Name: בידוד של בלוטות מוגדלות ללא פגע, כל עכבר לניתוח של בלוטת מורפולוגיה וביטוי מטריצה חוץ-תאית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: למדו לבודד בלוטות חלב שלמות מעכברות ללא פגע לניתוח מורפולוגי וביטוי חלבוני מטריצה חוץ-תאית. שיטה זו מאפשרת חקר אדריכלות צינורית וקולגן בבלוטות בריאות וחולות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצה להכיר אפריל וויילס, ד ר רוג'ר Broderson לקבלת סיוע עם necropsy בעלי חיים ובידוד בלוטת, בהתאמה. מימון עבור עבודה זו נתמכה על ידי המרכזים פילדלפיה המכללה לרפואה אוסטאופתי עבור כרונית בהפרעות של הזדקנות.

הליכים הכוללים נושאים בעלי חיים פרוטוקול זה היו נבדקו ואושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה של פילדלפיה אוסטאופתי לרפואה ואת כל הטכניקות נערכו תחת קפדנית מנחים.
 1. רכש דגימת ועיבוד <ol><li>בחר נושא בעלי חיים המתאימים ומקום לתא 2 CO. עבור ניסוי זה, השתמש בשבוע 8-10 הישן B6 nulliparous הנשי. Cg-Cav1tmMIs/J ו- C57BI/6J.</li>
	<li>הפעל זרימת הגז ל- 30-40%. לאחר החיה בעליל הכרה לאחר כ- 2 דקות, לפתוח את השסתום גז בלחץ מלא עבור 5 דק נוספות 
	הערה: אשר המוות בבעלי חיים על ידי התבוננות סימנים גלויים של נשימה (למשל תנועת החזה) לתקופה של 10 דקות לאחר הפסקת משלוח 2 CO. אם החיה עדיין בחיים, אפשר למקם אותו בחזרה בבית הבליעה 2 CO. נקע בצוואר הרחם עשוי לשמש גם למרות שזה לא מומלץ כי דם עלולים להצטבר סביב בלוטות החלב מתנגש עם דיסקציה של תוצאות.</li>
	<li>בעקבות הקרבה, להצמיד את השלד במצב פרקדן, עיתוני עם אתנול 70%-</li>
	<li>לצבוט את פלט מעל לחיקו באמצעות מלקחיים, ניק עם מספריים כירורגיים קטנים. סיבוב את המספריים, לחתוך הפרווה לאורך הקו האמצעי הגחון נע סימטרית הגולגולת.</li>
	<li>עם מספריים גדולים יותר או עוצר דימום, בוטה לנתח fascia תת עורית דו צדדיים, באמצעות התראה לא ל פנצ׳ר של הצפק. חתך לאורך השוליים האופקיים בשני קצותיו דיסטלי של החתך.</li>
	<li>Pin הפרווה מדפים פתח, לרסס שוב עם אתנול 70%- 
	הערה: למרות השימוש של 70% אתנול מותרת יותר ויזואלי ההבחנה בין בלוטת הרקמה התת עורית שמסביב, להיות זהירים כדי למנוע ייבוש של הרקמה כתוצאה של פתרון זה. כדי למנוע ייבוש, להסיר את בלוטת בתוך מסגרת זמן שלא יעלה על 4 דקות. כחלופה 70% אתנול, החוקר גם להחליף מאגר ולבודד כלליות, כגון 1 x PBS, כדי להימנע לייבוש רקמות.</li>
	<li>באיתור בלוטות החלב של עניין, שקופית להב סכין #4 לאורך החלק הפנימי של המשק פלט, חותכים את בלוטת חלב ואת עורית של אדיפוז המשויך חינם של הדרמיס. 
	הערה: 3.5 x זכוכיות מגדלת מיקרו כירורגי עשויים לסייע ויזואליזציה קל יותר של הבלוטות.</li>
	<li>מיד להטביע בלוטת לאחרונה מבודד צינור חרוטי המכילים 10:1 פתרון-רקמת אחסון של 10% פורמלין במאגר נייטרלי במשך 24-48 ה 
	הערה: הכוונה של המחקר, כתות ומייצבים אלטרנטיביים רבים עשוי לשמש בהתאם כגון paraformaldehyde, אתנול גנומית מחקרים, RNA זמינים מסחרית שמירה על מאגרי.</li>
	<li>בצע פרוטוקולים מוסדיים להטבעת פרפין, לשלוח דוגמאות ליצרן לעיבוד, הטבעה, ושקופית חותך/הרכבה. בסעיף רקמות-5 מיקרומטר. 
