Name: יישום של מיקרוסקופיית מהירות רזולוציה סופר מהיר ב ריסי העיקרי בשידור חי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: חקור מסלולי תובלה של חלבונים בריסים העיקריים בשידור חי באמצעות מיקרוסקופיית מהירות ברזולוציה סופר גבוהה. השיטה מאפשרת מיפוי תלת-ממדי מדויק של תנועת חלבונים בתאי NIH-3T3.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים ד ר קריסטן Verhey (אוניברסיטת מישיגן, אן ארבור) ואת ד ר גרגורי Pazour (בית הספר לרפואה אוניברסיטת מסצ'וסטס) על מתן כמה פלסמידים. הפרויקט נתמך על ידי מענקים המכון הלאומי לבריאות (NIH GM097037, GM116204 ו- GM122552 כדי W.Y.).

1. NIH-3T3 תא הכנה מהירות מיקרוסקופיה של מניות
<ol><li>1.5 שבועות מראש הניסוי, להתאושש תרבות טריים של תאים NIH-3T3 מניה קפוא על ידי מפשיר ב 37 מעלות צלזיוס והעברת התאים אל בקבוק התרבות התא של2 25 ס מ עם 3 מ"ל בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco) בתוספת 110 מ"ג/מ"ל פירובט נתרן 2 מ מ גלוטמין, סרום שור עוברית 10%, 1% פניצילין/סטרפטומיצין.</li>
	<li>דגירה התאים ב- 37 מעלות צלזיוס ב חממה2 CO 5%.</li>
	<li>לפצל תאים ב- 80% confluency, על כל יומיים, לפחות שלוש פעמים לפני יום ניסיוני כדי להבטיח ההומוגניות של מחזור התא. Trypsinize תאים עם 0.25% טריפסין למשך 2 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, תשאף טריפסין ולהחליף אותו עם 2 מ"ל של מדיום. פיפטה המדיום שוב ושוב כדי לשבור את התא אשכולות, להסיר את מספר התאים הרצויים ולהביא את הנפח הכולל של המדיה בחזרה עד 3 מ. הערה: NIH-3T3 היו בעבר מהונדסים גנטית כדי להביע את NPHP-4, חלבון זה רגישה ל ט ז26, התמזגו התחנה הסופית C כדי mCherry. mCherry הוא fluorophore אשר יכול להיות שמחים עם תאורה nm 561 באופן כמותי בתרגום המכשול סלקטיביות ט ז, אוריינט cilia את ראשי.</li>
	<li>יומיים לפני הניסוי, צלחת התאים 35 מ מ זכוכית תחתון דיש-60-70% confluency 1.5 מ של המדיום אותה כשלב 1.1 וחוזרים התאים החממה.</li>
	<li>יום אחד לפני הניסוי, מבחינה כימית transfect התאים עם פלסמיד הרצוי. לערבב 500-1000 ng של פלסמיד הרצויה (ראו הערה למטה) על יחס 1:2.5 עם ריאגנט תרביות תאים ב- 0.25 mL של מדיה מופחת סרום ללא אנטיביוטיקה במשך 30 דקות לשאוב מדיה מ- 35 מ מ זכוכית צלחת התחתון והחלף אותו פלסמיד 0.25 mL / תרביות תאים ריאגנט מיקס פלוס של mL 1.25 נוספת של מדיה מופחת סרום ללא אנטיביוטיקה. מדיה מופחת סרום משרת את המטרה להקל על תרביות תאים מוצלחת, גרימת cilia העיקרי לצמיחה, וכן להשאיר את התאים בחיים מספיק זמן כדי לבצע את הניסוי. לחזור תאים החממה לניסוי. למחרת היום. הערה: בעת ביצוע המעקב מולקולה אחת של IFT20, פלסמיד המכיל ש-ift20 מהונדס גנטית התמזגו ב לתחנתו C ל GFP הוא בשימוש25. בעת ביצוע יחיד מולקולה מעקב של SSTR3, פלסמיד המכיל SSTR3 מהונדס גנטית התמזגו ב לתחנתו N לתחום פפטיד (AP) מקבל והוא טרמינוס C ל GFP בשימוש22. בנוסף הבונה SSTR3, פלסמיד המכיל את ליגאז ביוטין בירה חייבת להתבטא במשותף, התקשורת תרביות תאים חייב להיות בתוספת 10 מיקרומטר ביוטין. בירה מכן מצרף ביוטין לתחום AP של מולקולות AP-SSTR3-GFP לאחרונה מסונתז ברמה של המיון. Alexa647 מצומדת של האתרים מחייב ביוטין ארבע על streptavidin, שלושה בממוצע, ייתכן ואז ניתן להשלים את התקשורת לפני הדמיה לתווית fluorescently AP-SSTR3-GFP מולקולות על פני השטח החיצוני של התא22,27 . GFP, AlexaFluor647 נמצאים בשימוש בשיטה זו; עם זאת, אחרים הגששים פלורסנט יכול לשמש אם יש להם באופן דומה צילום-ביציבות גבוהה קוונטית תשואות.</li>
	<li>אם באמצעות תווית חיצונית SSTR3 הבונה, הסר התקשורת מתחתית הכוס דיש h 1 לפני הניסוי, לשטוף את התא 5 פעמים עם 1 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS), ולהוסיף 1 מ"ל של מדיה מופחת סרום בתוספת 1 מיקרומטר Alexa647 מצומדת streptavidin.</li>
