פרוטוקול משופרת עבור כרומטין Immunoprecipitation של שרירי השלד העכבר

המטרה הכוללת של הליך זה היא להכין כרומטין משריר השלד של עכבר בוגר. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בוויסות גנים וסיבי שריר שלד. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת הכנת כרומטין בדרגת ChIP משריר השלד של העכבר.

רקמה עמידה פיזית עם תכולה גבוהה של חלבונים מבניים. הרעיון של שיטה זו עלה לראשונה כאשר ביקשנו לאפיין את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס ניוון שרירים המפרקים גלוקו, הדורש זיהוי של קולטני גלוקו, אתרי קשירת DNA בסיבי שריר השלד של העכבר. מי שתדגים את ההליך תהיה שילפי ג'ושי, פוסט-דוקטורנטית מהמעבדה שלנו.

כדי להתחיל בהליך זה, שחזר שרירי גפיים אחוריות קפואים או מנותחים טריים. לאחר מכן, טוחנים את השרירים במבחנה של שני מיליליטר, המכילה מיליליטר אחד של חיץ היפוטוני קר כקרח להכנה הומוגנית של חתיכות קטנות, בעזרת מספריים עדינים. לאחר מכן, השאירו את הצינור רועד על מערבל ספסל בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך חמש עד 10 דקות.

לאחר מכן, העבירו את הרקמה המנותחת לצינור תחתון עגול של 14 מיליליטר המכיל ארבעה מיליליטר של מאגר היפוטוני קר. הומוגניזציה של הרקמה הטחונה באמצעות הומוגנייזר רקמות מכני למשך 15 עד 30 שניות. לאחר מכן, העבירו את ההומוגנאט לצינור של 15 מיליליטר.

הוסף מאגר היפוטוני קר כדי לגרום ל-10 מיליליטר מהדגימה ולתקן את ההומוגנאט לפני שתמשיך עם העכבר הבא. בהליך זה, הוסף פורמלדהיד לדגימה כדי לגרום לריכוז סופי של 1%. ואז לנער במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הוסף גליצין כדי לגרום לריכוז סופי של 0.125 מולארי בכל צינור כדי לעצור את הקיבוע. ולנער חמש עד 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הומוגניזציה של הליזט הקבוע, באמצעות טיפה רופפת.

לאחר מכן, העבירו אותו לצינור של 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב-1000 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להשיג גרעינים ופסולת תאית. לאחר חמש דקות, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר של חיץ היפוטוני טרי. מסננים את הליזאט דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור של 50 מיליליטר.

בעזרת קצה פיפטה, שטפו את המסנן עם מיליליטר אחד של מאגר היפוטוני קר. לאחר מכן, סנן מחדש את המסנן דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר. לאחר מכן, העבירו את המסנן לצינור של 15 מיליליטר.

וצנטריפוגה ב-1000 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להשיג את הגלולה הגרעינית. לאחר השלכת הסופרנטנט, השתמש במיליליטר אחד של חיץ היפוטוני כדי לאגד את שלושת הכדורים ולהעביר לצינור של 1.5 עד שני מיליליטר. צנטריפוגה בחום של 1000 גרם למשך חמש דקות.

לאחר מכן, העריכו את נפח הגלולה הגרעינית בהשוואה לצינורות המכילים נפח ידוע של נוזל והשעו אותו מחדש במאגר סוניקציה עד פי שלושה עד ארבעה מהנפח הגרעיני הארוז. לאחר מכן, סוניקציה של המתלה למשך 10 עד 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס, באמצעות סוניקטור. צנטריפוגה את הדגימה הסוניקטיבית והעבירו את הכרומטין לצינור טרי של 1.5 מיליליטר.

