Name: פרוטוקול משופרת עבור כרומטין Immunoprecipitation של שרירי השלד העכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: למדו פרוטוקול משופר לכרומטין Immunoprecipitation משרירי שלד עכבריים. שיטה זו מאפשרת הכנת כרומטין ChIP-grade מרקמה עמידה ועשירה בחלבונים מבניים לחקר ויסות גנים ומנגנוני אטרופיה שרירית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים כל הסגל של המתקן רצף של תפוקה גבוהה IGBMC, חבר קונסורציום "צרפת Génomique" (ANR10-INBS-09-08), כל שירותי כללית IGBMC בפרט הצוות של המתקן בעלי חיים IGBMC. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של CNRS, INSERM של AFM, le חדר מרווח וחדיש הליגה הלאומית לסרטן, הצרפתים המדינה קרן דרך ANR תחת התוכנית d'Avenir Investissements מתויג ANR-10-IDEX-0002-02, Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 ובפרמטר ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. התורמים שחיים היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה לפרסם או אופן ההכנה של כתב היד. S. J נתמך על ידי le חדר מרווח וחדיש של הליגה הלאומית לסרטן ANR-AR2GR-16-CE11-009-01, ואת V.U על ידי l'Enseignement דה Ministère et de la Recherche. מזהה הוא "נבחרת labellisée" של לה חדר מרווח וחדיש הליגה הלאומית לסרטן.