	הערה: עקב עודף אדיפוז בלוטת שמסביב, לשקול הסרת מיקרומטר 100-200 של רקמות לפני חלוקתה, מכתים.</li>
</ol> 2. רקמת Staining <ol><li>אימונוהיסטוכימיה <ol><li>המקום שקופיות כדי להיות מוכתם בבלוק חום שוכן בגובה 58 הלעפה תרוטרפמט עבור h 1 להמיס פרפין. 
		התראה: התכה פרפין עשויה לפעול מחוץ לשקופית. לפקח מקרוב או להציב מנגב תחת שקופיות כדי ללכוד נגר שעווה. 
		הערה: שלב זה לא הכרחי, אולי ניתן לדלג. ואם התוצאות לא כמצופה, הוספת הזה צעד אחורה עשוי לשפר את התוצאות.</li>
		<li>Incubate השקופיות שקופית ג'אר קסילן המכיל 100% למשך 30 דקות הבטחת צלילה מלאה. אני חוזר פעם. 
		הערה: בשלב זה, בדיקה ויזואלית צריכה להתבצע כדי להבטיח כי קטעי רקמה חופשית של רקמת שומן, פרפין. אם רקמת שומן נוספים או שעווה ניכרת, השקופית צריך להיות מחדש שקועים קסילן. שימוש באזהרה כדי למזער חשיפה נוספת קסילן כמו זה יכול לגרום התכווצות של הרקמות.</li>
		<li>נוזלים ברקמות בצנצנת השקופית המכילה 100% אתנול במשך 10 דקות חוזר פעם.</li>
		<li>להעביר את השקופיות צנצנת השקופית שמכילה אתנול 95% במשך 10 דקות חוזר פעם.</li>
		<li>להעביר את השקופיות שקופיות צנצנת המכילה 75% אתנול עבור 5 דק.</li>
		<li>להעביר את השקופיות שקופיות צנצנת המכילה 50% אתנול עבור 5 דק.</li>
		<li>להרתיח הפתרון סודיום ציטרט 10 מ מ (pH 6.0) צלחת חמה או מיקרוגל ויוצקים לתוך צנצנת Coplin. 
		התראה: לפקח על פתרון תוך חימום ובזהירות לטפל כדי למנוע לרתיחה מעל. מיכל יהיה חם מאוד. השימוש הגנה כדי למנוע כוויות.</li>
		<li>לאט המקום מגלשות לתוך Coplin צנצנת, הבטחת צלילה מלא, ו דגירה ב 100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לאחזר epitopes. הסר ויבשה בקפידה שקופיות.</li>
		<li>צייר מחסום מסביב רקמות עם סמן הידרופובי. הוסף מספיק אנזים אנדוגני חוסמי (מימן על-חמצני, אזיד הנתרן, זמינים מסחרית) לכסות את רקמות, תקופת דגירה של 10 דקות</li>
		<li>השקופיות Submerge פוספט x 1 buffered תמיסת מלח (PBS) במשך 10 דקות</li>
		<li>להוסיף סרום מספיק חמור 10% ב- PBS 1 x כדי לכסות את רקמת תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר בתוך תא humidified. 
		הערה: הניסוי ניתן להשהות כאן על-ידי אחסון השקופיות בבית הבליעה humidified ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. בזמן חמור בסרום נמצאה להניב תוצאות אופטימליות מוכתמים, ייתכן החוקר רוצה לבדוק סרה שונים כגון אלבומין שור (BSA), סרום עז או סרום סוס כדי לקבוע תוצאות אופטימליות. אם משתמש BSA, החוקר צריך להכין טרי זה לפני השימוש.</li>
		<li>Decant חוסם עודף משקופיות ולהוסיף נוגדן ראשוני כראוי מדולל בנסיוב 1% ישירות על השקופיות להבטיח כי הרקמה באופן שווה מכוסה פתרון. תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר בתוך תא humidified. 
		הערה: שלב זה עשוי להיות המשך עבור משכי זמן ארוכים עם לח תא המאוחסנים ב-4 ° C. הקפידו לכלול שקופיות שליטה שלילי (כגון שקופית עם אין נוגדן ראשוני, ידוע רקמות אנטיגן-שלילי, וכו ') בשלב זה.</li>
		<li>לשטוף את השקופיות מאת זורם בערך 1 מ"ל של לשכפל 2 O על רקמות ובזהירות דגירה בשינוי 1 ל- PBS x 1 עבור 5 דק.</li>
		<li>Decant PBS עודף ולהוסיף תווית peroxidase מספיק חזרת כדי לכסות את רקמת תקופת דגירה של 30 דקות בתוך תא humidified. 
