צבעי FM במיחזור ארסקל
צבעי FM הם סוג של מולקולות פלואורסצנטיות שמצאו שימוש חשוב בחקר תהליך מיחזור ההקלות. מכוח מבנה כימי, מולקולות אלה יכולות להכניס את עצמן לעלון החיצוני ש…
צבעי FM הם צבעי ממברנה הנמצאים בשימוש נרחב למיחזור ארסיות תמונה. זהו התהליך שבאמצעותו תא יוצר שלל מהממברנה שלו כדי לשמר את גודל התא, לעשות שימוש חוזר בחלבונים יקרים ולהעביר מולקולות ברציפות לחלל החוץ-תאי. תהליך זה נחקר בדרך כלל בסינפסות עצביות, שם הוא מעורב בשחרור של נוירוטרנסמיטורים. בנוסף לבדיקת מיחזור ארסיות, צבעי FM משמשים לחקר מספר תופעות אחרות, כגון הפרשה בתאי כרומפין ותיקון קרום התא בעקבות פגיעה.
וידאו זה יתמקד בשימוש בצבעי FM בניסוי לחקר מיחזור ארסיה. נעבור על פרוטוקול שלב אחר שלב שמשתמש בצבעי FM כדי לכמת את תהליך המיחזור בנוירונים מגורים. לבסוף, נסקור כמה ניסויים לדוגמה, אשר משתמשים במולקולה ייחודית זו בדרכים שונות.
לפני שנקפוץ להליך, בואו נסקור תחילה את התכונות הביוכימיות של צבעי FM, אשר יסייעו לנו להבין את תפקידם בניסויי מיחזור ארסיות.
מבחינה מבנית, צבעי FM הם מולקולות סטיירל שמקורן בשמן מהמדען שסינתז אותם – פיי מאו. צבעים אלה כוללים שלוש תכונות מבניות עיקריות: ראש, זנב וגשר. הגשר מורכב משתי טבעות ארומטיות עם אזור קשר כפול משתנה ביניהן. כל החלק הזה יוצר את הפלורופור.
זהו טבעו של כל פלואורופור שכאשר הוא נפגע מאור נכנס אורך גל מסוים, האטומים שלו סופגים את האנרגיה הזו ומעלים את האלקטרונים שלה למצב נרגש. אלקטרונים אלה חוזרים למצב הקרקע על ידי פליטת אנרגיה ברטט, ולבסוף כאור של אורך גל פליטה. הזנב ההידרופובי מאפשר למולקולת FM להתחלק לפחיות השומנים של קרום התא, ולראש ההידרופילי שלה יש מטען שמגביל את הלוקאליזציה שלו לעלון הממברנה החיצונית.
לכן, הדרך היחידה שהוא יכול להיכנס לתא היא באמצעות אנדוציטוזיס. צבעי FM רגישים לסביבה באופן חריף, ומראים פלואורסצנטיות חלשה בממסים בקטבים, אך פלואורסצנטיות חזקה בסביבות הידרופוביות כמו ממברנות. זה יוצר תיוג ממברנה ניגודיות גבוהה שניתן לדמיין ולכמת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
מאפיינים אלה עושים צבעי FM במיוחד מתאים להעריך מיחזור ארסיות ב synapses. בקצרה, התהליך כרוך דגירה של התרבויות עם צבע FM. חלק ממולקולות ה- FM נקשרות לממברנות, מה שמגביר באופן משמעותי את עוצמות הפלואורסצנטיות שלהן. לאחר מכן, גירוי יוזם את תהליך הפנמת הממברנה. לכן, כמה מולקולות FM לכודות בקרום הארסיה, ושאר מולקולות הצבע המקומיות החיצוניות נשטפות.
בגירוי שני, שלל מוכתם מופנם מתמזג עם קרום התא כדי לשחרר את התוכן שלהם, ואת הצבע במהירות יוצא, וכתוצאה מכך ירידה מהירה בעוצמת פלואורסצנטיות. ניתן לכמת את ההסתייגות הזו בעזרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
כעת, כאשר אתם מכירים את העקרונות הביוכימיים של צבעי FM, בואו נסקור הליך כיצד לבצע ניסוי הבוחן מיחזור ארסיות סינפטית באמצעות צבעים אלה.