עכברים הוחזקו בהתאם להנחיות מוסדיים לגבי טיפול ו שימוש של חיות מעבדה ועל פי הנחיות טיפול החיה הלאומית (הנציבות האירופית הוראת 86/609/CEE; צרפתית פוסק no.87-848). כל ההליכים אושרו על ידי ועדת האתיקה הארצית צרפתי.
 1. בידוד של רקמת שריר <ol><li>הקרבה 6 מבוגר אחד בן שבוע 8 העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם. Sterlise האיבר על ידי שטיפה זה עם 70% אתנול ומנתחים את שרירי הגפיים האחוריות (הסובך, Anterior השוקה, הארבע ראשי) באמצעות מלקחיים ומספריים הצבע בסדר. 
	הערה: עכבר אחד אמור להניב בסביבות 500 מ ג של רקמת.</li>
	<li>מינצ השרירים במבחנה 2 מ"ל המכיל 1 מ"ל של מאגר היפוטוניק קר כקרח כדי הכנה הומוגנית של קטן (&#60; 2-3 מ מ 3) חתיכות באמצעות בסדר מספריים ולהשאיר את הצינור רועדת על מסית העליון הספסל ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5-10 דקות</li>
</ol> 2. פירוק רקמת הערה: נא עיין טבלה 1 עבור כל מאגר יצירות.
<ol><li>להעביר את homogenate צינור עגול-התחתון 14 מ"ל, resuspend מ ל מאגר היפוטוניק קר (ללא EDTA פרוטאז מעכב קוקטיילים ו- PMSF).
	<ol><li>Homogenise רקמת השריר טחון באמצעות של דאונס רופף (20-30 קווים בתוך 3 דקות) או מהמגן רקמה מכנית של 15-30 s ב- mL 14 סיבוב המדרגה צינורות. 
		הערה: היעילות של פירוק יכול להידרש בשלב זה על ידי מיקרוסקופ אור, אם נדרש, ניתן לבצע שיבושים נוספים-</li>
	</ol></li> <li>להעביר את homogenate 15 mL צינורות ומלא עוצמה 10 מ ל באמצעות מאגר היפוטוניק קר. לתקן את homogenate, כפי שמתואר להלן לפני שתמשיך עם העכבר הבאה.</li>
</ol> 3. קיבוע <ol><li>להוסיף פורמלדהיד הריכוז הסופי של 1%, לנענע 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להוסיף גליצין ריכוז סופי של 0.125 מ' כל צינור כדי לעצור את קיבוע ו- shake למשך 5-10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
</ol> 4. הכנה גרעינים הערה: נא עיין טבלה 1 עבור כל מאגר יצירות.
<ol><li>Homogenise קבוע lysate באמצעות של דאונס רופף (5-10 משיכות).
	<ol><li>העברת צינור 15 מ"ל ו צנטריפוגה ב 1,000 x g למשך 5 דקות ב 4 ° C כדי להשיג גרעינים ופסולת הסלולר.</li>
	</ol></li> <li>להסיר את תגובת שיקוע, resuspend בגדר במאגר היפוטוניק מ ל טריים. לסנן את lysate דרך מסננת תא מיקרומטר 70 לתוך צינור 50 מ. מחדש לסנן את פילטרט של דרך מסננת תא 40 µm.</li>
	<li>להעביר את פילטרט של שפופרת 15 מ"ל ו צנטריפוגה ב 1,000 x g למשך 5 דקות ב 4 ° C כדי להשיג בגדר גרעינית. 
	הערה: בשלב זה, הגרעינים יכול להיות sonicated מיד או תצמיד קפוא כמו גלולה יבש חנקן נוזלי ומאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס</li>
</ol> 5. Sonication <ol><li>להעריך את עוצמת הקול של בגדר גרעינית (בסביבות 50 µL עבור homogenisation מכני וגם דאונס) resuspend זה במאגר sonication עד 3-4 פעמים נפח הגרעין ארוזה ואת sonicate למשך 10-15 דקות ב 4 ° C באמצעות sonicator . 
	הערה: כרומטין יכול להיות מנותח מיד כמפורט להלן (6) או קפוא ומאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס</li>
</ol> 6. הערכת גודל המקטע כרומטין בעקבות Sonication הערה: נא עיין טבלה 1 עבור כל מאגר יצירות.
<ol><li>כדי דה-crosslink, לקחת 30 µL של כרומטין במבחנה 1.5 מ"ל ולהוסיף 20 µL 5 מ' NaCl. להשלים את אמצעי האחסון 500 µL, דגירה-65 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