		הערה: בשלב זה, החוקר הרוצים להמשיך פלורסנט מכתים באמצעות נוגדנים משניים fluorescently מצומדת. אם זה רצוי, השלבים הבאים תיאר צריך להיות שונה בהתאם.</li>
		<li>לשטוף את השקופיות מאת זורם בערך 1 מ"ל של לשכפל 2 O על רקמות ובזהירות דגירה בשינוי 1 ל- PBS x 1 עבור 5 דק.</li>
		<li>להפוך diaminobenzidine (DAB) פלוס chromogen פתרון על פי היחס המוצע היצרן ומערבבים על ידי מערבולת. 
		הערה: הרבה ערכות מוכנות מראש הם זמינים מסחרית מלבד שימוש בפרוטוקול זה.</li>
		<li>Decant עודף מאגר משקופיות ולהוסיף 2-3 טיפות (10-50 µL) של chromogen כתם ישירות לרקמות ו תקופת דגירה של 5 דקות בחדר לחים. בזהירות משתלטת השקופיות על-ידי זורמים כ 1 mL לשכפל 2 O רקמות. 
		התראה: DAB-chromogen הוא רעיל מאוד. להימנע ממגע ישיר של כתם בתזרים העור ומסייעים לאסוף את-פסולת מסוכנת.</li>
	</ol></li> <li>Hematoxylin ואאוזין (H &#38; E) <ol><li>לאחר השטיפה הסופית לאחר דגירה chromogen, להטביע שקופיות ב hematoxylin האריס עבור 2-2.5 דקות שקופיות יש לשטוף בעדינות תחת ברז מים במשך 1-2 דקות 
		הערה: לטפל כדי למנוע סילון ישירה של מים על גבי רקמות.</li>
		<li>Submerge שקופיות עבור 2-3 s בפתרון בידול (0.25 מ"ל חומצה הידרוכלורית 100 מ של 70% אתנול). לשטוף את השקופיות בעדינות תחת ברז מים במשך כ- 1-2 דקות</li>
		<li>להטביע שקופיות בסוכן כחול (4.5 מ"ג סידן פחמתי ב- 100 מ ל מי ברז, pH להתאים ל- 9.4) עבור שקופיות שטיפה ס' 60 ב 95% אתנול ל 30 ס</li>
		<li>השקופיות Submerge אלכוהוליים אאוזין Y עבור 2-3 דקות</li>
		<li>מייבשים רקמות 2 שינויים של אתנול 95% 1 דקות.</li>
		<li>רקמת Dehydrate 1 שינוי של אתנול 100% עבור מינימלית 1</li>
		<li>יבש בזהירות שקופיות עם מגבון נטולת מוך. החלת טיפה 1 (כ 100-200 µL) של סינתטיים, הלא-מימית, שרף המבוססת על טעינת מדיה שקופית ולהחיל coverslip. 
		הערה: אם נבחר מכתימים שיטה שונה, באמצעי התקשורת הרכבה שונים עשוי להידרש. למשל, אם החוקר בוחר נוגדנים משניים מצומדת פלורסנט, הר מימית יהיה יותר אידיאלי.</li>
		<li>לאפשר שקופיות להגדיר ללילה בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol></li> <li>Staining Picrosirius אדום (הפי) <ol><li>בחר שקופיות כדי להיות מוכתם ופעל אימונוהיסטוכימיה פרוטוקול דרך שלב 6 (50% אתנול להשרות).</li>
		<li>השקופיות Submerge הפי כתם על ה' 1</li>
		<li>להטביע שקופיות ב- 0.5% חומצה אצטית עבור s 1-2, פעמיים כדי להבדיל בין הכתם.</li>
		<li>מייבשים רקמות 2 שינויים של אתנול 95% 1 דקות.</li>
		<li>רקמות Dehydrate 1 שינוי של אתנול 100% עבור מינימלית 1</li>
		<li>ברור שקופיות על ידי בקצרה השוקע ב- 100% קסילן עבור ס' 3-4</li>
		<li>יבש בזהירות שקופיות עם מגבון נטולת מוך. החלת טיפה 1 (כ 100-200 µL) של סינתטיים, הלא-מימית, שרף המבוססת על טעינת מדיה שקופית ולהחיל coverslip.</li>
	</ol></li></ol> 3. לטעום ניתוח <ol><li>ניתוח Ductal <ol><li>בחר שקופיות צבעונית עבור α-SMA. באמצעות מיקרוסקופ אור מצויד יעד רכוב מצלמה, לאסוף להחליפן בתמונות בהגדלה X 20-</li>
		<li>שימוש ImageJ (NIH), להבדיל ולספור צינורות לכל תמונה. אלה יכולים להיות ספירה ידנית או אחד יכולות להקצות תוצאה מספרית צינורות בודדים. כדי להקצות תוצאה מספרית, פתח ImageJ ובחר תוספים. לאחר מכן בחרו נתח ובחרו מונה תא מתוך התפריט הנפתח. לחץ על אתחל ולאחר מכן לסמן את סוג 1 כדי להתחיל תיוג צינוריות. בסיום, בחר תוצאות כדי להציג את הספירה ductal. 