דגימות נקיות ובריאות של תרביות עצביות על כיסויים מוכנות מראש. תאים אלה מועברים לתמיסת צבע FM, מה שגורם לממברנות להיות מסומנות. כיסוי המדגם מותקן לאחר מכן על תא ההדמיה של המיקרוסקופ.
כדי לאפשר מניפולציות נוזלים כמו שטיפות, קלט נוזלים וקווי פלט מחוברים ליצירת תא זלוף אטום. הר את התא על הבמה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי. חברו חוטים לתא וחברו אותם לממריץ החשמלי. לאחר חיבור, מסנני העירור והפליטה מוגדרים בהתאם לצבע FM המשמש.
טעינת צבע לתוך שלל באמצעות אנדוציטוזיס מושרה באמצעות גירוי חשמלי. לאחר גירוי, מסופי עצבים מורשים להתאושש. לאחר מכן, צבע חוץ תאי נשטף עם חוצץ; זה גם ממזער את פלואורסצנטיות הרקע. חשוב לשמור על עוצמת העירור מינימלית כי צבעי FM נוטים להלבנה פוטו, אשר נחלשת של עוצמת פלואורסצנטיות עקב עירור ממושך. לאחר הדגירה הקצרה מתקבלות תמונות ראשוניות. לאחר מכן, אקסוציאטוזיס מושרה עם אות חשמלי שני.
לאחר מדידת פלואורסצנטיות בנקודות זמן שונות לאחר גירוי, בסוף, מסופי עצבים יכולים להיות מגורה ממצה לפרוק את כל הצבעים הניתנים לשחרור. הפלואורסצנטיות שנותרה לאחר מכן נחשבת לעוצמת הפלואורסצנטיות ברקע. לאחר מכן, פלואורסצנטיות מהותית של כל תמונה נמדדת באמצעות הכלי "אזור העניין" באזור לא סינפטי של התמונה. פלואורסצנטיות הרקע והפלואורסצנטיות המהותית מופחתות מעוצמת הפלואורסצנטיות של כל נקודת זמן כדי להשיג עוצמת פלואורסצנטיות מנורמלת, אשר לאחר מכן מתוות לעומת הזמן. הירידה בעוצמה לאורך זמן מייצגת ירידה, שהיא מדד עקיף של מיחזור ארסיות.
עכשיו שבדקנו את המתודולוגיה, בואו נסתכל על האופן שבו משתמשים בצבעי FM בניסויים ספציפיים.
דנו בפרוטוקול באמצעות צבעי FM בנוירונים מגורים. כאן, מדענים התעניינו בחקר מיחזור ארסיה ספונטנית. הם עשו זאת באמצעות הפרוטוקול שנקבע בשילוב עם מערכת הדמיה רגישה מספיק כדי לזהות שינויים קטנים בעוצמת הפלואורסצנטיות. התוצאות מייצגות ירידה בעוצמת הפלואורסצנטיות הנובעת ישירות משחרור סינפטי ספונטני.
בתוך הנוירון presynaptic, שלל מחולקים לשתי בריכות: בריכת מילואים או RP, ובריכה משחררת בקלות או RRP. כאן, מדענים השתמשו בצבעי FM כדי לנתח את השבר של כל סוג באוכלוסיית ההסתה. על ידי יישום רציף של גירויים חשמליים של עוצמות הולכות וגדלות, מדענים אלה הצליחו לכמת את האחוזים היחסיים של כל סוג של מאגר ארסיות.
לבסוף, ביולוג התאים משתמש גם בצבעי FM כדי לנתח גורמים המעורבים בתיקון האקסוציאטי של קרום פלזמה פצוע. בניסוי זה, החוקרים התמקדו במיוחד בתפקיד של sphingomyelinase, אנזים משנה שומנים בדם, בתהליך חלוקה מחדש של הממברנה. ראשית, הם יצרו תאים לקויים באנזים sphingomyelinase בעזרת השתקת טיפול RNA. לאחר מכן, הם טיפלו בתאים אלה וקבוצת ביקורת עם צבע FM אקסוגני ורעלן שיוצר נגעים בקרום פלזמה. לבסוף, הם צפו בכל הדגימות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל. התוצאות הראו כי תאים לקויים sphingomyelinase הראו הצטברות חזקה של מולקולות FM תאי. מצד שני, תאי בקרה הראו זרם FM מינימלי, מה שמרמז על תפקיד של sphingomyelinase בתיקון קרום פלזמה.