	<ol><li>למחרת לבצע טיפול עם 1 µL proteinase K (20 מ"ג/מ"ל מלאי), 10 µL 2 מ' טריס pH 6.8 ו- 10 µL של EDTA 0.5 M עבור h 1-42 מעלות צלזיוס בצע פנול-כלורופורם/כלורופורם החילוץ, לזרז את ה-DNA עם נפח 1 של נתרן acetat e (3 מ') ו- 2 כרכים של אתנול 100% עבור h אחד ב-80 מעלות צלזיוס או ללון ב-20 מעלות צלזיוס</li>
	</ol></li> <li>גלולה ה-DNA על ידי צנטריפוגה-13,500 g x עבור 15 דקות Decant תגובת שיקוע, לשטוף את צניפה ביסודיות עם אתנול 70% קר, צנטריפוגה שוב על 5 דק Decant תגובת שיקוע, מילה נהדרת בגדר.</li>
	<li>Resuspend בגדר באמצעי האחסון המקורי (30 µL) טה המאגר. למדוד את ריכוז הדנ א בספקטרופוטומטר על ידי ספיגת-260 ננומטר/280 ננומטר. Pipette 500-1, 000 ng של ה-DNA יחד עם סולם גודל ה-DNA על מסלולים נפרדים של 1.5% agarose ג'ל ולבצע אלקטרופורזה כדי להעריך את גודל המקטע כרומטין. 
	הערה: גודל המקטע צריך להיות בין 200-500 בסיסים, צריך להיות אין שברי משקל מולקולרי גבוה לזיהוי המתאימים כדי לא או גרוע-מפוצלים הדנ א. אם נדרש, הפתרון כרומטין (שלב 5) יכול להיות מחדש sonicated למשך זמן ארוך יותר ובדקתי אז מחדש כמתואר לעיל עד גודל אופטימלי מתקבל.</li>
</ol> 7. Immunoprecipitation כרומטין (ChIP) הערה: נא עיין טבלה 1 עבור כל מאגר יצירות.
<ol><li>Sepharose לחסום חלבון G חרוזים מאת aliquoting 1 מ"ל של slurry 50% אתנול. צניפה החרוזים על ידי צנטריפוגה ב 400 x g עבור 1 דקות ב- benchtop צנטריפוגה, לשטוף עם 1 מ"ל של טה צנטריפוגה מאגר ב 400 x g וחזור לשטיפה של
	<ol><li>לאחר צנטריפוגה את השני, להשעות מחדש ב 1 מ"ל שבב מאגר דילול עם 25 µL של BSA (מניות 20 מ"ג/מ"ל), 20 µL שמרים tRNA (מניות 10 mg/mL). לחסום את החרוזים לפחות 2 שעות לפני השימוש על ידי סיבוב (40-60 rpm) ב-4 מעלות צלזיוס</li>
		<li>µG לדלל 50 של כרומטין (שלב 5) 8-10 פעמים באמצעות שבב דילול מאגר. להוסיף 50 µL של slurry חרוז חסומים ולאחר תקופת דגירה של 2 h סיבוב (40-60 rpm) ב-4 ° C. צנטריפוגה ב 400 g x ב 4 ° C כדי להשיג כרומטין מאושר מראש ואת להעביר אותו צינור טריים.</li>
	</ol></li> <li>Immunoprecipitation, להוסיף את הכמות המתאימה של נוגדן ראשוני (למשל, 1-2 µg לכל µg 10 של כרומטין), דגירה בין לילה עם סיבוב ב-4 מעלות צלזיוס 
	הערה: הכמות האופטימלית של נוגדן המומלצים על ידי הספק או יכול להיקבע מדעית על ידי ביצוע שבב-qPCR עם כמויות שונות של נוגדן עד העשרה האופטימלי הוא ציין. גם חלבון G sepharose עשויים להיות מוחלפים על ידי חלבון א' sepharose בהתאם סוג המשנה של הנוגדן בשימוש.</li>
	<li>להוסיף את החרוזים חסומים ביום המחרת, תקופת דגירה של h 1 עם סיבוב (40-60 rpm) ב-4 ° C. צנטריפוגה ב 400 g x עבור 20-30 s הצניפה החרוזים, להסיר את תגובת שיקוע, ולהתחיל את השבב שוטף.</li>
	<li>שבב שוטף: לבצע את מנקי הבאים עם המאגרים: פעם אחת עם מאגר מלח נמוכה, ואז פעמיים עם מאגר מלח גבוהה, פעמיים עם מאגר LiCl, ולבסוף פעמיים עם מאגר טה.
	<ol><li>לבצע כל כביסה 10 דקות עם סיבוב (40-60 rpm) ב 4 ° C, גלולה החרוזים בין כל כביסה על ידי צנטריפוגה ב 400 g x עבור 20-30 s ומפרידה ספסל-top-</li>
	</ol></li> <li>, • תנאי להסיר בכביסה האחרונה, resuspend את החרוזים במאגר 250 µL • תנאי (הטרי) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר תוך כדי טלטול.</li>
	<li>צנטריפוגה 400 x g ולאסוף eluate בשפופרת טריים. ביצוע זה צעד פעמיים ולאחר מכן דה-crosslink eluate בין לילה עם 20 µL M NaCl 5 ו- A RNase 1 µL (10 mg/mL), לטיפול עם proteinase K, פנול-כלורופורם/כלורופורם תכונות נוספלהתנהג כמו לשלב 6.</li>
	<li>Resuspend ב µL 50 טה המאגר ולעשות שימוש aliquots שבב-qPCR לפי פרוטוקולים סטנדרטיים 15 כדי לבדוק את האיכות של השבב.</li>
</ol>