	<li>לא יותר מ- 15 דקות לפני הניסוי, להסיר מדיה מן המנה התחתון זכוכית ולשטוף את התאים transfected ומתויגים 5 פעמים עם 1 מ"ל ל- PBS.</li>
	<li>מקום 1 מ"ל של מאגר הדמיה (20 מ מ HEPES, 110 מ מ KOAc, 5 מ מ NaOAc, 2 מ מ. MgOAc, 1 מ"מ EGTA, pH 7.3) המנה קרקעית זכוכית. הערה: במאגר הדמיה, תאים הם קיימא לא יותר מ-3 שעות. לכן, רק 2 h של ניסויים מבוצעים על כל מנה.</li>
</ol>2. מהירות מיקרוסקופ
הערה: ההגדרה של מיקרוסקופ מהירות כולל מיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוכה מצויד 1.4-נה 100 × שמן-טבילה apochromatic מטרה, עם 35 mW 633 ננומטר הוא-Ne לייזר, 50 mW מצב מוצק 488 ננומטר, 561-nm לייזרים, רווח כפל על שבב תשלום-בשילוב-התקן מצלמה, חבילת תוכנה מיקרוסקופ רכישת נתונים ועיבוד (איור 1). עבור ערוץ נפרד הדמיה, שמחים GFP, mCherry ו- Alexa647 על ידי 488 ננומטר, 561 ננומטר, או לייזרים nm 633, בהתאמה. לצורך מעקב מולקולה בודדת, תאורה בנקודה אחת משמשת למעקב אחר מולקולות בודדות עם התווית fluorescently. עבור הדמיה epifluorescence, עדשה קעורה ממוקם בנתיב תאורה לייזר כדי להרחיב את הקרן לתוך שדה אחיד של תאורה. פליטת קרינה פלואורסצנטית שנאספו על ידי אותה מטרה, מסוננת על-ידי מסנן ודיקרואיק זוהר (405/488 561 635) והן של מסנן פליטה (405/488 561 635) הינם עם תמונה עם מצלמת CCD לעיל פועלים ב 500 הרץ למעקב מולקולה בודדת או 2 הרץ עבור הדמיה epifluorescence.
<ol><li>מוספית צלחת התחתון זכוכית לשלב של המיקרוסקופ ולאתר תא כראוי מביע המבנה הרצוי. ברגע תא מתאים נמצאה, יישר את המקום NPHP4-mCherry בבסיס cilia ראשי עם המיקום על המטוס הדמיה המתאים להארה בנקודה אחת של הלייזר.</li>
	<li>ללכוד את התמונה epifluorescence של NPHP4-mCherry IFT20-GFP או AP-SSTR3-GFP באמצעות הפונקציה "Snap" בכרטיסיה "המצלמה" החלון "המוקד בקרות" אם באמצעות חבילת התוכנה מיקרוסקופ דיגיטלי (ראה טבלה של חומרים). הערה: התמונות האלה תפעל כנקודת התייחסות המיקומים הבאים מולקולה בודדת.</li>
	<li>ברגע הדימויים הפניה מתקבלים, באופן מקומי להפחית את ריכוז מולקולות יחיד עם תוויות. צילום-אקונומיקה למתחם עם תאורה לייזר mW 1 20 s או עד עוצמת קרינה פלואורסצנטית הוא קרוב לזה של רקע זריחה. הערה: כאשר ריכוז מדויק יכול להיות נשלט, 0.1-1 ננומטר שכותרתו מולקולות יחיד משמשים.</li>
	<li>כדי להתכונן מעקב מולקולה בודדת, להפחית את עוצמת תאורה הלייזר ~0.15 mW עבור מולקולות יחיד עם GFP תוויות או ~0.5 mW עבור מולקולות המסומנת Alexa647.</li>
	<li>ברגע את עוצמת הלייזר והדמיה פרמטרים מוגדרים, רווח מרבי, התעצמות, 2 מילי-שניות מסגרת שיעור, עבור הדמיה מולקולה בודדת, לעסוק הלייזר תאורה המתאימה ולהקליט הלא-photobleached, שכותרתו מולקולות יחיד כפי הם מועברים דרך אזור photobleached למתחם על-ידי לחיצה על לחצן "זרם" בכרטיסיה "המצלמה" חלון "המוקד שולט". הערה: לא יותר מ 2 דקות של וידאו צריך להילכד כדי למזער את ההשפעות של סחיפה ciliary לרמה זניחה.</li>
	<li>לאחר לכידת וידאו מולקולה בודדת, לעבד את קטעי וידאו באמצעות אלגוריתם 2D התאמה לפי עקומת גאוס, כגון מבט חטוף על ידי המעבדה גלס, אשר רגישה בדיוק את centroid של עירור כל מולקולה אחת של PSF באזור המקיף של עניין (AOI).</li>
	<li>בחר כל המיקומים מולקולה בודדת עם דיוק < 10 ננומטר ולתקן במרכז cilia בהתבסס על התפלגות של מולקולה בודדת מיקומים מצויד פונקציה גאוסיאנית 2D. הערה: באמצעות 2D שינוי תלת-ממד בעזרת אלגוריתם, נתיבי תחבורה תלת-ממד של נתיבי IFT20-GFP ו- AP-SSTR3 מוצגים באופן ברור ciliary קרום axonemal או ciliary, בהתאמה.</li>
</ol>3. 2D ל 3D המרה
<ol><li>לאחר מספר localizations אלף עבור הם מגיעים מולקולות (אות לרעש יחס > 11) ב- ריסי נאספים, בחר לציר הארוך של ריסי הממד X. ליצור היסטוגרמה ממד Y של המיקומים והשג את הסכומים סל ב- nm 10 דרגות. הערה: 2D ל 3D המרה עשוי להיות מוערך על ידי היד או כל תוכנה או שפת תכנות. המחברים יישמו בהצלחה את הטרנספורמציה Matlab והן 2.7 פייתון.</li>
</ol>