		הערה: לטפל כדי לוודא מבנים הם ductal ואת כלי הדם לא.</li>
		<li>ב &#39; מדידה להגדיר &#39; אופציות, בדוק &#39; היקפית &#39; ו- &#39; אזור &#34;.</li>
		<li>בעזרת הכלי מצולע ביד חופשית, לצייר קו סביב כל צינור-תא myoepithelial (ראות שנעזר α-SMA כתם). בחר &#39; מידה &#39; ולהקליט את ההיקף ואת אזור.</li>
		<li>שוב בעזרת הכלי מצולע ביד חופשית, לצייר קו לאורך הצד הפסגה של האפיתל ductal בתוך החלק הפנימי של לומן. בחר &#39; מידה &#39; ולהקליט את ההיקף ואת אזור.</li>
		<li>להחסיר את ההיקף של תא luminal מן ההיקף של תא myoepithelial על מנת לקבל את היקף ductal האפיתל. להחסיר את האזור של תא luminal מהאזור של תא myoepithelial כדי להשיג את האזור של האפיתל ductal.</li>
	</ol></li> <li>אימונוהיסטוכימיה ניתוח <ol><li>להעלות תמונות brightfield תוכנה אנליטית, כגון ImageJ או סוויטה פיג'י. 
		הערה: פרוטוקול זה מתאר את השלבים עבור צביעת ניתוח באמצעות ImageJ והתוסף בארגז הכלים IHC.</li>
		<li>לפתוח את ארגז הכלים IHC ' מתפריט ' תוסף. ב &#34; בחר דגם &#34; תיבה משולבת שנפתח, בחר הכתם המתאים (קרי H-DAB, הפי, וכדומה). בחר &#34; צבע &#34; אפשרות לבודד את הכתם. פעולה זו תפתח חלון התוצאה. 
		הערה: שיטה זו מתאימה, אם חלבון עניין ממוקם ברווחים חוץ-תאית או cytosolic, או מאוגד קרום פלזמה. אם החלבון עניין הגרעין, בחירת &#34; גרעינים &#34; יבקש את התוסף על מנת לנתח את התמונה עבור גרעין חיובי מוכתם.</li>
		<li>השתמש השקופית בוחר צבע כדי להבטיח בידוד נאות של הכתם ללא רקע הכללה או אי הכללה הכתם מופרז. 
		הערה: אם מצב אוטומטי אינו מסוגל לזהות את הכתם או לא תגרום תמונות מקובל, צייר ריבוע אזור של הריבית (ROI) מעל מזוהה צבעונית באזור. בחלון IHC בארגז הכלים, בחר &#34; הרכבת &#34; לכוון את התוסף המתאים ליעד.</li>
		<li>להמיר את התמונה ל- 16 סיביות. עבור אל התמונה &#8594; סוג &#8594; 16 bit.</li>
		<li>סף התמונה. עבור אל התמונה &#8594; להתאים את &#8594; אוטומטי הסף.</li>
		<li>קבע את קנה המידה של התמונה על ידי ציור קו רועי ישירות מעל הבאר סולם בתמונה מכן הקצאת האורך. כדי להגדיר את סרגל קנה מידה, ללכת ניתוח &#8594; לקבוע קנה מידה- קלט מספר פיקסלים לכל יחידת הרצויה אורך (למשל 120 פיקסלים לכל 50 מיקרומטר).</li>
		<li>למדוד את השטח תוצאות ואני מתכוון ערך אפור. ללכת נתח &#8594; להגדיר מידות לאסוף את המדידה על-ידי לחיצה על ניתוח &#8594; מידה.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Gao-Feng Xiong, R. X. <a target="_blank" href="http://jcmtjournal.com/article/view/1713">Function of cancer cell-derived extracellular matrix in tumor progression.</a> J Cancer Metastasis Treat. 2, 357-364 (2016).</li>
<li>Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microenvironment+in+breast+cancer+progression%3A+biology+and+implications+for+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment.</a> Breast Cancer Res. 13 (6), 227(2011).</li>
<li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+reorganization+at+the+tumor-stromal+interface+facilitates+local+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion.</a> BMC Med. 4 (1), 38(2006).</li>
<li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+density+promotes+mammary+tumor+initiation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression.</a> BMC Med. 6, 11(2008).</li>
<li>Cox, T. R., Erler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+and+homeostasis+of+the+extracellular+matrix%3A+implications+for+fibrotic+diseases+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer.</a> Dis Model Mech. 4 (2), 165-178 (2011).</li>
<li>Ioachim, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+expression+of+extracellular+matrix+components+tenascin%2C+fibronectin%2C+collagen+type+IV+and+laminin+in+breast+cancer%3A+their+prognostic+value+and+role+in+tumour+invasion+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical expression of extracellular matrix components tenascin, fibronectin, collagen type IV and laminin in breast cancer: their prognostic value and role in tumour invasion and progression.</a> Eur J Cancer. 38 (18), 2362-2370 (2002).</li>
<li>Barkan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+growth+from+dormant+cells+induced+by+a+col-I-enriched+fibrotic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment.</a> Cancer Res. 70 (14), 5706-5716 (2010).</li>
<li>Levental, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139 (5), 891-906 (2009).</li>
