תיוג אגף V ו-Propidium יודיד
הכתמה עם סיפוח V ו propidium יודיד (PI) מספק לחוקרים דרך לזהות סוגים שונים של מוות תאים – נמק או אפופטוזיס. טכניקה זו מסתמכת על שני מרכיבים. הראשון, a…
תיוג נספח V ו- propidium iodide (PI) של תאים היא טכניקה המשמשת לזיהוי מוות תאים, ולהבדיל בין המסלולים השונים שלה: אפופטוזיס, או מוות תאים מתוכנת, ונמק. תאים עוברים שינויים מורפולוגיים ברורים בהתאם למסלול. על ידי זיהוי התנאים הספציפיים המובילים תא לעבור אפופטוזיס או נמק, מדענים מקבלים תובנה על פיזיולוגיה תאית ועל הפתופיזיולוגיה של המחלה. תיוג Annexin V ו- PI, ואחריו ציטומטריית זרימה, הוקמה כאחת השיטות היעילות ביותר לסווג את סוג המוות של התא.
היום, נתאר כיצד הבחינה הזו מסייעת בזיהוי מסלולי מוות של תאים, כיצד לבצע טכניקה זו, וכמה ניסויים לדוגמה מרגשים המשתמשים בשיטה זו כדי לענות על שאלות חשובות בתחום הביולוגיה של התא.
ראשית, בואו נסתכל על העקרונות שמאחורי הכתמת הסיפוח V ו- PI.
כאמור, תאים אפופטוטיים מציגים תכונות מורפולוגיות ייחודיות. אלה כוללים התכווצות תאים, קרום blebbing, פיצול גרעיני, ואת המראה של גופים אפופטוטיים. בנוסף, לאחר אינדוקציה של אפופטוזיס – כלומר, בשלב האפוטוטי המוקדם – מופיעים שינויים אופייניים מסוימים בממברנה. קרום התא הרגיל יש את כל שאריות פוספטידילסרין או נ.ב. על העלון הפנימי. עם זאת, בתאים אפופוטוטיים מוקדמים חלק משאריות PS אלה מועברות אל פני השטח החיצוניים – אך כיצד?
כדי להבין את זה, בואו ניקח צעד אחורה. במהלך אפופטוזיס, ידוע כי כספיות ציטוטוסוליות מופעלות. אנזימים אלה בתורם להפעיל אנזים קשור ממברנה בשם מערבולת. לטרוף "מערבל" את קרום התא על ידי טרנסלוקיוז שאריות PS מהצד הציטופלסמי אל פני השטח החיצוניים. לעומת זאת, במהלך שאריות נמק PS נשארים איפה הם נמצאים, אבל הממברנה עצמה נקרעת. תיוג Annexin V ו- PI לנצל הבדלים אלה בשינויים ממברנה של שני סוגים של מוות תאים.
Annexin V מצומד בצבע פלואורסצנטי, כגון פלואורסצין איזוטיוצינט - הידוע בכינויו FITC - הוא ליגנד טבעי בלתי חדיר לממברנה עבור נ.ב. ולכן מזהה בקלות תאים אפופוטוטיים מוקדמים על ידי קשירה ל- PS המוחצן. עם זאת, בעקבות קרע בממברנה, המתרחש במהלך נמק וגם בשלבים מאוחרים יותר של אפופטוזיס, annexin יכול גם להיקשר נ.ב על הפנים הפנימיות ולהניב חיובי כוזב.
כדי להימנע מכך, מדענים משתמשים ב- PI. מולקולת צבע מחייבת DNA זו היא שוב בלתי חדירה לממברנה, ויכולה להיכנס לתא רק כאשר הממברנה נקרעת. לכן, אם תא מוכתם רק סיפוח הוא אפופטוטי מוקדם, ואילו תא שהוא גם PI וגם סיפוח מוכתם יכול להיות נמק או אפופטוטי מאוחר.
עכשיו שלמדת את העקרונות הבסיסיים מאחורי ההסתה הזו, בואו נעבור את ההליך של הכתמת וניתוח מוות של תאים.