<ol><li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).</li>
<li>Furey, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+and+beyond%3A+new+and+improved+methodologies+to+detect+and+characterize+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions.</a> Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).</li>
<li>Wade, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+Transcription+Regulatory+Networks+with+ChIP-seq+and+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Mapping Transcription Regulatory Networks with ChIP-seq and RNA-seq.</a> Adv Exp Med Biol. 883, 119-134 (2015).</li>
<li>Alpern, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAF4%2C+a+subunit+of+transcription+factor+II+D%2C+directs+promoter+occupancy+of+nuclear+receptor+HNF4A+during+post-natal+hepatocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">TAF4, a subunit of transcription factor II D, directs promoter occupancy of nuclear receptor HNF4A during post-natal hepatocyte differentiation.</a> Elife. 3, e03613(2014).</li>
<li>Martianov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+occupancy+of+an+extended+repertoire+of+CREM+and+CREB+binding+loci+in+male+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Cell-specific occupancy of an extended repertoire of CREM and CREB binding loci in male germ cells.</a> BMC Genomics. 11, 530(2010).</li>
<li>Achour, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+identity+genes+regulated+by+super-enhancers+are+preferentially+down-regulated+in+the+striatum+of+Huntington%27s+disease+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Neuronal identity genes regulated by super-enhancers are preferentially down-regulated in the striatum of Huntington's disease mice.</a> Hum Mol Genet. 24 (12), 3481-3496 (2015).</li>
<li>Joshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEAD+transcription+factors+are+required+for+normal+primary+myoblast+differentiation+in+vitro+and+muscle+regeneration+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">TEAD transcription factors are required for normal primary myoblast differentiation in vitro and muscle regeneration in vivo.</a> PLoS Genet. 13 (2), e1006600(2017).</li>
<li>Ohkawa, Y., Mallappa, C., Dacwag-Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOhkawa%2C+Y+%22Myogenesis%3A+Methods+and+protocols%22">Myogenesis: Methods and protocols</a>. DiMario, J. 798, Springer Science+Business Media LLC. 517-531 (2012).</li>
<li>Dimauro, I., Pearson, T., Caporossi, D., Jackson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+protocol+for+the+subcellular+fractionation+of+skeletal+muscle+cells+and+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">A simple protocol for the subcellular fractionation of skeletal muscle cells and tissue.</a> BMC Res Notes. 5, 513(2012).</li>
<li>Thomas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAK1+and+CtBP1+Regulate+the+Coupling+of+Neuronal+Activity+to+Muscle+Chromatin+and+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PAK1 and CtBP1 Regulate the Coupling of Neuronal Activity to Muscle Chromatin and Gene Expression.</a> Mol Cell Biol. 35 (24), 4110-4120 (2015).</li>
<li>Kuo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+glucocorticoid+receptor-binding+sites+in+myotubes+identifies+gene+networks+modulating+insulin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of glucocorticoid receptor-binding sites in myotubes identifies gene networks modulating insulin signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (28), 11160-11165 (2012).</li>
<li>Whyte, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Master+transcription+factors+and+mediator+establish+super-enhancers+at+key+cell+identity+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes.</a> Cell. 153 (2), 307-319 (2013).</li>
<li>Benhaddou, A., Keime, C., Ye, T., Morlon, A., Michel, I., Jost, B., Mengus, G., Davidson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+TEAD4+regulates+expression+of+myogenin+and+the+unfolded+protein+response+genes+during+C2C12+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Transcription factor TEAD4 regulates expression of myogenin and the unfolded protein response genes during C2C12 cell differentiation.</a> Cell Death and Differentiation. 19 (2), 220-231 (2011).</li>
<li>Cowling, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+dynamin+2+expression+rescues+X-linked+centronuclear+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy.</a> J Clin Invest. 124 (3), 1350-1363 (2014).</li>
<li>Thermo Fisher Scientific. ChIP Analysis. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html">https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html</a> (2017).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