<li>Wang, J. P., Hielscher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin%3A+How+Its+Aberrant+Expression+in+Tumors+May+Improve+Therapeutic+Targeting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Fibronectin: How Its Aberrant Expression in Tumors May Improve Therapeutic Targeting.</a> J Cancer. 8 (4), 674-682 (2017).</li>
<li>Qian, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+tumor%2Fstromal+caveolin-1+expression+in+breast+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of tumor/stromal caveolin-1 expression in breast cancer patients.</a> Cancer Sci. 102 (8), 1590-1596 (2011).</li>
<li>Simpkins, S. A., Hanby, A. M., Holliday, D. L., Speirs, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+functional+significance+of+loss+of+caveolin-1+expression+in+breast+cancer-associated+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Clinical and functional significance of loss of caveolin-1 expression in breast cancer-associated fibroblasts.</a> J Pathol. 227 (4), 490-498 (2012).</li>
<li>Witkiewicz, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+absence+of+stromal+caveolin-1+expression+predicts+early+tumor+recurrence+and+poor+clinical+outcome+in+human+breast+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">An absence of stromal caveolin-1 expression predicts early tumor recurrence and poor clinical outcome in human breast cancers.</a> Am J Pathol. 174 (6), 2023-2034 (2009).</li>
<li>Macias, H., Hinck, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mammary gland development.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (4), 533-557 (2012).</li>
<li>Caligioni, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+reproductive+status%2Fstages+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Assessing reproductive status/stages in mice.</a> Curr Protoc Neurosci. , Appendix 4 Appendix 4I (2009).</li>
<li>Cannata, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+circulating+IGF-I+promotes+mammary+gland+development+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Elevated circulating IGF-I promotes mammary gland development and proliferation.</a> Endocrinology. 151 (12), 5751-5761 (2010).</li>
<li>Thompson, C., Rahim, S., Arnold, J., Hielscher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+caveolin-1+alters+extracellular+matrix+protein+expression+and+ductal+architecture+in+murine+mammary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Loss of caveolin-1 alters extracellular matrix protein expression and ductal architecture in murine mammary glands.</a> PLoS One. 12 (2), 0172067(2017).</li>
<li>Williams, C. M., Engler, A. J., Slone, R. D., Galante, L. L., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+expression+modulates+mammary+epithelial+cell+proliferation+during+acinar+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Fibronectin expression modulates mammary epithelial cell proliferation during acinar differentiation.</a> Cancer Res. 68 (9), 3185-3192 (2008).</li>
<li>Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraductal+injection+for+localized+drug+delivery+to+the+mouse+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland.</a> J Vis Exp. (80), (2013).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

בעיתון תארנו טכניקה כדי לבודד את העכבר ללא פגע בלוטות מוגדלות עבור ניתוחים היסטולוגית במורד הזרם של מורפולוגיה ductal וביטוי ECM. לגבי ניתוחים של מורפולוגיה ductal, מתודולוגיה זו מאפשרת חקירת ארכיטקטורת ductal מבוסס את סעיפים מוכתמים היסטולוגית מהירה. שיטות אחרות של ניתוחים ductal להסתמך על זריקות של צבעים כדי לאפשר ויזואליזציה של העץ ductal, שיטות אשר עשוי להיות טכנית מאתגר וצורכת זמן.
בסרטן השד, דווח על ECM להיות חריג. 1 , 2 ,</...

סרטן השד מאופיין על ידי מידה ניכרת של רקמות פיברוזיס1,2,3,4. מכונה ECM, הישות-סלולר זו הוא נמצא בדרגות ברקמות כל, מורכבת בעיקר meshwork מורכבים של collagens fibrillar ו- fibrillar, אלסטין glycoproteins בנוסף מולקולות איתות שונים כי הם רע מטריצה זו. בתנאים homeostatic, התצהיר והשפלות של ECM מפוקחת. 5 במהלך tumorigenesis השד, האיזון של התצהיר ECM והשפלה משובשת. ככזה, גידולים בשד דווחו לבטא שופע ECM חלבונים כגון collagens, fibronectin, tenascin-C בין השאר. 6 הביטוי לא תקין של חלבונים אלה בנוסף דפוסים מוגברת של מטריקס crosslinking תועד כדי לקדם את השד הגידול התקדמות, גרורות, טיפול ההתנגדות1,3, 4,-7,-8,-9.