<ol><li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annu Rev Biochem. 78, 993-1016 (2009).</li>
<li>Leung, B. O., Chou, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+super-resolution+fluorescence+microscopy+for+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">Review of super-resolution fluorescence microscopy for biology.</a> Appl Spectrosc. 65, 967-980 (2011).</li>
<li>Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+microscopy+reveals+that+synaptotagmin+remains+clustered+after+synaptic+vesicle+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis.</a> Nature. 440, 935-939 (2006).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Meth. 3, 793-796 (2006).</li>
<li>Ma, J., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+distribution+of+transient+interactions+in+the+nuclear+pore+complex+obtained+from+single-molecule+snapshots%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional distribution of transient interactions in the nuclear pore complex obtained from single-molecule snapshots.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107, 7305-7310 (2010).</li>
<li>Ma, J., Goryaynov, A., Sarma, A., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-regulated+viscous+channel+in+the+nuclear+pore+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Self-regulated viscous channel in the nuclear pore complex.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7326-7331 (2012).</li>
<li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+three-dimensional+mapping+of+mRNA+export+through+the+nuclear+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">High-resolution three-dimensional mapping of mRNA export through the nuclear pore.</a> Nat Comm. 4, (2013).</li>
<li>Akey, C. W., Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+Xenopus+nuclear+pore+complex+revealed+by+three-dimensional+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Architecture of the Xenopus nuclear pore complex revealed by three-dimensional cryo-electron microscopy.</a> J Cell Biol. 122, 1-19 (1993).</li>
<li>Akey, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+and+structure+of+the+nuclear+pore+complex+revealed+by+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Interactions and structure of the nuclear pore complex revealed by cryo-electron microscopy.</a> J Cell Biol. 109, 955-970 (1989).</li>
<li>Czarnecki, P. G., Shah, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ciliary+transition+zone%3A+from+morphology+and+molecules+to+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The ciliary transition zone: from morphology and molecules to medicine.</a> Trends Cell Biol. 22, 201-210 (2012).</li>
<li>Elf, J., Li, G. -W., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+transcription+factor+dynamics+at+the+single-molecule+level+in+a+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Probing transcription factor dynamics at the single-molecule level in a living cell.</a> Science. 316, 1191-1194 (2007).</li>
<li>Anzalone, A., Annibale, P., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+orbital+tracking+in+a+modified+two-photon+microscope%3A+an+application+to+the+tracking+of+intracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">3D orbital tracking in a modified two-photon microscope: an application to the tracking of intracellular vesicles.</a> J Vis Exp. , (2014).</li>
<li>Ritter, J. G., Veith, R., Veenendaal, A., Siebrasse, J. P., Kubitscheck, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+microscopy+for+single+molecule+tracking+in+living+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Light sheet microscopy for single molecule tracking in living tissue.</a> PloS one. 5, 11639(2010).</li>
<li>Marshall, W. F., Nonaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia%3A+tuning+in+to+the+cell%27s+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Cilia: tuning in to the cell's antenna.</a> Curr Biol. 16, 604-614 (2006).</li>
<li>Scholey, J. M., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraflagellar+transport+and+cilium-based+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intraflagellar transport and cilium-based signaling.</a> Cell. 125, 439-442 (2006).</li>
<li>Yang, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+pattern+recognition+reveals+the+architectural+map+of+the+ciliary+transition+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Superresolution pattern recognition reveals the architectural map of the ciliary transition zone.</a> Sci Rep. 5, 14096(2015).</li>
<li>Craige, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEP290+tethers+flagellar+transition+zone+microtubules+to+the+membrane+and+regulates+flagellar+protein+content%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">CEP290 tethers flagellar transition zone microtubules to the membrane and regulates flagellar protein content.</a> J Cell Biol. 190, 927-940 (2010).</li>
<li>Kee, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+size-exclusion+permeability+barrier+and+nucleoporins+characterize+a+ciliary+pore+complex+that+regulates+transport+into+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A size-exclusion permeability barrier and nucleoporins characterize a ciliary pore complex that regulates transport into cilia.</a> Nat Cell Biol. 14, 431-437 (2012).</li>
<li>Najafi, M., Maza, N. A., Calvert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steric+volume+exclusion+sets+soluble+protein+concentrations+in+photoreceptor+sensory+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Steric volume exclusion sets soluble protein concentrations in photoreceptor sensory cilia.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 203-208 (2012).</li>
<li>Nachury, M. V., Seeley, E. S., Jin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+to+the+ciliary+membrane%3A+how+to+get+across+the+periciliary+diffusion+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Trafficking to the ciliary membrane: how to get across the periciliary diffusion barrier.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 59-87 (2010).</li>
<li>Ye, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+imaging+reveals+a+major+role+for+diffusion+in+the+exploration+of+ciliary+space+by+signaling+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Single molecule imaging reveals a major role for diffusion in the exploration of ciliary space by signaling receptors.</a> Elife. 2, 00654(2013).</li>
<li>Ross, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Bardet-Biedl+syndrome+ciliary+proteins+perturbs+planar+cell+polarity+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genetics%22%5BJournal%5D)">Disruption of Bardet-Biedl syndrome ciliary proteins perturbs planar cell polarity in vertebrates.</a> Nat Genetics. 37, 1135-1140 (2005).</li>
<li>Handel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+targeting+of+somatostatin+receptor+3+to+neuronal+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Selective targeting of somatostatin receptor 3 to neuronal cilia.</a> Neuroscience. 89, 909-926 (1999).</li>
<li>Follit, J. A., Tuft, R. A., Fogarty, K. E., Pazour, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intraflagellar+transport+protein+IFT20+is+associated+with+the+Golgi+complex+and+is+required+for+cilia+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The intraflagellar transport protein IFT20 is associated with the Golgi complex and is required for cilia assembly.</a> Mol Biol Cell. 17, 3781-3792 (2006).</li>
<li>Awata, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NPHP4+controls+ciliary+trafficking+of+membrane+proteins+and+large+soluble+proteins+at+the+transition+zone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">NPHP4 controls ciliary trafficking of membrane proteins and large soluble proteins at the transition zone.</a> J Cell Sci. 127, 4714-4727 (2014).</li>
<li>Howarth, M., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+proteins+in+live+mammalian+cells+with+biotin+ligase+and+monovalent+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging proteins in live mammalian cells with biotin ligase and monovalent streptavidin.</a> Nat Protoc. 3, 534-545 (2008).</li>
<li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