כאן נתאר פרוטוקול הרומן להכנת כרומטין של שרירי השלד העכבר הבוגרים ולהראות כי כרומטין הזה מתאים ניסוי שבב לזהות איגוד פקטור שעתוק והשינויים היסטון קוולנטיות גרעינים סיבי השריר. פרוטוקול זה כרוך במספר שלבים קריטיים. הראשונה היא הפרעה רקמות שניתן לבצע דאונס או באמצעות הטיית מכני. הטיית מכני יותר לשחזור ומהירה, ולכן הוא שיטת הבחירה. יחד עם זאת, אם אין מכשיר מתאים זמין, הפרעה יכול גם להתבצע על ידי douncing, שבו הערכת היעילות של פירוק תחת המיקרוסקופ מומלץ לפני שתמשיך לשלב קיבוע. קיבוע של כל רקמה lysates, יותר מאשר הקיבעון של ג...

Immunoprecipitation כרומטין (ChIP) מצמידים תגובת שרשרת של פולימראז כמותית (qPCR), רצף תפוקה גבוהה (צ'יפ-seq) הפכו את השיטות של הבחירה ללמוד שעתוק ו epigenetic בקרת גנים ברקמות שונות סוגי תאים1. טכניקה זו מאפשרת הגנום כולו פרופיל של שינויים כרומטין קוולנטיות, תפוסת variant היסטון שעתוק מקדם האיגוד2,3.
בזמן ביצוע שבב של תאים בתרבית וותיקה, השבב של רקמות יונקים נשאר יותר מאתגר. הכנת כרומטין שבב כרוך במספר שלבים קריטיים צריך להיות מותאם לכל סוג הרקמה והתא. כרומטין ניתן להכין את lysates הסלולר של תאים בתרבית או טיהור הבאים בגרעין. במקרה של רקמות יונקים, פירוק יעיל קיבוע פורמלדהיד, טיהור של גרעינים הם קריטיים כדי להבטיח התאוששות אופטימלי של כרומטין. יתר על כן, לבחור לתקן הגרעינים לפני או אחרי טיהור שלהם צריך להיקבע השפעול. למרות משוכות אלה, שבב בוצעה בהצלחה רקמות כמו הכבד, testis, או המוח4,5,6. במקרה של שריר השלד, שיבוש כזה עמיד פיזית טישו, אשר מוצגים תכולה גבוהה של חלבונים מבניים, ובידוד של הגרעינים שלה הוא מאתגר במיוחד. בהתחשב סגוליות זה, פרוטוקולים ממוטב בשביל לרקמות אחרות לא נותנים תוצאות משביעות רצון לשרירי השלד.
כאן נתאר פרוטוקול לבודד את השבב-כיתה כרומטין של רקמת שריר השלד העכבר המערבת פיזית לשבש את הרקמה, קיבוע פורמלדהיד, ולאחר מכן הבידוד של גרעינים, sonication. היעילות של שיטה זו להכין כרומטין מתאים שבב מרקמות זה הודגם על-ידי ביצוע שבב-qPCR וצ'יפ-seq עבור שונים גורמי שעתוק RNA פולימראז II, שינוי היסטון קוולנטיות7.
טכניקה חדשה זו הרבה יותר מהר מאשר פרוטוקול שדווחה בעבר8 הכוללת זמן collagenase עיכול צעדים אשר במהלכו, שינויים לוקליזציה גנומית של גורמי שעתוק, שינויים בביטוי הגנים יכול להתרחש. מהירות שבה הם הגרעינים מבודד ו קבוע הופך את השיטה המתוארת כאן אטרקטיביים במיוחד להכין כרומטין הלוכד יותר בנאמנות את המדינה יליד תפוסת גנומית. יתר על כן, למרות שיש שיטות נוספות כרומטין בידוד חלבון או חילוץ של רקמת שריר יש כבר מתואר8,9,10 ומשמש לניסויים שבב-qPCR את הגנים הנבחר, אין שבב-seq נתונים דווחה השימוש בהם. שיטת דיווח כאן מתאים שעתוק מקדם, היסטון השינוי שבב-seq, ולכן צריכה להיות גם מתאים 3 / 4C או היק כרומטין קונפורמציה ללכוד יישומים.