כדי להעריך הרכב ECM ו מורפולוגיה ductal, בוצע בידוד של בלוטות מוגדלות ללא פגע. כאן, אנחנו המשמש עכברים nulliparous נקבה לקויה caveolin-1, חלבון ממברנלי אינטגרלי אשר נקשר אגרסיבי השד הגידול החתימה10,11,12, שליטה נשית B6 nulliparous עכברים. צביעה של רקמות אלה ועיבוד היסטולוגית מותר זיהוי חלבונים שונים ECM עם אפיון ductal מורפולוגיה.
בסך הכל, בידודו של בלוטות מוגדלות שלם, שלם נותן חוקרים ההזדמנות לחקור את רקמת מורפולוגיים או הסלולר שינויים המתרחשים כתגובה גורמים אקסוגניים או אנדוגני. החסרונות של הטכניקה משויכות ניתוחים של 2 סעיפים רקמות מימד (2D) לעומת מבט תלת-ממד, אשר יניב תמונה שלמה יותר של המורפולוגיה מורכבים של העץ ductal. לאור המורכבות של אינטראקציות תא התא, התא-ECM המתרחשים בבלוטת החלב, בידודו של בלוטות שלם, תקין יש יתרון לניתוח ביעילות ductal מורפולוגיה וחלבונים ביטוי באזורים שונים מאתר החלב בלוטת.

<table><tbody><tr><td>מיקרוסקופ אור</td><td>אולימפוס</td><td>BX43</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ מצלמה</td><td>אולימפוס</td><td>DP73</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח תמונה</td><td>Olympus</td><td>cellSens תוכנת</td><td></td></tr><tr><td></td> כניסה <td>NIH</td><td>ImageJ</td><td></td></tr><tr><td>3.5x-R כירורגי מיקרו זכוכית</td> רוז <td>מיקרו פתרונות</td><td></td><td>הגדלה לפי העדפת החוקר</td></tr><tr><td>מאיו מספריים</td><td>Medline</td><td>DYND04035</td><td></td></tr><tr><td>מתלה מכתים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>121</td><td></td></tr><tr><td>צלחת מכתים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>112</td><td></td></tr><tr><td>צנצנות קופלין</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>19-4</td><td></td></tr><tr><td>כיסויי זכוכית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-550-15</td><td>גודל מתאים לרקמות</td></tr><tr><td>ערכת IHC EnVision+ (HRP, עכבר, DAB+)</td> <td>Dako</td><td>K400611-2</td><td></td></tr><tr><td>Picrosirius Red Kit</td><td>Abcam</td><td>AB150681</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y, אלכוהולי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>HT110132</td><td></td></tr><tr><td>האריס המטוקסילין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>HHS16</td><td></td></tr><tr><td>סרום חמור</td><td>EMD Millipore</td><td>S30</td><td></td></tr><tr><td>10% ניטרלי בופר פורמלין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Xylenes, אתנול</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214736</td><td></td>בדרגת ריאגנט</tr><tr><td>, 200 הוכחה</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792780</td><td>מתאים לביולוגיה מולקולרית</td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח, 1x</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ציטראט</td><td>Fisher Scientific</td><td>S279-500</td><td></td></tr><tr><td>סידן פחמתי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>202932</td><td></td></tr><tr><td>קבוע הרכבה בינונית</td><td>Dako</td><td>S1964</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt's הרכבה בינונית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>3989</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן פיברונקטין</td><td>Abcam</td><td>AB23750</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן Tenascin-C</td><td>Abcam</td><td>AB108930</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן אקטין שריר חלק אלפא</td><td>Abcam</td><td>AB124964</td><td></td></tr><tr><td>Dako Envision Dual Link System HRP</td><td>Dako</td><td>K4065</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד של בלוטות מוגדלות ללא פגע, כל עכבר לניתוח של בלוטת מורפולוגיה וביטוי מטריצה חוץ-תאית

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

המטרה של הליך זה היה כדי לקצור #4 בטן בלוטות מוגדלות של עכברים nulliparous הנשי כדי להעריך ביטוי ECM ואדריכלות ductal. . הנה, כיס קטן מתחת לעור נוצר באמצעות מספריים מאיו, ומאפשר פרידתה של הבלוטות בתוך רקמת השומן התת עורית הצפק המשמש כבסיס. ויזואליזציה של הבלוטות נעזרה השימוש 3.5 x-R זכוכיות מגדלת מיקרו כירורגי. הפרווה היה. הפוך, נצמיד המאפשר זיהוי של הידיות שומן החלב ללא פגע. אחד של בלוטות בטן #4 היה בוטה מבותרים על-ידי הזזה הלהב האזמל רוחבית בין השכבה התת עורית הבלוטות. מיד לאחר הקציר, בלוטות הונחו בפורמלין במאגר נייטרלי 10% עבור עיבוד רקמות עוקבות. כריתה של בלוטת כולו הוא יתרון, כי זה בעיקר מבטלת את הסיכון של אי-כלילת חשוב רקמות ברוחב אינטראקציה בין תאים אפיתל ductal אוכלוסיות אחרות microenvironmental הסלולר שלא יכול להיות בביופסיה חלקית. חסרון אחד של המתודולוגיה הוא השימוש סעיפים טורי רקמות קבוע אשר מגביל את ניתוח של הביטוי מורפוגנזה וחלבון ductal במיקומים נפרדים בתוך בלוטת. ככזה, שינויים בביטוי חלבונים ואדריכלות ductal 3 מימד (3D) אינה השגה בקלות. בסך הכל, הטכניקה ישימה ללימודים הדורשים עטין מאתר שלם כל החקירות במורד הזרם כגון התפתחותית ductal מורפוגנזה או השד סרטן.

