת במחקרים בתאים חיים.
שיטות ששימשו
- הדמיית פלואורסצנציה ברזולוציה גבוהה בתלת-ממד.
- הכנת תאי NIH-3T3 להדמיה חיה.
- הפשרה וגידול תאים בתנאים מבוקרים.
- ניתוח נתונים למיפוי נתיבי הובלת חלבונים.
תוצאות עיקריות
- מיפוי מוצלח של נתיבי הובלת חלבונים בציליה ראשונית חיה.
- זיהוי הבדלים מרכזיים בנתיבי ההובלה בתנאים שונים.
- הוכחת יעילות טכניקת ההדמיה.
- תובנות לגבי הדינמיקה של הובלת חלבונים בציליה.
מסקנות
- המחקר מספק נקודת מבט חדשה על הובלת חלבונים בציליה ראשונית.
- הדמיה ברזולוציה גבוהה יכולה לחשוף תובנות קריטיות על תפקוד צילירי.
- מחקר עתידי יכול לבנות על ממצאים אלו כדי לחקור חוסר תפקוד צילירי.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Mapping protein transport routes in primary cilia addresses a critical gap in understanding ciliary signaling mechanisms relevant to ciliopathies and neurodevelopmental disorders. High-speed super-resolution SPEED microscopy enables real-time single-molecule tracking in live cells, providing quantitative spatial data that supports target validation and mechanistic de-risking in early discovery. This capability enhances predictive confidence in identifying druggable nodes within ciliary signaling pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing 3D spatial probability density maps of ciliary protein transport routes in live primary cilia.
- Operational Value: Supports functional target validation by resolving subdiffraction transport pathways of cytosolic and membrane proteins involved in intraflagellar transport.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking through direct observation of protein dynamics in disease-relevant cellular models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems (NIH-3T3 cells expressing fluorescence-protein-labeled ciliary proteins) for downstream compound screening and target engagement studies.
- Quantitative Output: Generates 3D spatial probability density maps that serve as standardized, reproducible readouts for assessing compound effects on protein trafficking.
- Scalability: Enables platform reuse across multiple ciliary proteins (e.g., SSTR3, IFT20) and disease models through consistent sample preparation and imaging protocols.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Connects to translational biomarker alignment by identifying transport route differences between normal and dysfunctional cilia, informing preclinical model selection.
- Translational Continuity: Bridges discovery through preclinical validation by providing mechanistic insights into cargo transport along axonemal microtubules.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by revealing transport defects that correlate with ciliary dysfunction phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
Positioned within the discovery continuum, SPEED microscopy supports hypothesis testing in early discovery, enables assay-ready systems for screening, and provides quantitative spatial analytics that inform lead identification and preclinical progression.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping 3D transport routes of ciliary proteins in live cells.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized preparation of live primary cilia models and reproducible single-molecule tracking outputs.
- Analytics: Provides high-precision spatial measurements (sub-10 nm localization) and probability density distributions that enable condition comparison and effect quantification.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by linking observed transport routes to known intraflagellar transport mechanisms and disease-associated phenotypes.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging capability across multiple targets and cell lines due to its adaptability to various fluorescence-tagged ciliary proteins.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in ciliary protein trafficking.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization through defined cell preparation, transfection, and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of transport-related liabilities, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of ciliary targets based on functional transport data from live-cell models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in super-resolution microscopy, single-molecule tracking, and live-cell imaging techniques.
- Depends on specialized instrumentation including high-speed laser illumination, sensitive cameras (e.g., EMCCD), and environmental control for live-cell maintenance.
- Necessitates cross-team standardization of transfection efficiency, expression levels, and photobleaching protocols to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different ciliary proteins or cell types due to variability in transfection efficiency and cilia formation.
- Limited by the need for precise laser-sample alignment to minimize systematic error in 2D-to-3D transformation and spatial mapping accuracy.