ראשית, תאים נקצרים וצנטריפוגות במהירות נמוכה כדי למנוע כל הפרעה מורפולוגית, ו respended במאגר כביסה פיזיולוגי כגון תמיסת מלח חוצצת פוספט, הידוע גם בשם PBS. לאחר צעד צנטריפוגה נוסף, תאים הם resuspended במאגר כריכת סיפוח V המכיל סידן, אשר הכרחי עבור סיפוח מחייב PS. Annexin V מצומד עם FITC מתווסף לאחר מכן לפתרון, אשר מדגירה בטמפרטורת החדר בחושך כדי לאפשר סיפוח ו PS שיוך. בשלב הבא, PI מתווסף ישירות לפתרון תא הכתמת הנספח ודגור בחושך. לאחר הדגירה, תאים נשטפים PBS על ידי צנטריפוגה, resuspended חוצץ כביסה, ונשמר על קרח. עכשיו הם מוכנים לניתוח.
פעילות פלואורסצנטיות של תאים מנותחת על ידי ציטומטריית זרימה, טכניקה מבוססת לייזר הלוכדת נתוני פלואורסצנטיות מתאים בודדים התלויים בזרם של נוזלים. לאחר כיול פלואורסצנטיות באמצעות תאים מוכתמים בנפרד בכל צבע, נרכשים נתונים מתאים מוכתמים כפולים. אותות פלואורסצנטיים מאוכלוסיית התאים משמשים ליצירת חלקה שבה עוצמת FITC הקשורה לסיפוח מתוותת בציר ה- X הלוגריתמי, וב- PI בציר ה- Y הלוגריתמי. תאים שהם חיוביים לסיפוח-FITC ושלילי PI יתקבצו בצד הימני התחתון של התוויה, המייצגים את התאים האפוטוטיים המוקדמים, ותאים חיוביים כפולים עבור annexin-FITC ו- PI יתרחשו בפינה הימנית העליונה, המייצגים את התאים האפופטוטיים המאוחרים או הנמקיים המאוחרים. התאים שנותרו לא מוכתמים או מוכתמים באופן חסר משמעות הן עבור אגף והן עבור PI הם תאים חיים.
מכיוון שכעת אתם יודעים מדוע ביולוגים של תאים מסתמכים על טכניקה זו כדי לחקור מוות תאי, מדוע שלא נסקור חלק מהיישומים שלה.
באמצעות הליך זה, מדענים יכולים לעקוב אחר אילו חלבונים תאיים מעורבים אפופטוזיס. בסרטון זה, החוקרים ניתחו את ההשפעה של סיספלטין, תרופה נגד סרטן, על תאי כליות רגילים כדי לראות אם זה תורם אפופטוזיס. קבוצה אחת של תאים הועברה כדי להגזים בצורה פעילה של חלבון האנזים קינאז C, או PKC, והסט השני הועבר בצורה לא פונקציונלית – PKC שלילי דומיננטי. תאים המבטאים PKC ומטופלים בשיספלטין עברו אפופטוזיס לאורך זמן, אך תאים המבטאים את PKC השלילי הדומיננטי הלא פעיל היו עמידים לאפופטוזיס, מה שמצביע על כך שהאנזים הוא שחקן מפתח במסלול אפופטוזיס המושרה בשיספלטין.
החוקרים גם משתמשים בכתמים אלה כדי לבדוק את הפוטנציאל הציטוטוקסי של תאי T ספציפיים. תאי T ציטוטוקסיים יכולים לזהות חלבוני ממברנה ספציפיים בתא היעד שלהם, ולעורר את מותו על קשירה אליו. כאן, החוקרים דגגרו תאי T ספציפיים לאנטיגן עם תאי גידול ממוקדים ונספח V, ולאחר מכן נצפו אינדוקציה של אפופטוזיס תא הגידול על ידי מעורבות תאי T. נתוני ציטומטריית זרימה חשפו את אחוז המוות מתאי היעד בנוכחות ובהיעדר תאי T ציטוטוקסיים.
לבסוף, מדענים משתמשים בשיטה זו כדי להעריך את הכדאיות של התאים לאחר אספקת גנים. במקרה זה, החוקרים רצו להעריך את הישרדות התא לאחר נוקלאופקט – שיטה המשתמשת בשילוב של כימיקלים ושדה חשמלי מיושם כדי ליצור נקבוביות חולפות בקרומים תאיים וגרעיניים, ובכך להקל על אספקת גנים. באמצעות annexin V בתוספת צבע שנקרא 7-אמינוקטינומיצין D או 7-AAD, אשר, בדומה PI נקשר ל- DNA, הם הראו כי נוקלאופקטציה גרמה למוות תאים נמוך על ידי אפופטוזיס או נמק.