כדי לנתק את הקישור הצולב, קח 30 מיקרוליטר כרומטין במבחנה של 1.5 מיליליטר והוסף 20 מיקרוליטר של חמישה נתרן כלורי מולארי ו -450 מיקרוליטר מים. השלם את הנפח ל -500 מיקרוליטר ודגר ב -65 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, בצע טיפול במיקרוליטר אחד של Proteinase K, 10 מיקרוליטר של שני טריס מולארי ב-pH 6.8 ו-10 מיקרוליטר של 0.5 EDTA מולרי למשך שעה ב-42 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, בצע מיצוי כלורופורם פנול-כלורופורם רגיל וזרז את ה-DNA בנפח אחד של נתרן אצטט ושני נפחים של 100% אתנול למשך שעה אחת במינוס 80 מעלות צלזיוס או לילה במינוס 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, גלולה את ה- DNA על ידי צנטריפוגה ב 13, 500 גרם למשך 15 דקות. רוקנים את הסופרנטנט ושוטפים את הגלולה היטב עם אתנול קר 70% וצנטריפוגה שוב למשך חמש דקות.

לאחר מכן יש לשפוך את הסופרנטנט ולייבש את הגלולה באוויר. לאחר מכן השעו מחדש את הגלולה בנפח המקורי של מאגר tris HCl EDTA. למדוד את ריכוז ה-DNA בספקטרופוטומטר על ידי סופגים ב-260 ננומטר, 280 ננומטר.

לאחר מכן, פיפט 500 עד 1000 ננוגרם של DNA יחד עם סולם בגודל DNA בנתיבים נפרדים של ג'ל אגרוז 1.5%. ולבצע אלקטרופורזה כדי להעריך את גודל השבר של הכרומטין. כדי לייעל, ההומוגניזציה בוצעה במשך 15 שניות או 45 שניות בשתי מהירויות, 18, 000 ו-22,000 סל"ד.

בכל התנאים, ניתן היה להפריד גרעינים מפסולת הרקמה, אך התשואה הייתה אופטימלית באמצעות מהירות נמוכה יותר. ניתן להכין גרעינים גם על ידי ניתוק במשך שלוש עד חמש דקות. אבל הומוגניזציה מכנית היא שיטת הבחירה שכן ניתן להשיג תשואות אופטימליות של גרעינים תוך 15 שניות בלבד, מה שמאפשר רווח חשוב של זמן, במיוחד אם יש צורך לעבד מספר דגימות.

באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לבודד עד 2.7 כפול 10 לשבעת הגרעינים מ-500 מיליגרם של רקמה כדי לייצר 100 מיקרוגרם כרומטין. כרומטין המוכן בדרך זו נותן תוצאות נקיות ואיכותיות בניסויי ריצוף ChIP. כפי שמודגם על ידי הרמות הגבוהות של K27 אצטיל של היסטון H3 ו-RNA פולימראז 2 בלוקוס דזמונד המתבטא בשריר.

הספציפיות של סיבי השריר מוצגת על ידי אות נמוך או נעדר במיקומי Pecam1 ו-Vcam1 שאינם באים לידי ביטוי בשריר. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לטבול כראוי את בדיקת ההומוגנייזר בדגימה כדי למנוע הקצפה, לנקות את הגשושית בין הדגימות ולייעל את פיצול הכרומטין. כרומטין שהוכן בדרך זו שימש בהצלחה למען ChIP למיפוי תפוסת גורמי שעתוק ברחבי הגנום ואמור להתאים גם לטכניקות לכידת אישור כרומטין.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך למחקר בתחום הגנומיקה, לחקר ויסות גנים בשרירי השלד מעכברים. ניתן ליישם את ההליך גם על שרירים מחולדה וביופסיות מחולים אנושיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בהומוגניזציה מכנית, ואחריו טיהור של גרעינים קבועים בפורמלדהיד להכנת כרומטין משריר השלד למשקעים חיסוניים.

אל תשכח שעבודה עם פורמלדהיד, פנול, כלורופורם ופרוטאינאז K עלולה להיות מסוכנת. יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות ומשקפיים. יש לבצע שלבים הכוללים ריאגנטים אלה מתחת למכסה המנוע.