עכברים נקבה יש 5 זוגות של בלוטות מוגדלות. באופן ספציפי, יש זוג אחד של בלוטות צוואר הרחם (#1), שני זוגות של בלוטות בית החזה (#2 ו- #3), זוג אחד של בטן בלוטות (#4), 1 זוג בלוטות במפשעה (מס ' 5) (איור 1א'). כאן, אנחנו מבודדים הבלוטות #4 כפי שהם לזיהוי בקלות. בנסיבות מסוימות, #4 והן #5 בלוטות היו מבודדים ביחד ההבחנה בין השניים היה קשה. כדי לבודד שלם #4 בטן בלוטות מוגדלות, הפרווה מוצמדים, הופרדו בקפידה הצפק הבסיסית, את המיקום של הבלוטות #4 מסומנים...

כאן, אנו מציגים עבור בידודו של שלמה, שלמה עכבר פרוטוקול עטין לחקור מורפולוגיה ductal וביטוי מטריצה חוץ-תאית (ECM). בלוטות בטן העכבר #4 היו מופק עכברים nulliparous נקבה שבוע 8-10, קבוע בפורמלין במאגר נייטרלי, למחלקה והמוכתמות בעזרת אימונוהיסטוכימיה ECM חלבונים.

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

המטרה הכוללת של טכניקת קצירת בלוטות חלב שלמה זו היא להקל על ניתוח ההצגה ההיסטולוגית של רקמת חלב מבלוטה שלמה ex-vivo. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הגידול, כגון כיצד רקמת סטרומה מעוצבת מחדש בגידולים או כיצד ביטוי חריג של גנים או חלבונים משנים את ארכיטקטורת צינורות החלב. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת לחוקרים את היכולת לאפיין ולכמת את ביטוי החלבון ואת הארכיטקטורה הצינורית בבלוטות החלב השלמות של עכברים בריאים וחולים.מי שידגים את הטכניקה הזו יהיה כריס תומפסון, סטודנט לתואר שני במעבדה שלי. לאחר הקרבת עכברים נקבות בנות שמונה עד 10 שבועות על פי פרוטוקול הטקסט, הצמידו את הפגר למצב שכיבה והשתמשו באתנול 70% כדי להרוות אותו. השתמש במלקחיים כדי לצבוט את הפרווה ממש מעל הערווה, וחתך אותה במספריים כירורגיות קטנות.לאחר מכן, מסובבים את המספריים, חותכים את הפרווה לאורך קו האמצע הגחוני, ומעבירים את הזנב לגולגולת. בעזרת מספריים גדולים יותר או המוסטט, נתחו בצורה בוטה את הפאשיה התת עורית באופן דו צדדי, תוך היזהרות לא לנקב את הצפק. חותכים לאורך השוליים האופקיים בשני הקצוות הדיסטליים של החתך.לאחר מכן, הצמידו את דשי הפרווה ורססו את הטישו ב-PBS כדי לשמור על לחותה. לאחר מכן, איתור בלוטות החלב המעניינות, החלק להב אזמל לאורך החלק הפנימי של דשי הפרווה, חותך את בלוטת החלב והשומן התת עורי הקשור ללא הדרמיס. לפני הפרדת בלוטת הבטן מהמפשעה, יש להקפיד לזהות את הבלוטות בצורה ברורה ככל האפשר.טבלו מיד את הבלוטה המבודדת החדשה בצינור חרוטי המכיל כשישה מיליליטר של תמיסה של 10 לאחד לנפח רקמה של 10% פורמלין ניטרלי, ודגרו אותה למשך 24 עד 48 שעות. לאחר המסת הפרפין מהשקופיות ולחות מחדש של הפרוסות בהתאם לפרוטוקול הטקסט, הרתיחו תמיסת נתרן ציטראט של 10 מילי-מולרית על פלטה חמה או במיקרוגל ושפכו את התמיסה לצנצנת קופלין. הכניסו לאט את המגלשות לצנצנת קופלין, הבטיחו טבילה מוחלטת, ודגרו את המגלשות בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לאחזר אפיטופים.