הרגע צפית בסרטון של ג'וב על תיוג אגף 5 ו-PI. בסרטון זה דנו בקצרה בתכונות הייחודיות של תאים אפופוטוטיים ונמקיים, סקרנו את העקרונות שמאחורי שיטה זו, צפינו בהליך כללי עבור טכניקה נפוצה זו, והקדמנו יישומים מסוימים. בהתחשב בחשיבות של הבנת האופן שבו תאים שונים מתים בתנאים שונים, תיוג ה- V וה- PI של סיפוח משמש ככלי חשוב לביולוגים של תאים המעוניינים בתופעה זו. כמו תמיד, תודה שצפית!
תיוג נספח V ו- propidium iodide (PI) של תאים היא טכניקה המשמשת לזיהוי מוות תאים, ולהבדיל בין המסלולים השונים שלה: אפופטוזיס, או מוות תאים מתוכנת, ונמק. תאים עוברים שינויים מורפולוגיים ברורים בהתאם למסלול. על ידי זיהוי התנאים הספציפיים המובילים תא לעבור אפופטוזיס או נמק, מדענים מקבלים תובנה על פיזיולוגיה תאית ועל הפתופיזיולוגיה של המחלה. תיוג Annexin V ו- PI, ואחריו ציטומטריית זרימה, הוקמה כאחת השיטות היעילות ביותר לסווג את סוג המוות של התא.
היום, נתאר כיצד הבחינה הזו מסייעת בזיהוי מסלולי מוות של תאים, כיצד לבצע טכניקה זו, וכמה ניסויים לדוגמה מרגשים המשתמשים בשיטה זו כדי לענות על שאלות חשובות בתחום הביולוגיה של התא.
ראשית, בואו נסתכל על העקרונות שמאחורי הכתמת הסיפוח V ו- PI.
כאמור, תאים אפופטוטיים מציגים תכונות מורפולוגיות ייחודיות. אלה כוללים התכווצות תאים, קרום blebbing, פיצול גרעיני, ואת המראה של גופים אפופטוטיים. בנוסף, לאחר אינדוקציה של אפופטוזיס – כלומר, בשלב האפוטוטי המוקדם – מופיעים שינויים אופייניים מסוימים בממברנה. קרום התא הרגיל יש את כל שאריות פוספטידילסרין או נ.ב. על העלון הפנימי. עם זאת, בתאים אפופוטוטיים מוקדמים חלק משאריות PS אלה מועברות אל פני השטח החיצוניים – אך כיצד?
כדי להבין את זה, בואו ניקח צעד אחורה. במהלך אפופטוזיס, ידוע כי כספיות ציטוטוסוליות מופעלות. אנזימים אלה בתורם להפעיל אנזים קשור ממברנה בשם מערבולת. לטרוף "מערבל" את קרום התא על ידי טרנסלוקיוז שאריות PS מהצד הציטופלסמי אל פני השטח החיצוניים. לעומת זאת, במהלך שאריות נמק PS נשארים איפה הם נמצאים, אבל הממברנה עצמה נקרעת. תיוג Annexin V ו- PI לנצל הבדלים אלה בשינויים ממברנה של שני סוגים של מוות תאים.
Annexin V מצומד בצבע פלואורסצנטי, כגון פלואורסצין איזוטיוצינט - הידוע בכינויו FITC - הוא ליגנד טבעי בלתי חדיר לממברנה עבור נ.ב. ולכן מזהה בקלות תאים אפופוטוטיים מוקדמים על ידי קשירה ל- PS המוחצן. עם זאת, בעקבות קרע בממברנה, המתרחש במהלך נמק וגם בשלבים מאוחרים יותר של אפופטוזיס, annexin יכול גם להיקשר נ.ב על הפנים הפנימיות ולהניב חיובי כוזב.
כדי להימנע מכך, מדענים משתמשים ב- PI. מולקולת צבע מחייבת DNA זו היא שוב בלתי חדירה לממברנה, ויכולה להיכנס לתא רק כאשר הממברנה נקרעת. לכן, אם תא מוכתם רק סיפוח הוא אפופטוטי מוקדם, ואילו תא שהוא גם PI וגם סיפוח מוכתם יכול להיות נמק או אפופטוטי מאוחר.
