Question 1

מהי פרגמנטציה של DNA וכיצד היא מתרחשת במהלך אפופטוזיס?

Accepted Answer

פרגמנטציה של DNA היא סימן היכר של אפופטוזיס, שבו DNA כרומוזומלי נחתך למקטעים בעלי קצוות פתוחים (nicked ends). קספזים, אנזימים הנמצאים בציטוזול, מפעילים את ה-DNase המופעל על ידי קספז (CAD) באמצעות הסרת המעכב שלו. CAD מופעל נוד אל הגרעין וחותך את ה-DNA הכרומוזומלי, ובכך יוצר מקטעים שנצברים ומסמנים את מות התא.

Question 2

כיצד בדיקת TUNEL מזהה תאים אפופטוטיים?

Accepted Answer

בדיקת TUNEL מסמנת באופן פלורסצנטי קצוות של DNA חתוך בתאים אפופטוטיים. האנזים terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) מקטליז את חיבורם של נוקלאוטידי deoxyuridine triphosphate (dUTP) המסומנים פלורסצנטית לקבוצות הידרוקסיל 3' חופשיות ב-DNA מפוצל. תהליך זה יוצר תאים חיוביים ל-TUNEL הנראים תחת מיקרוסקופ פלורסצנציה.

Question 3

מהם השלבים העיקריים בביצוע בדיקת TUNEL על חתכי רקמה?

Accepted Answer

פרוטוקול בדיקת ה-TUNEL כולל קיבוע רקמה באמצעות 4% פאראפורמאלדהיד, חיתוך קריוסטטי לפרוסות בעובי 10 µm, פרמיאביליזציה באמצעות Proteinase K, הוספת אנזים TdT ו-dUTPs מסומנים, דגירה למשך 1-3 שעות ב-37°C, עצירת התגובה באמצעות באפר עצירה (stop buffer), והדמיה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

Question 4

מדוע נדרשת חדירות רקמה (permeabilization) לפני הוספת ריאגנטים של TUNEL?

Accepted Answer

פרמיביליזציה (Permeabilization) מאפשרת לרכיבי ה-TUNEL, ובמיוחד לאנזים ה-TdT, לחדור לגרעין התא ולהגיע ל-DNA המקוטע. טיפול ב-Proteinase K למשך 5–15 דקות ב-37°C יוצר נקבים בממברנות התאים, ובכך מאפשר לאנזים להגיע לסובסטרט שלו בתוך הגרעין.

Question 5

כיצד יכולים חוקרים להשתמש בצביעת TUNEL כדי לחקור אפופטוזיס במחלות?

Accepted Answer

חוקרים מיישמים צביעת TUNEL כדי לבחון אפופטוזיס בהקשרים של מחלות שונות. לדוגמה, מדענים משתמשים בשיטה זו כדי להעריך את תגובת הגידול לתרופות, באמצעות טיפול בדגימות של גידולים אנושיים בתרכובות ניסיוניות ומדידה של עלייה באפופטוזיס. צביעת TUNEL מכמתת את מוות התאים על ידי ספירת אחוז התאים החיוביים ל-TUNEL בחתכי רקמה.

Question 6

מהו התפקיד של קספאזים (caspases) ביזום פרגמנטציה של ה-DNA?

Accepted Answer

קספזים (Caspases) הם אנזימים פרוטאוליטיים הנמצאים בציטזול, המבצעים אפופטוזיס באמצעות ביקוע חלבונים תאיים. הם מפעילים את ה-DNase המופעל על ידי קספז (CAD) על ידי ניתוקו מהמעכב שלו, ICAD. לאחר הפעלתו, ה-CAD חודר לגרעין ומבקיע את ה-DNA הכרומוזומלי, ובכך מייצר את ה-DNA המגומם שאתה מזהים בבדיקות TUNEL.

Question 7

על מה מעידה צביעה חיובית בבדיקת TUNEL לגבי תאים בדגימה של רקמה?

Accepted Answer

תאים חיוביים ל-TUNEL נמצאים בתהליך אפופטוזיס ומכילים DNA מקוטע עם קצוות פתוחים המסומנים על ידי dUTP פלואורסצנטי. תאים אלו נראים פלואורסצנטיים תחת מיקרוסקופ ומעידים על מוות תאי מתוכנן. ספירה של תאים חיוביים ל-TUNEL מספקת מדד כמותי של האפופטוזיס המתרחש בחתך רקמה.

אסיי המנגינה - חידון הערכה