הרגע צפית בסרטון של JoVE על צבעי FM במיחזור ארסיה. הסרטון תיאר את הביוכימיה של צבעי FM, פירט פרוטוקול להכתים ולכמת מיחזור ארסיה סינפטית, ולבסוף תיאר ניסויים נוכחיים המשתמשים בצבעים אלה בדרכים שונות. כמו תמיד, תודה שצפית!
צבעי FM הם צבעי ממברנה הנמצאים בשימוש נרחב למיחזור ארסיות תמונה. זהו התהליך שבאמצעותו תא יוצר שלל מהממברנה שלו כדי לשמר את גודל התא, לעשות שימוש חוזר בחלבונים יקרים ולהעביר מולקולות ברציפות לחלל החוץ-תאי. תהליך זה נחקר בדרך כלל בסינפסות עצביות, שם הוא מעורב בשחרור של נוירוטרנסמיטורים. בנוסף לבדיקת מיחזור ארסיות, צבעי FM משמשים לחקר מספר תופעות אחרות, כגון הפרשה בתאי כרומפין ותיקון קרום התא בעקבות פגיעה.
וידאו זה יתמקד בשימוש בצבעי FM בניסוי לחקר מיחזור ארסיה. נעבור על פרוטוקול שלב אחר שלב שמשתמש בצבעי FM כדי לכמת את תהליך המיחזור בנוירונים מגורים. לבסוף, נסקור כמה ניסויים לדוגמה, אשר משתמשים במולקולה ייחודית זו בדרכים שונות.
לפני שנקפוץ להליך, בואו נסקור תחילה את התכונות הביוכימיות של צבעי FM, אשר יסייעו לנו להבין את תפקידם בניסויי מיחזור ארסיות.
מבחינה מבנית, צבעי FM הם מולקולות סטיירל שמקורן בשמן מהמדען שסינתז אותם – פיי מאו. צבעים אלה כוללים שלוש תכונות מבניות עיקריות: ראש, זנב וגשר. הגשר מורכב משתי טבעות ארומטיות עם אזור קשר כפול משתנה ביניהן. כל החלק הזה יוצר את הפלורופור.
זהו טבעו של כל פלואורופור שכאשר הוא נפגע מאור נכנס אורך גל מסוים, האטומים שלו סופגים את האנרגיה הזו ומעלים את האלקטרונים שלה למצב נרגש. אלקטרונים אלה חוזרים למצב הקרקע על ידי פליטת אנרגיה ברטט, ולבסוף כאור של אורך גל פליטה. הזנב ההידרופובי מאפשר למולקולת FM להתחלק לפחיות השומנים של קרום התא, ולראש ההידרופילי שלה יש מטען שמגביל את הלוקאליזציה שלו לעלון הממברנה החיצונית.
לכן, הדרך היחידה שהוא יכול להיכנס לתא היא באמצעות אנדוציטוזיס. צבעי FM רגישים לסביבה באופן חריף, ומראים פלואורסצנטיות חלשה בממסים בקטבים, אך פלואורסצנטיות חזקה בסביבות הידרופוביות כמו ממברנות. זה יוצר תיוג ממברנה ניגודיות גבוהה שניתן לדמיין ולכמת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
מאפיינים אלה עושים צבעי FM במיוחד מתאים להעריך מיחזור ארסיות ב synapses. בקצרה, התהליך כרוך דגירה של התרבויות עם צבע FM. חלק ממולקולות ה- FM נקשרות לממברנות, מה שמגביר באופן משמעותי את עוצמות הפלואורסצנטיות שלהן. לאחר מכן, גירוי יוזם את תהליך הפנמת הממברנה. לכן, כמה מולקולות FM לכודות בקרום הארסיה, ושאר מולקולות הצבע המקומיות החיצוניות נשטפות.