עכשיו שלמדת את העקרונות הבסיסיים מאחורי ההסתה הזו, בואו נעבור את ההליך של הכתמת וניתוח מוות של תאים.
ראשית, תאים נקצרים וצנטריפוגות במהירות נמוכה כדי למנוע כל הפרעה מורפולוגית, ו respended במאגר כביסה פיזיולוגי כגון תמיסת מלח חוצצת פוספט, הידוע גם בשם PBS. לאחר צעד צנטריפוגה נוסף, תאים הם resuspended במאגר כריכת סיפוח V המכיל סידן, אשר הכרחי עבור סיפוח מחייב PS. Annexin V מצומד עם FITC מתווסף לאחר מכן לפתרון, אשר מדגירה בטמפרטורת החדר בחושך כדי לאפשר סיפוח ו PS שיוך. בשלב הבא, PI מתווסף ישירות לפתרון תא הכתמת הנספח ודגור בחושך. לאחר הדגירה, תאים נשטפים PBS על ידי צנטריפוגה, resuspended חוצץ כביסה, ונשמר על קרח. עכשיו הם מוכנים לניתוח.
פעילות פלואורסצנטיות של תאים מנותחת על ידי ציטומטריית זרימה, טכניקה מבוססת לייזר הלוכדת נתוני פלואורסצנטיות מתאים בודדים התלויים בזרם של נוזלים. לאחר כיול פלואורסצנטיות באמצעות תאים מוכתמים בנפרד בכל צבע, נרכשים נתונים מתאים מוכתמים כפולים. אותות פלואורסצנטיים מאוכלוסיית התאים משמשים ליצירת חלקה שבה עוצמת FITC הקשורה לסיפוח מתוותת בציר ה- X הלוגריתמי, וב- PI בציר ה- Y הלוגריתמי. תאים שהם חיוביים לסיפוח-FITC ושלילי PI יתקבצו בצד הימני התחתון של התוויה, המייצגים את התאים האפוטוטיים המוקדמים, ותאים חיוביים כפולים עבור annexin-FITC ו- PI יתרחשו בפינה הימנית העליונה, המייצגים את התאים האפופטוטיים המאוחרים או הנמקיים המאוחרים. התאים שנותרו לא מוכתמים או מוכתמים באופן חסר משמעות הן עבור אגף והן עבור PI הם תאים חיים.
מכיוון שכעת אתם יודעים מדוע ביולוגים של תאים מסתמכים על טכניקה זו כדי לחקור מוות תאי, מדוע שלא נסקור חלק מהיישומים שלה.
באמצעות הליך זה, מדענים יכולים לעקוב אחר אילו חלבונים תאיים מעורבים אפופטוזיס. בסרטון זה, החוקרים ניתחו את ההשפעה של סיספלטין, תרופה נגד סרטן, על תאי כליות רגילים כדי לראות אם זה תורם אפופטוזיס. קבוצה אחת של תאים הועברה כדי להגזים בצורה פעילה של חלבון האנזים קינאז C, או PKC, והסט השני הועבר בצורה לא פונקציונלית – PKC שלילי דומיננטי. תאים המבטאים PKC ומטופלים בשיספלטין עברו אפופטוזיס לאורך זמן, אך תאים המבטאים את PKC השלילי הדומיננטי הלא פעיל היו עמידים לאפופטוזיס, מה שמצביע על כך שהאנזים הוא שחקן מפתח במסלול אפופטוזיס המושרה בשיספלטין.
החוקרים גם משתמשים בכתמים אלה כדי לבדוק את הפוטנציאל הציטוטוקסי של תאי T ספציפיים. תאי T ציטוטוקסיים יכולים לזהות חלבוני ממברנה ספציפיים בתא היעד שלהם, ולעורר את מותו על קשירה אליו. כאן, החוקרים דגגרו תאי T ספציפיים לאנטיגן עם תאי גידול ממוקדים ונספח V, ולאחר מכן נצפו אינדוקציה של אפופטוזיס תא הגידול על ידי מעורבות תאי T. נתוני ציטומטריית זרימה חשפו את אחוז המוות מתאי היעד בנוכחות ובהיעדר תאי T ציטוטוקסיים.