פרוטוקול זה מתאר את היישום של מהירות מיקרוסקופ ריסי העיקרי, אברון איתות סלולרי זה מאוד מסתמך על תחבורה יעילה חלבון. מיקרוסקופ מהירות יכול לספק ברזולוציה גבוהה (&lt; 10 ננומטר) מיקומים עבור מולקולות עם התווית fluorescently כפי שהם עוברים ההארה בנקודה אחת שבמרכזה למתחם. בעבר זה הוחל ללמוד החלבון סחר דרך NPC6,7,8. עם זאת, זה יורחב כדי ללמוד סחר דרך חלל הסלולר בכל עקיפה משנה. טכניקה זו יש יתרון על פני שאר טכניקות הדמיה ברזולוציה גבו...

מאז כאמור על ידי ארנסט אבה בשנת 1873, הרזולוציה של מיקרוסקופ אור קונבנציונלי יש כבר האמין להיות מוגבל כ 200 ננומטר עקב שבירת האור אובייקטיבית1,2. כיום, סופר-רזולוציה מיקרוסקופ אור טכניקות לשבור מגבלה זו ולאפשר לכידת תמונות דינאמית ברזולוציה תת עקיפה (&lt; 200 ננומטר). הטכניקות בדרך כלל מתחלקים לשתי קטגוריות רחבות: גירוי פליטה דלדול (STED) מיקרוסקופיה המבוסס על גישות, המניבות עקיפה תת נפח תאורה עקב תגובת אופטית לא-לינאריות fluorophores דגימות3; מיקרוסקופ אור photoactivated (דקל), מיקרוסקופיה סטוכסטי שחזור אופטי (סערה)-המבוסס על שיטות זיהוי סופר, אשר מנצלים את פונקציות מתמטיות, ולהתאימם לעגה של centroids של fluorophores ואז לשקם את centroids האלה כדי ליצור סופר רזולוציה תמונות4,5. כיום, עקב הגדרת אופטי מסובכת יחסית, סערה ודקלים בהרחבה מועסקים על ידי הפעלת רק קבוצת משנה קטנה של fluorophores בכל מסגרת של סרטון ארוך של תכשיר ביולוגי. זה מאפשר עבור ההתאמה מדויקת יותר על ידי התאמה לפי עקומת גאוס 2D של הנקודה פלורסנט, כינה את הפונקציה הליין (PSF), שכותרתו fluorescently חלבונים בכל מסגרת של הוידאו. המיקום 2D של כל מולקולה עם התווית fluorescently ואז יכול להיות יונחו על מטוס הדמיה בודד כדי לייצר תמונת סופר רזולוציה של הכנה ביולוגי1,2. בזמן לוקליזציה מולקולה בודדת אלה, גישות סופר-רזולוציה מיקרוסקופיה בהחלט מהפכה כיצד בוצעה הדמיה של דגימות ביולוגיות, עדיין ישנם אתגרים להתגבר. לדוגמה, סערה ודקל ניתן להשיג החלטות המרחבי בצורה הטובה ביותר שלהם לאחר קיבוע של דגימות ביולוגיות, ובכך להציג ייצוג סטטי של החלבונים עם התווית fluorescently, אשר היא מגבלה דומה של מיקרוסקופ אלקטרונים. בנוסף, להשיג רזולוציה מרחבית גבוהה עבור כל חלבון הנקרא fluorescently בתאים חיים, דוגמאות חייב לדימות-framerates רב אשר אינם מסוגלים ללכוד dynamics חלבון. לכן, יש צורך להתגבר על מכשולים טכניים הראשי אלה.
כדי להשיג רזולוציה גבוהה ייתכן כי הוא מתאים היטב עבור זיהוי מהיר-המעבר חלבונים או RNAs בתאים חיים, פיתחנו רזולוציה סופר מהירות מיקרוסקופ ב שלנו מעבדה (איור 1)6,7, 8. ההתקדמות הטכנית מרכזיים במיקרוסקופ מהירות בעבר אפשרו לנו לעקוב בהצלחה nucleocytoplasmic התחבורה של מולקולות קטנות, חלבונים, mRNA ווירוסים דרך מקורית גרעיני הנקבוביות מתחמי (NPCs)6, 7 , 8. בקצרה, התכונות הבאות של מהירות מיקרוסקופ ישמש למעקב מהיר-המעבר מקרומולקולות דרך מבנים סימטריים rotationally מיקרומטר תת בתאים חיים, כגון NPCs cilia ראשי: (1) נוטה או תאורה אנכי PSF מאפשר את עירור של מולקולות יחיד בתוך אמצעי אחסון קטן עקיפה הגבלה ב מישור מוקד (איור 1); (2) PSF נוטה ניתן במידה רבה למנוע out-of-להתמקד פלורסצנטיות, ובכך לשפר את יחס אות לרעש. (3) הצפיפות האופטית של 100-500 קילוואט / ס מ2 ההארה PSF מאפשר אלפי פוטונים להיות שנאספו מ- fluorophores אחד