בגירוי שני, שלל מוכתם מופנם מתמזג עם קרום התא כדי לשחרר את התוכן שלהם, ואת הצבע במהירות יוצא, וכתוצאה מכך ירידה מהירה בעוצמת פלואורסצנטיות. ניתן לכמת את ההסתייגות הזו בעזרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
כעת, כאשר אתם מכירים את העקרונות הביוכימיים של צבעי FM, בואו נסקור הליך כיצד לבצע ניסוי הבוחן מיחזור ארסיות סינפטית באמצעות צבעים אלה.
דגימות נקיות ובריאות של תרביות עצביות על כיסויים מוכנות מראש. תאים אלה מועברים לתמיסת צבע FM, מה שגורם לממברנות להיות מסומנות. כיסוי המדגם מותקן לאחר מכן על תא ההדמיה של המיקרוסקופ.
כדי לאפשר מניפולציות נוזלים כמו שטיפות, קלט נוזלים וקווי פלט מחוברים ליצירת תא זלוף אטום. הר את התא על הבמה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי. חברו חוטים לתא וחברו אותם לממריץ החשמלי. לאחר חיבור, מסנני העירור והפליטה מוגדרים בהתאם לצבע FM המשמש.
טעינת צבע לתוך שלל באמצעות אנדוציטוזיס מושרה באמצעות גירוי חשמלי. לאחר גירוי, מסופי עצבים מורשים להתאושש. לאחר מכן, צבע חוץ תאי נשטף עם חוצץ; זה גם ממזער את פלואורסצנטיות הרקע. חשוב לשמור על עוצמת העירור מינימלית כי צבעי FM נוטים להלבנה פוטו, אשר נחלשת של עוצמת פלואורסצנטיות עקב עירור ממושך. לאחר הדגירה הקצרה מתקבלות תמונות ראשוניות. לאחר מכן, אקסוציאטוזיס מושרה עם אות חשמלי שני.
לאחר מדידת פלואורסצנטיות בנקודות זמן שונות לאחר גירוי, בסוף, מסופי עצבים יכולים להיות מגורה ממצה לפרוק את כל הצבעים הניתנים לשחרור. הפלואורסצנטיות שנותרה לאחר מכן נחשבת לעוצמת הפלואורסצנטיות ברקע. לאחר מכן, פלואורסצנטיות מהותית של כל תמונה נמדדת באמצעות הכלי "אזור העניין" באזור לא סינפטי של התמונה. פלואורסצנטיות הרקע והפלואורסצנטיות המהותית מופחתות מעוצמת הפלואורסצנטיות של כל נקודת זמן כדי להשיג עוצמת פלואורסצנטיות מנורמלת, אשר לאחר מכן מתוות לעומת הזמן. הירידה בעוצמה לאורך זמן מייצגת ירידה, שהיא מדד עקיף של מיחזור ארסיות.
עכשיו שבדקנו את המתודולוגיה, בואו נסתכל על האופן שבו משתמשים בצבעי FM בניסויים ספציפיים.
דנו בפרוטוקול באמצעות צבעי FM בנוירונים מגורים. כאן, מדענים התעניינו בחקר מיחזור ארסיה ספונטנית. הם עשו זאת באמצעות הפרוטוקול שנקבע בשילוב עם מערכת הדמיה רגישה מספיק כדי לזהות שינויים קטנים בעוצמת הפלואורסצנטיות. התוצאות מייצגות ירידה בעוצמת הפלואורסצנטיות הנובעת ישירות משחרור סינפטי ספונטני.
בתוך הנוירון presynaptic, שלל מחולקים לשתי בריכות: בריכת מילואים או RP, ובריכה משחררת בקלות או RRP. כאן, מדענים השתמשו בצבעי FM כדי לנתח את השבר של כל סוג באוכלוסיית ההסתה. על ידי יישום רציף של גירויים חשמליים של עוצמות הולכות וגדלות, מדענים אלה הצליחו לכמת את האחוזים היחסיים של כל סוג של מאגר ארסיות.