<table><tbody><tr><td>T 25 דיגיטלי אולטרה-טורקס</td><td>T 18 אולטרה-טורקס</td><td>0009022800</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>סיגמא-אולדריץ' צ'ימי SARL</td><td>P7626-25G</td><td></td></tr><tr><td>מעכב פרוטאז קוקטייל-EDTA ללא</td><td>רוש אבחון</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>חלבון G חרוזי ספרוז</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>P-3296</td><td></td></tr><tr><td>פרוטאינאז K</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>P-2308</td><td></td></tr><tr><td>מסנני תאים 70um</td><td>Corning BV</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>מסנני תאים 40um</td><td>Corning BV</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>פורמלדהיד EM כיתה</td><td>Euromedex</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Fischer Scientific</td><td>12091039</td><td></td></tr><tr><td>פנול: כלורופורם: איזואמיל אלכוהול 25: 24: 1</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>B4287-25G</td><td></td></tr><tr><td>שמרים tRNA</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>R5636</td><td></td></tr><tr><td>גליקוגן כחול</td><td>AMIBION</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Pol II ChIP נוגדן</td><td>סנטה קרוז</td><td>SC-9001</td><td></td></tr><tr><td>H3K27ac ChIP נוגדן</td><td>מוטיב פעיל</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>Tead4 ChIP נוגדן</td><td>אביבה מערכות ביולוגיה</td><td>(ARP38276_P050)</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>I-3021</td><td></td></tr><tr><td>E220 ממוקד אולטרה-סוניקטור</td><td>Covaris E220</td><td></td><td></td></tr><tr><td>שם</td><td>חברה</td><td>מספר קטלוגי</td><td>הערות</td></tr><tr><td>פריטים נוספים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מספריים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Loose Dounce</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל ו-50 מ"ל שפופרות</td><td></td><td></td><td></td>בז</tr><tr><td>14 מ"ל צינורות תחתונים עגולים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>1.5 מ"ל ו -2 מ"ל צינורות אפנדורף</td></tr><tr><td>70 &mu; m ו-40 &mu; מסנני תאים m (קורנינג)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

פרוטוקול משופרת עבור כרומטין immunoprecipitation של שרירי השלד העכבר

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

אנו מתארים פרוטוקול לשחזור ויעיל עבור הכנת כרומטין של שריר השלד העכבר למבוגרים, טישו פיזית עמיד עם תכולה גבוהה של חלבונים מבניים. שרירי הגפיים ביתור של עכברים בוגרים הן משובשות פיזית על ידי מכני homogenisation, או שילוב של הא ו douncing, במאגר היפוטוניק לפני פורמלדהיד קיבוע של התא lysate. גרעינים קבוע כבר טהור לפי מחזורים נוספים homogenisation מכני, סינון רציפים כדי להסיר שאריות תאים או douncing. גרעינים מטוהרים יכול להיות sonicated באופן מיידי או בשלב מאוחר יותר לאחר הקפאה. יכול להיות sonicated ביעילות כרומטין, הוא השיג מתאימה לניסויים immunoprecipitation כרומטין, כפי שהודגמה בעזרת הפרופילים עבור גורמי שעתוק RNA פולימראז II, שינוי היסטון קוולנטיות. האירועים איגוד זוהה באמצעות כרומטין שהוכנו על ידי פרוטוקול זה הם בעיקר אלה מתרחשים גרעינים סיבי השריר למרות נוכחותם של כרומטין של הלווין האחר הקשורים סיבים ותאי אנדותל. פרוטוקול זה לכן מותאם ללמוד הכונה בשריר השלד העכבר למבוגרים.

כדי לבודד גרעין האטום, ביצענו המגון מכני של רקמת שריר גזור, טחון לסופרן או 15 או 45, ב rpm 18,000, 22,000 (ראה טבלה של חומרים). בכל תנאי, יכול להיות מופרדים גרעיני רקמת הלבלב, אבל התשואה היה אופטימלי באמצעות המהירות נמוכה יותר (איור 1 א'-ב'). הגרעינים יכול גם להיות מוכנים על ידי douncing למשך 3-5 דקות (איור 1A, והנתונים לא מוצג), אבל המגון מכנית היא השיטה של בחירה, כמו תשואות אופטימלית של הגרעיני...