עם זיהוי מהר למהירויות (&gt; 500 Hz). (4) המהיר זיהוי מהירות מקטינה באופן משמעותי גם את השגיאה לוקליזציה המרחבי מולקולה בודדת (&lt; 10 ננומטר) בקביעת את מסלולי המרחבי של מולקולות פלורסנט לגור תאים חיים, כי פעפוע הוא אחד הגורמים העיקריים גורם פגמים של מולקולה בודדת לוקליזציה להעברת מולקולות. (5) להקציע 2D ל 3D המרה אלגוריתמים מאפשרים לנו לספק מפות צפיפות ההסתברות מרחבית תלת-ממד של נתיבי תחבורה עבור מולקולות של NPC או את ריסי העיקרי. ראוי לציין כי תהליך ההמרה בין את קרטזי לבין מערכת תיאום גלילי משמש ליצירת צפיפות ההסתברות מרחבית תלת-ממד מפה ולא תלת-ממד יחיד מולקולה מעקב (איור 2). בעבר, מיקרוסקופ אלקטרונים נתונים נחשפו9,NPC10 ו ריסי הראשי11 לשניהם יש מבנה סימטרי rotationally. בעקרון, באופן אקראי לשדר המולקולות דרך NPC או ריסי הראשי צריך גם הפצות rotationally סימטרי. כפי שמוצג באיור2, מספר גבוה של אקראי לשדר מולקולות בתוך הגליל ליצור הפצות סימטרית rotationally-תצוגת חתך הרוחב עד כדי כך ב NPC, נוסף והתוצאה אחידה כ מרחבית הפצה בכל אזור משנה קטן מאוד בין שתי השכנות טבעות (איור 2E). התפלגות אחידה זה מוביל התפוצה המרחבית לאורך ממד θ באמצעות במערכת צירים היא קבועה. לאחר מכן ניתן לפשט את קואורדינטות תלת-ממד (R, X, θ באמצעות) להיות הקואורדינטות 2D (R, X, קבוע). למעשה, תהליך ההמרה בין קרטזי את המערכות גלילי הוא מ- 2D (X, Y) 2D (R, X, קבוע). Θ באמצעות מתמדת, מתייחס הצפיפות המרחבי p ב- איור 2E, מחושב באמצעות המשוואה A<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56475/56475eq1.jpg">.
בסופו של דבר, מולקולה בודדת המעקב מצא יישום רחבות במחקר ביולוגי, לכן טבעי כי שפע של טכניקות יתפתחו למלא נישות ביולוגי מסוים12,13,14. כזה הוא המקרה עם מיקרוסקופ מהירות. בעבר, כאשר בשילוב עם אלגוריתם שינוי תלת-ממד, טכניקה זו פותחה כדי לפתור נתיבי תחבורה תלת-ממדי של מולקולות דרך NPCs, משנה-diffraction בגודל rotationally סימטרי ביולוגי ומבנה6הם מגיעים. בנייר זה, מוצגים cilia הראשי להיות דגם מעולה organelles גם כן. Cilia הראשי הם גלילי, כמו אנטנה organelles (~ 125 nm radius) המקרינים מפני השטח של ביותר בתרבית של תאים15,16,17. הם אחראים על קבלת אותות חיצוניים והעברת מענה תאיים הקשורים בדרך כלל צמיחה חילוף החומרים15,16. לכן, שטף של חלבונים מבניים, מיחזור של רצפטורים transmembrane, והעברת שליחי תאיים האחריות חיוני של cilia העיקרי. בצומת בין של cilia העיקרי לגוף התא היא מכשול סלקטיביות קריטיים, המכונה אזור המעבר או צ', שדרכו כל העברה חלבון זו חייבת להתבצע11,18,19, 20. בנוסף הפונקציה חסימה של למתחם, נחשבים לפחות שני תהליכים התחבורה, תחבורה intraflagellar, דיפוזיה פסיבית, להיות אחראי על התנועה של חלבון דרך זה אזור16,21, 22. מבחינת בריאות האדם, האובדן של cilia העיקרי, ורשות עוקבות של איתות במורד הזרם היא תכונה של סרטן רבים. בנוסף, מחלות גנטיות רבות, כגון תסמונת Bardet-Biedl, מחלת כליות פוליציסטיות, משויכים חלבון פגום תחבורה23. עקיפה תת מגבלת גודל והן את תהליך מורכב של חלבונים סלקטיבי התחבורה באמצעות למתחם להפוך cilia העיקרי זה ליעד עיקרי עבור טכניקה זו. בנייר זה שיטות, נדגים את המעקב אחר טראנסממברנלי ciliary, קולטני סומטוסטטין 3 (SSTR3)24, תווית חיצונית עם אלקסה עבור חיל הים 647, רכיב של: אי, IFT2025, המסומנת מולקולה GFP מאוחה.