לבסוף, מדענים משתמשים בשיטה זו כדי להעריך את הכדאיות של התאים לאחר אספקת גנים. במקרה זה, החוקרים רצו להעריך את הישרדות התא לאחר נוקלאופקט – שיטה המשתמשת בשילוב של כימיקלים ושדה חשמלי מיושם כדי ליצור נקבוביות חולפות בקרומים תאיים וגרעיניים, ובכך להקל על אספקת גנים. באמצעות annexin V בתוספת צבע שנקרא 7-אמינוקטינומיצין D או 7-AAD, אשר, בדומה PI נקשר ל- DNA, הם הראו כי נוקלאופקטציה גרמה למוות תאים נמוך על ידי אפופטוזיס או נמק.
הרגע צפית בסרטון של ג'וב על תיוג אגף 5 ו-PI. בסרטון זה דנו בקצרה בתכונות הייחודיות של תאים אפופוטוטיים ונמקיים, סקרנו את העקרונות שמאחורי שיטה זו, צפינו בהליך כללי עבור טכניקה נפוצה זו, והקדמנו יישומים מסוימים. בהתחשב בחשיבות של הבנת האופן שבו תאים שונים מתים בתנאים שונים, תיוג ה- V וה- PI של סיפוח משמש ככלי חשוב לביולוגים של תאים המעוניינים בתופעה זו. כמו תמיד, תודה שצפית!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: How does phosphatidylserine translocation distinguish apoptotic cells from necrotic cells?
During apoptosis, cytosolic caspases activate scramblase, an enzyme that translocates phosphatidylserine (PS) residues from the inner cell membrane to the outer surface. In necrosis, PS remains internal but the membrane ruptures. Annexin V binds externalized PS in early apoptotic cells, while propidium iodide enters only when membranes rupture, allowing researchers to differentiate between these death pathways.
Q2: Why is propidium iodide used alongside annexin V in cell death assays?
Propidium iodide (PI) is a membrane-impermeable DNA-binding dye that enters cells only when membranes rupture. Since annexin V alone cannot distinguish early apoptosis from late apoptosis or necrosis, PI provides critical differentiation. Cells positive for annexin V but negative for PI indicate early apoptosis, while double-positive cells represent late apoptotic or necrotic cells.
Q3: What are the key steps in preparing cells for annexin V and propidium iodide staining?
Cells are harvested and centrifuged at low speed, then resuspended in phosphate-buffered saline (PBS). After centrifugation, cells are resuspended in annexin V binding buffer containing calcium, which is necessary for annexin binding to phosphatidylserine. Annexin V conjugated with fluorescein isothiocyanate (FITC) is added and incubated in the dark, followed by propidium iodide addition and another dark incubation.
Q4: How does flow cytometry interpret annexin V and propidium iodide staining patterns?
Flow cytometry plots annexin-FITC intensity on the logarithmic X-axis and PI on the Y-axis. Cells positive for annexin-FITC but negative for PI cluster in the lower right quadrant, representing early apoptotic cells. Double-positive cells appear in the upper right, indicating late apoptotic or necrotic cells. Unstained or insignificantly stained cells in the lower left represent live cells.
Q5: How have researchers used annexin V and PI labeling to study protein kinase C in cisplatin-induced apoptosis?
Researchers compared kidney cells overexpressing active protein kinase C (PKC) with cells expressing inactive dominant-negative PKC. When treated with cisplatin, cells with active PKC underwent apoptosis over time, while dominant-negative PKC cells resisted apoptosis. This demonstrated that PKC is a key player in the cisplatin-induced apoptosis pathway, revealing important mechanisms of an introduction to cell death.
Q6: What do annexin V and PI staining reveal about cytotoxic T cell function?
Researchers incubate antigen-specific cytotoxic T cells with target tumor cells in the presence of annexin V and PI. Flow cytometry data reveals the percentage of target cell death induced by T cell engagement. This method demonstrates how cytotoxic T cells recognize specific membrane proteins on target cells and induce apoptosis upon binding.
Q7: How is annexin V and PI staining used to assess cell viability after nucleofection?
Nucleofection uses chemicals and electric fields to create transient pores in cell membranes for gene delivery. Researchers use annexin V plus 7-aminoactinomycin D (7-AAD), a DNA-binding dye similar to PI, to evaluate cell survival post-nucleofection. This staining approach quantifies cell death by apoptosis or necrosis, demonstrating nucleofection's impact on cell viability.