פרוטוקול חדש עבור הכנת כרומטין של שרירי השלד העכבר למבוגרים הותאם במחקר של הכונה של סיבי השריר על ידי כרומטין immunoprecipitation מוצג.

פרוטוקול משופרת עבור כרומטין Immunoprecipitation של שרירי השלד העכבר

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להכין כרומטין משריר השלד של עכבר בוגר. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בוויסות גנים וסיבי שריר שלד. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת הכנת כרומטין בדרגת ChIP משריר השלד של העכבר.רקמה עמידה פיזית עם תכולה גבוהה של חלבונים מבניים. הרעיון של שיטה זו עלה לראשונה כאשר ביקשנו לאפיין את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס ניוון שרירים המפרקים גלוקו, הדורש זיהוי של קולטני גלוקו, אתרי קשירת DNA בסיבי שריר השלד של העכבר. מי שתדגים את ההליך תהיה שילפי ג'ושי, פוסט-דוקטורנטית מהמעבדה שלנו.כדי להתחיל בהליך זה, שחזר שרירי גפיים אחוריות קפואים או מנותחים טריים. לאחר מכן, טוחנים את השרירים במבחנה של שני מיליליטר, המכילה מיליליטר אחד של חיץ היפוטוני קר כקרח להכנה הומוגנית של חתיכות קטנות, בעזרת מספריים עדינים. לאחר מכן, השאירו את הצינור רועד על מערבל ספסל בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך חמש עד 10 דקות.לאחר מכן, העבירו את הרקמה המנותחת לצינור תחתון עגול של 14 מיליליטר המכיל ארבעה מיליליטר של מאגר היפוטוני קר. הומוגניזציה של הרקמה הטחונה באמצעות הומוגנייזר רקמות מכני למשך 15 עד 30 שניות. לאחר מכן, העבירו את ההומוגנאט לצינור של 15 מיליליטר.הוסף מאגר היפוטוני קר כדי לגרום ל-10 מיליליטר מהדגימה ולתקן את ההומוגנאט לפני שתמשיך עם העכבר הבא. בהליך זה, הוסף פורמלדהיד לדגימה כדי לגרום לריכוז סופי של 1%. ואז לנער במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, הוסף גליצין כדי לגרום לריכוז סופי של 0.125 מולארי בכל צינור כדי לעצור את הקיבוע. ולנער חמש עד 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הומוגניזציה של הליזט הקבוע, באמצעות טיפה רופפת.לאחר מכן, העבירו אותו לצינור של 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב-1000 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להשיג גרעינים ופסולת תאית. לאחר חמש דקות, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר של חיץ היפוטוני טרי. מסננים את הליזאט דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור של 50 מיליליטר.בעזרת קצה פיפטה, שטפו את המסנן עם מיליליטר אחד של מאגר היפוטוני קר. לאחר מכן, סנן מחדש את המסנן דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר. לאחר מכן, העבירו את המסנן לצינור של 15 מיליליטר.וצנטריפוגה ב-1000 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להשיג את הגלולה הגרעינית. לאחר השלכת הסופרנטנט, השתמש במיליליטר אחד של חיץ היפוטוני כדי לאגד את שלושת הכדורים ולהעביר לצינור של 1.5 עד שני מיליליטר. צנטריפוגה בחום של 1000 גרם למשך חמש דקות.לאחר מכן, העריכו את נפח הגלולה הגרעינית בהשוואה לצינורות המכילים נפח ידוע של נוזל והשעו אותו מחדש במאגר סוניקציה עד פי שלושה עד ארבעה מהנפח הגרעיני הארוז. לאחר מכן, סוניקציה של המתלה למשך 10 עד 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס, באמצעות סוניקטור. צנטריפוגה את הדגימה הסוניקטיבית והעבירו את הכרומטין לצינור טרי של 1.5 מיליליטר.כדי לנתק את הקישור הצולב, קח 30 מיקרוליטר כרומטין במבחנה של 1.5 מיליליטר והוסף 20 מיקרוליטר של חמישה נתרן כלורי מולארי ו -450 מיקרוליטר מים. השלם את הנפח ל -500 מיקרוליטר ודגר ב -65 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, בצע טיפול במיקרוליטר אחד של Proteinase K, 10 מיקרוליטר של שני טריס מולארי ב-pH 6.8 ו-10 מיקרוליטר של 0.5 EDTA מולרי למשך שעה ב-42 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, בצע מיצוי כלורופורם פנול-כלורופורם רגיל וזרז את ה-DNA בנפח אחד של נתרן אצטט ושני נפחים של 100% אתנול למשך שעה אחת במינוס 80 מעלות צלזיוס או לילה במינוס 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, גלולה את ה- DNA על ידי צנטריפוגה ב 13, 500 גרם למשך 15 דקות. רוקנים את הסופרנטנט ושוטפים את הגלולה היטב עם אתנול קר 70% וצנטריפוגה שוב למשך חמש דקות.לאחר מכן יש לשפוך את הסופרנטנט ולייבש את הגלולה באוויר. לאחר מכן השעו מחדש את הגלולה בנפח המקורי של מאגר tris HCl EDTA. למדוד את ריכוז ה-DNA בספקטרופוטומטר על ידי סופגים ב-260 ננומטר, 280 ננומטר.לאחר מכן, פיפט 500 עד 1000 ננוגרם של DNA יחד עם סולם בגודל DNA בנתיבים נפרדים של ג'ל אגרוז 1.5%. ולבצע אלקטרופורזה כדי להעריך את גודל השבר של הכרומטין. כדי לייעל, ההומוגניזציה בוצעה במשך 15 שניות או 45 שניות בשתי מהירויות, 18, 000 ו-22,000 סל"ד.בכל התנאים, ניתן היה להפריד גרעינים מפסולת הרקמה, אך התשואה הייתה אופטימלית באמצעות מהירות נמוכה יותר. ניתן להכין גרעינים גם על ידי ניתוק במשך שלוש עד חמש דקות. אבל הומוגניזציה מכנית היא שיטת הבחירה שכן ניתן להשיג תשואות אופטימליות של גרעינים תוך 15 שניות בלבד, מה שמאפשר רווח חשוב של זמן, במיוחד אם יש צורך לעבד מספר דגימות.באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לבודד עד 2.7 כפול 10 לשבעת הגרעינים מ-500 מיליגרם של רקמה כדי לייצר 100 מיקרוגרם כרומטין. כרומטין המוכן בדרך זו נותן תוצאות נקיות ואיכותיות בניסויי ריצוף ChIP. כפי שמודגם על ידי הרמות הגבוהות של K27 אצטיל של היסטון H3 ו-RNA פולימראז 2 בלוקוס דזמונד המתבטא בשריר.הספציפיות של סיבי השריר מוצגת על ידי אות נמוך או נעדר במיקומי Pecam1 ו-Vcam1 שאינם באים לידי ביטוי בשריר. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לטבול כראוי את בדיקת ההומוגנייזר בדגימה כדי למנוע הקצפה, לנקות את הגשושית בין הדגימות ולייעל את פיצול הכרומטין. כרומטין שהוכן בדרך זו שימש בהצלחה למען ChIP למיפוי תפוסת גורמי שעתוק ברחבי הגנום ואמור להתאים גם לטכניקות לכידת אישור כרומטין.לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך למחקר בתחום הגנומיקה, לחקר ויסות גנים בשרירי השלד מעכברים. ניתן ליישם את ההליך גם על שרירים מחולדה וביופסיות מחולים אנושיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בהומוגניזציה מכנית, ואחריו טיהור של גרעינים קבועים בפורמלדהיד להכנת כרומטין משריר השלד למשקעים חיסוניים.אל תשכח שעבודה עם פורמלדהיד, פנול, כלורופורם ופרוטאינאז K עלולה להיות מסוכנת. יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות ומשקפיים. יש לבצע שלבים הכוללים ריאגנטים אלה מתחת למכסה המנוע.