<table><tbody><tr><td>25 ס"מ2 צלחת תרבית רקמות</td><td>קורנינג</td><td>VV-01936-00</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>ThermoFisher</td><td>10438018</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>OPTIMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P3813-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Transit LT1</td><td>Mirus</td><td>MIR 2300</td><td></td></tr><tr><td>35 מ"מ צלחת תחתית זכוכית</td><td>MatTek</td><td>P35GCOL-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647-סטרפטווידין מצומד</td><td>ThermoFisher</td><td>S21374</td><td></td></tr><tr><td>ביוטין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>B4501-100MG</td><td></td></tr><tr><td>633 ננומטר לייזר He-Ne Melles</td><td>Griot</td><td>25-LHP-928-249</td><td></td></tr><tr><td>561 ננומטר לייזר מצב מוצק</td><td>קוהרנטי</td><td>OBIS 561-50 LS</td><td></td></tr><tr><td>488 ננומטר לייזר מצב מוצק</td><td>קוהרנטי</td><td>1185053</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך</td><td>אולימפוס</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>1.4-NA 100 פעמים; טבילת שמן אובייקט אפוכרומטי</td><td>אולימפוס</td><td>UPLSAPO 100&פעמים;</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת מכשיר כפל על השבב Roper</td><td>Scientific</td><td>Cascade 128 +</td><td></td></tr> <tr><td>מסנן דיכרואי</td><td>Semrock</td><td>Di01- R405 / 488/561/635-25x36</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פליטה</td><td>Semrock</td><td>NF01-405/488/561/635-25X5.0</td><td></td></tr><tr><td>Slidebook 6.0</td><td>חידושי הדמיה אינטליגנטית</td><td></td><td>תוכנת מיקרוסקופיה דיגיטלית</td></tr></tbody></table>

יישום של מיקרוסקופיית מהירות רזולוציה סופר מהיר ב ריסי העיקרי בשידור חי

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

ריסי העיקרי הוא מבוסס microtubule בליטה על פני השטח של התאים האיקריוטים רבים והוא מכיל מהווה השלמה ייחודי של חלבונים שהפונקציה אנושות תא תנועתיות, איתות. מאז cilia אינם מסוגלים לסנתז חלבון משלהם, כמעט 200 חלבונים ciliary ייחודי צריך להיות הנסחר בין ציטוזול cilia העיקרי. עם זאת, זה עדיין אתגר טכני כדי למפות תלת מימדי (3D) מיקומים של תחבורה מסלולים עבור חלבונים אלה, חי ראשי cilia בגלל מגבלות הקיימת כיום טכניקות. לכבוש את האתגר, לאחרונה יש שפותחה ואנו המועסקים של מיקרוסקופ וירטואלי 3D super-resolution במהירות גבוהה, כינה מיקרוסקופ תת עקיפה (מהירות) נקודה אחת קצה-עירור, כדי לקבוע את המיקום המרחבי התלת-ממד של נתיבים לתחבורה שניהם cytosolic, קרום חלבונים ב- cilia העיקרי של תאים חיים. במאמר זה נדגים את ההתקנה מפורט של מהירות מיקרוסקופ, ההכנה של תאים המבטאים חלבונים ciliary זריחה-חלבון-שכותרתו ', את מעקב בזמן אמת אחר מולקולה בודדת של חלבונים בודדים ב ריסי בשידור חי, את ההישג של מפות צפיפות ההסתברות מרחבית תלת-ממד של נתיבי תחבורה ciliary חלבונים.