לבסוף, ביולוג התאים משתמש גם בצבעי FM כדי לנתח גורמים המעורבים בתיקון האקסוציאטי של קרום פלזמה פצוע. בניסוי זה, החוקרים התמקדו במיוחד בתפקיד של sphingomyelinase, אנזים משנה שומנים בדם, בתהליך חלוקה מחדש של הממברנה. ראשית, הם יצרו תאים לקויים באנזים sphingomyelinase בעזרת השתקת טיפול RNA. לאחר מכן, הם טיפלו בתאים אלה וקבוצת ביקורת עם צבע FM אקסוגני ורעלן שיוצר נגעים בקרום פלזמה. לבסוף, הם צפו בכל הדגימות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל. התוצאות הראו כי תאים לקויים sphingomyelinase הראו הצטברות חזקה של מולקולות FM תאי. מצד שני, תאי בקרה הראו זרם FM מינימלי, מה שמרמז על תפקיד של sphingomyelinase בתיקון קרום פלזמה.
הרגע צפית בסרטון של JoVE על צבעי FM במיחזור ארסיה. הסרטון תיאר את הביוכימיה של צבעי FM, פירט פרוטוקול להכתים ולכמת מיחזור ארסיה סינפטית, ולבסוף תיאר ניסויים נוכחיים המשתמשים בצבעים אלה בדרכים שונות. כמו תמיד, תודה שצפית!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What are FM dyes and how do they work in membrane imaging?
FM dyes are styryl fluorescent molecules that insert into the outer leaflet of cell membranes. They fluoresce strongly in hydrophobic environments like lipid bilayers but weakly in polar solvents, creating high-contrast membrane labeling. When struck by excitation light, their electrons enter an excited state and emit light at a specific wavelength, enabling visualization under a fluorescence microscope.
Q2: Why can FM dyes only enter cells through endocytosis?
FM dyes have a hydrophilic, charged head group that restricts their localization to the outer membrane leaflet. This charge prevents the molecule from crossing the lipid bilayer directly. The only way FM dyes can reach the cell interior is via endocytosis and exocytosis, the processes by which cells internalize and recycle membrane vesicles containing the dye molecules.
Q3: How does FM dye fluorescence change during vesicle recycling?
During vesicle recycling, FM dye fluorescence increases when dye-labeled membranes are internalized into vesicles, trapping the dye in the hydrophobic environment. Upon exocytosis, vesicles fuse with the cell membrane and the dye rapidly departitions into the extracellular space, causing a sharp decrease in fluorescence intensity that can be quantified to measure recycling rates.
Q4: What is photobleaching and why is it a concern in FM dye experiments?
Photobleaching is the weakening of fluorescence intensity caused by prolonged exposure to excitation light. FM dyes are particularly prone to photobleaching, so researchers minimize excitation intensity during imaging to preserve signal. This precaution ensures accurate quantification of destaining and prevents loss of fluorescence data before measurements are complete.
Q5: How are vesicle pools distinguished using FM dyes in neurons?
Scientists apply sequential electrical stimuli of increasing intensities to neurons labeled with FM dyes. This approach allows them to quantify the relative percentages of the reserve pool and readily releasable pool of synaptic vesicles. The differential destaining patterns reveal how many vesicles are available for immediate release versus those held in reserve.
Q6: What does normalized fluorescence intensity reveal about vesicle recycling?
Normalized fluorescence intensity is calculated by subtracting background and intrinsic fluorescence from raw intensity measurements at each time point. When plotted over time, the decrease in normalized intensity represents destaining, which serves as an indirect measure of vesicle recycling. This quantification allows researchers to assess the rate and extent of membrane internalization and recycling.
Q7: How do FM dyes help identify the role of sphingomyelinase in membrane repair?
Researchers compared FM dye uptake in sphingomyelinase-deficient cells versus control cells after inducing plasma membrane lesions. Sphingomyelinase-deficient cells showed robust intracellular FM accumulation, while controls showed minimal influx. This difference demonstrated that sphingomyelinase plays a critical role in the exocytic repair process that normally seals membrane wounds.