improved-protocol-for-chromatin-immunoprecipitation-from-mouse

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

אנו מדגימים immunoprecipitation הכרומטין (שבב) שיטה לזהות אינטראקציות גורם ספציפי על רקמות גנים במהלך או לאחר הופעת ביטוי גנים ברקמות ספציפיות ברקמות עובריים בעכבר. פרוטוקול זה צריך להיות רלוונטי נרחב לחקר ההפעלה רקמות ספציפיות גן כפי שהיא מתרחשת במהלך ההתפתחות העוברית נורמלי.

הכרומטין Assay immunoprecipitation עבור גנים ספציפיים רקמות באמצעות שלבים מוקדמים של עוברי עכברים

אנו מתארים שיטה חזקה לimmunoprecipitation הכרומטין באמצעות תאי T ראשוניים. השיטה מבוססת על גישות סטנדרטיות, אך משתמשת בקבוצה מסוימת של תנאים וריאגנטים המשפרים את היעילות למוגבלים בכמויות של תאים. חשוב מכך, תיאור מפורט של שלב ניתוח הנתונים מוצג.

הכרומטין immunoprecipitation יעיל באמצעות כמויות מגבילות של ביומסה

עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול לכרומטין immunoprecipitation (שבב) באמצעות קו עכבר T- התא הבוגר. פרוטוקול זה מתאים לחקור את ההפצה של סימני היסטון ספציפיים באתרי מקדם ספציפי או גנום רחב.

הכרומטין Immunoprecipitation (שבב) ב עכבר T-cell שורות

אנו מציגים פרוטוקול מבוסס סינון לבודד גרעינים באיכות גבוהה מן הצלב המקושרים שריר השלד העכבר שבו הסרנו את הצורך ultracentrifugation, מה שהופך אותו ישים בקלות. אנו מראים כי הכרומטין מוכן מן הגרעינים מתאים immunoprecipitation הכרומטין וסביר הכרומטין immunoprecipitation רצף מחקרים.

שיטה המבוססת על סינון של הכנת גרעינים באיכות גבוהה מן שריר השלד צולבות צולבות עבור Immunoprecipitation הכרומטין

אנו מציגים שיטה לשחזור ויעילים כדי לבודד את תרבות ובתאים עצבית של רקמת מוח עובריים ופוסט עבור immunoprecipitation כרומטין (ChIP) של היסטון 3 ליזין 79 dimethylation (H3K79me2) - סימן היסטון ממוקם במרחק תחום הכדוריים של היסטון 3.

בידוד, טיפוח של אבות עצבית ואחריו Immunoprecipitation-כרומטין של היסטון 3 ליזין 79 Dimethylation מארק

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור כרומטין immunoprecipitation של שינויים היסטוניים ששונה מ שמרים ניצני האפייה. Immunoprecipitated DNA משמש לאחר מכן PCR כמותי לחקור את השפע ואת לוקליזציה של שינויים post-translational היסטון ברחבי הגנום.

Immunoprecipitation כרומטין (ChIP) של היסטון שינויים של האפייה

כאן נתאר עבור פרוטוקול immunoprecipitation היעילה כרומטין (ChIP) ואחריו רצפי DNA תפוקה גבוהה (צ'יפ-seq) של רקמת שומן חום (בת) מבודד מן העכבר. פרוטוקול זה מתאים גם מיפוי היסטון שינויים וגם חוקרים הגנום כולו לוקליזציה של חלבונים היסטון שאינו של הריבית ב vivo.

כרומטין Immunoprecipitation של רקמת שומן חום מאתר

כרומטין immunoprecipitation (שבב) הוא כלי רב עוצמה להבנת המנגנונים המולקולריים של רגולציה גנטית. עם זאת, השיטה כרוכה בקשיים בהשגת פיצול כרומטין באמצעות הטיה מכנית. כאן, אנו מספקים פרוטוקול משופר לצורך שיטת שבבים באמצעות עיכול אנזימטי.

כרומטין Immunoprecipitation שימוש בנוקלאוסים מיקרוקוקל בתאי מיונקים

פרוטוקול זה מתמקד בהכנת כרומטין מרקמות קפואות והוא מתאים ל- Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) ואחריו ניתוח PCR כמותי (X-ChIP-qPCR) או גישות ריצוף מהדור הבא (X-ChIP-seq).

מיצוי כרומטין מרקמת כבד כימרית קפואה לניתוח משקעים חיסוניים של כרומטין

מוצג כאן פרוטוקול יעיל לבידוד תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) של תאי לוויין של שרירי גפיים עכבריים המותאם לחקר ויסות שעתוק בסיבי שריר על ידי שסע מתחת למטרות ושחרור באמצעות נוקלאז (CUT&amp;RUN).

פרוטוקול יעיל לניתוח CUT&amp;RUN של תאי לוויין עכבר מבודדים ב-FAC

חוקרים חדשים בתחום האפיגנטי ימצאו את CUT&amp;Tag חלופה קלה משמעותית למבחני ChIP. CUT&amp;Tag הועילה מאוד למחקרים אפיגנטיים על אוכלוסיות תאים נדירות וראשוניות, והפיקה נתונים באיכות גבוהה ממעט מאוד תאים. פרוטוקול זה מתאר ביצוע בדיקות H3K4me1 CUT&amp;Tag על מיובלסטים של עכברים שבודדו משרירי הגפיים האחוריות של העכבר.

שימוש במחשוף תחת מטרות ותיוג (CUT&#38;Tag) בדיקה במחקר מיובלסטים עכבר

למדו פרוטוקול משופר לכרומטין Immunoprecipitation משרירי שלד עכבריים. שיטה זו מאפשרת הכנת כרומטין ChIP-grade מרקמה עמידה ועשירה בחלבונים מבניים לחקר ויסות גנים ומנגנוני אטרופיה שרירית.

פרוטוקול משופרת עבור כרומטין Immunoprecipitation של שרירי השלד העכבר

גלה סרטונים נוספים