סעיף זה מדגים את הנתונים המתקבלים ביצוע מהירות מיקרוסקופיה-למתחם של cilia העיקרי ללמוד תוואי התחבורה SSTR3 מחובר באמצעות ~ 15 ננומטר מקשר חיצוני כדי Alexa647 (איור 3א). היא מגישה את המטרה הכפולה של אימות האלגוריתם שינוי תלת-ממדית. Alexa647 צריך רק תווית המשטח החיצוני של ריסי העיקרי ולכן, תוואי תחבורה 3D אמורים לגלות נתיב התחבורה בצפיפות גבוהה במיקום זה. NIH-3T3 לבטא stably NPHP3-mCherry-למתחם חייב להיות transfected עם AP-SSTR3-GFP, מודגרות לפ...

לאחרונה אנחנו ממופה המיקומים מרחבי תלת מימדי (3D) של נתיבי תחבורה חלבונים שונים translocating בתוך ראשי cilia בתאים חיים. כאן זה פרטים נייר את הגדרת הניסוי, התהליך של דגימות ביולוגיות, הניתוחים נתונים עבור קרינה פלואורסצנטית הרזולוציה סופר 3D הדמיה הגישה לאחרונה המוחלת בחיים cilia העיקרי.

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לזהות נתיבי הובלת חלבון בריסים ראשוניים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הריסים, כגון הבדלים בנתיב הובלת חלבון בריסים תקינים ולא מתפקדים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שיש לה רזולוציה גבוהה מספיק כדי לראות נתיבי הובלת חלבון תת-עקיפה בתאים חיים.כדי להתחיל, יש להפשיר מלאי קפוא של תאי NIH-3T3 שהונדסו במיוחד ב-37 מעלות צלזיוס, שבוע וחצי לפני הניסוי. העבירו את התאים המופשרים לבקבוק תרבית תאים בגודל 25 סנטימטר רבוע המכיל שלושה מיליליטר של מדיה מחוממת מראש. שמור על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5% פחמן דו חמצני.תרבית התאים עד שהם מגיעים למפגש של 80% ואז מפצלים את התאים. על מנת לפצל את התאים, נסה אותם עם 0.25%טריפסין למשך שתי דקות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה הקצרה, שאפו את הטריפסין והחליפו אותו בשני מיליליטר של מצע תרבית מחומם מראש.שלח את המדיה כדי לפרק את כל אשכולות התאים, ולאחר מכן הסר 75% מהתאים מהבקבוק והחזיר את הנפח הכולל של המדיה לשלושה מיליליטר. פצלו את התאים לפחות שלוש פעמים לפני הניסוי כדי להבטיח הומוגניות של מחזור התא שלהם. יומיים לפני הניסוי, פצלו את התאים וצלחו אותם בצלחת 60-70% מפגש על צלחת תחתונה מזכוכית 35 מילימטר עם 1.5 מיליליטר מאותו מדיום תרבית.לאחר מכן, יום אחד לפני הניסוי, העבירו כימית את התאים עם הפלסמיד

application-high-speed-super-resolution-speed-microscopy-live-primary

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

טכניקה קלה ואמינה המאפשרים הדמיה וכימות תנועתיות ריסי דרכי הנשימה וזרימת ריסים נוצר באמצעות עכבר קנה הנשימה מתוארת. יכולה להיות שונה בטכניקה זו כדי לקבוע כיצד מגוון רחב של גורמים המשפיע על תנועתיות ריסים, כולל סוכנים תרופתיים, גורמים גנטיים, חשיפות סביבתיות, ו / או גורמים מכאניים כגון עומס ריר.

שיטת vivo לשעבר להדמיה ברזולוציה גבוהה של תנועתיות צילה במכרסמי Airway epithelia

מידע מרחבי-זמני על חלבונים דינמיים בתוך תאים חיים הוא חיוני להבנת הביולוגיה. סוג של מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה הנקראת מיקרוסקופ תאורה תלת-ממדי מהיר (f3D-SIM) חושף מידע ייחודי על טבעת Z הציטוקינטית בחיידקים: הן המראה דמוי החרוז והן הדינמיקה המהירה של FtsZ בתוך הטבעת.

הדמיה ברזולוציה סופר של Cytokinetic Z הטבעת בחיידקים חיים באמצעות-Structured 3D מהיר תאורה מיקרוסקופית (f3D-SIM)

במחקר זה, טכניקה מיקרוסקופית מפורטת של אור עברה אופטימיזציה לתצפית וניתוח בזמן אמת של התנועה של CPEC cilia ex vivo יחד עם שיטה מיקרוסקופית אלקטרונית לניתוח אולטרה-מבני.

תצפית של תנועת ריסי תאי אפיתל דמית העין מקלעת<em&gt; Ex Vivo</em

סיליה העיקרית היא מבנים extracellular הקשורים centriole. זיהוי cilia ראשוני על ידי כתם immunofluorescent הוא הליך פשוט יחסית שתוצאות תמונות באיכות גבוהה מאוד. בפרוטוקול זה, פיברובלסטים המבטאים cilia ראשוני תוקנו, immunostained, ותמונה במיקרוסקופ פלורסנט או confocal.

זיהוי פשוט של Cilia הראשי על ידי אימונולוסץ

מוצג כאן פרוטוקול להדמיית תאים חיים ברזולוציית-על ברקמה שלמה. התקנו את התנאים להדמיית אוכלוסיית תאי גזע בוגרים רגישים מאוד בסביבת הרקמה הטבעית שלה. טכניקה זו כרוכה באיזון רזולוציה זמנית ומרחבית כדי לאפשר תצפית ישירה של תופעות ביולוגיות ברקמה חיה.

הדמיית תאים חיים ברזולוציה סופר-רזולוציה של מבנים תת-תאיים

אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים ליצירה ואפיון של תאים גזע פלוריפוטנטיים דו-ממדיים ותלת-ממדיים המושרים על ידי בני אדם (hIPSC) מודלים מבוססי התפתחות ניאוקורטית, כמו גם מתודולוגיות משלימות המאפשרות ניתוח איכותי וכמותי של ביוגניזיס סיליום ראשוני (PC) ותפקוד.

מודלים מבוססי תאי גזע פלוריפוטנטיים דו-ממדיים ותלת-ממדיים אנושיים לניתוח מעורבות סיליום ראשוני במהלך התפתחות ניאוקורטיקלית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אלקטרופורציה במבחנה לשחזור עבור מניפולציה גנטית של מבשרי תאי גרגר המוח הקטן העיקרי (GCPs) כי הוא חסכוני, יעיל, קיימא. יתר על כן, פרוטוקול זה מדגים גם שיטה פשוטה למחקר מולקולרי של מסלולי איתות קיפוד תלויי ציליום ראשוניים בתאי GCP ראשוניים.

שיטת אלקטרופורמציה יעילה וחסכונית לחקר מסלולי איתות ראשוניים תלויי סיליום במבשר תאי הגרגיר

ניתוח מיקרוסקופיית וידאו במהירות גבוהה הוא קל יחסית לביצוע, מהיר, חסכוני, ובידיים מנוסות, כלי אמין במידה ניכרת לאבחון קו ראשון של דיסקינזיה סילארית ראשונית, שאמורה להיות זמינה בכל מרכז המעורב באבחון ובטיפול במחלות ריאה קשות.

ניתוח מיקרוסקופיית וידאו במהירות גבוהה לאבחון קו ראשון של דיסקינזיה סילארית ראשונית

מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה יכולה לספק תובנה מפורטת על ארגון הרכיבים בתוך קומפלקס סינפטונמלי במיוזיס. כאן אנו מדגימים פרוטוקול לפתרון חלבונים בודדים של קומפלקס סינפטונמלי Caenorhabditis elegans .

מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה במיוחד של קומפלקס סינפטונמלי בתוך נבט Caenorhabditis elegans

שיטה זו מתארת את ניצול האות האנדוגני במודל עכבר טרנסגני ARL13B-CENTRIN-2 להדמיית ריסים ראשוניים באתרם, בתלת מימד על פני שטחים גדולים של רקמה מינרלית, מאיסוף רקמות ועד לניתוח ארגון הריסים. פרוטוקול זה עשוי להיות מיושם גם על סוגים אחרים של רקמות.

הדמיה נפחית וניתוח ריסים ראשוניים ברקמת שריר ושלד באמצעות מודל העכבר ARL13B-CENTRIN-2

פרוטוקול זה מפרט את יישומי ההדמיה המתקדמים ואת ניהול המשאבים המשותפים של מערכת מיקרוסקופ קונפוקלי סורקת לייזר, המשולבת עם גלאי מערך מרובה לעיבוד ברזולוציה גבוהה להדמיה תאית ותת-תאית ברזולוציה גבוהה. תהליך העבודה מאפשר הדמיה מולטימודלית מקונפוקלי לרזולוציה סופר (~120 ננומטר) בתוך פלטפורמה אחת, מה שמקל על הדמיה בקנה מידה ננומטר.

דימות ברזולוציה גבוהה וניהול משותף: פרוטוקול למיקרוסקופיה קונפוקלית עם זיהוי מולטיפלקס

חקור מסלולי תובלה של חלבונים בריסים העיקריים בשידור חי באמצעות מיקרוסקופיית מהירות ברזולוציה סופר גבוהה. השיטה מאפשרת מיפוי תלת-ממדי מדויק של תנועת חלבונים בתאי NIH-3T3.

יישום של מיקרוסקופיית מהירות רזולוציה סופר מהיר ב ריסי העיקרי בשידור חי

גלה סרטונים נוספים