לאחר מכן, הסר וייבש בזהירות את השקופיות. לאחר מכן, ציירו מחסום סביב הרקמה בעזרת סמן הידרופובי. לאחר שהתייבש, שטפו את השקופיות עם PBS למשך שנייה עד שתיים.לאחר מכן, הוסיפו מספיק חוסם אנזימים אנדוגני כדי לכסות את הרקמה, ודגרו על המגלשות למשך 10 דקות. טבלו את השקופיות ב-1X PBS למשך 10 דקות. לאחר מכן, הוסיפו מספיק סרום חמור 10% ו-PBS כדי לכסות את הרקמה, ודגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר בתא לח למשך שעה.הסר חוסם עודף מהמגלשות והוסף נוגדן ראשוני מדולל כראוי בסרום של 1% ישירות לשקופיות, כדי להבטיח שהרקמה מכוסה באופן שווה בתמיסה. דגרו את המגלשות בטמפרטורת החדר בתא לח למשך 30 דקות. שטפו בזהירות את המגלשות על ידי הזרמת כמיליליטר אחד של מים נטולי יונים על הרקמה, ולאחר מכן דגרו את המגלשות בשינוי אחד של 1X PBS למשך חמש דקות.יש לרוקן את עודפי ה-PBS ולהוסיף מספיק נוגדן משני מצומד חזרת פרוקסידאז, ולדגור את הדגימות בתא לח למשך 30 דקות. שטפו בזהירות את המגלשות על ידי הזרמת כמיליליטר אחד של מים נטולי יונים על הרקמה, ודגרו את הרקמה בשינוי אחד של 1X PBS למשך חמש דקות כמו קודם. לאחר הכנת תמיסת DAB בתוספת כרומוגן, יש לשפוך את המאגר העודף מהשקופיות ולהוסיף שתיים עד שלוש טיפות של כתם כרומוגני ישירות לרקמה.דגרו את הדגימות בתא לח למשך חמש דקות. לאחר מכן, שטפו בזהירות את המגלשות על ידי הזרמת כמיליליטר אחד של מים נטולי יונים על הרקמה. לאחר שטיפה אחרונה לאחר הדגירה הכרומוגן, טבלו את השקופיות בהמטוקסילין האריס למשך שתיים-שתיים וחצי דקות.לאחר מכן, שטפו בעדינות את המגלשות מתחת למי ברז למשך דקה עד שתיים. טבלו את השקופיות בפתרון ההבדלים למשך שתיים עד שלוש שניות. לאחר מכן, שטפו בעדינות את המגלשות מתחת למי ברז למשך כדקה עד שתיים.טבלו את השקופיות בחומר כחול למשך 60 שניות. לאחר מכן, שטפו את השקופיות באתנול 95% למשך 30 שניות. העבירו את השקופיות לאאוזין Y אלכוהולי למשך שתיים-שלוש דקות לפני ייבוש הרקמה בשני שינויים של 95% אתנול למשך דקה אחת כל אחד.לאחר מכן, לבסוף, יש לייבש את הרקמה פעם אחת ב-100% אתנול למשך דקה אחת. יבש בזהירות את השקופיות עם מגבון נטול מוך. לאחר מכן, מרחו טיפה אחת של מדיום הרכבה סינטטי שאינו מבוסס שרף על המגלשה ומרחו החלקת כיסוי.כדי לבצע ניתוח צינורות, בחר שקופיות מוכתמות עבור אלפא SMA. לאחר מכן, באמצעות מיקרוסקופ אור המצויד במטרה המותקנת במצלמה, אסוף תמונות מייצגות בהגדלה של פי 20. כדי לספור צינורות בכל תמונה, ספרו אותם ידנית או פתחו את ImageJ ובחרו תוספים.לאחר מכן, בחר נתח, ומהתפריט הנפתח, בחר את מונה התאים. לחץ על אתחול ולאחר מכן סמן את הקלד אחד כדי להתחיל בהוספת תוויות לתעלות תווית. בסיום, בחר תוצאות כדי להציג את ספירת הצינורות.התחילו בציור קו מעל סרגל קנה המידה של התמונה בעזרת הכלי קו. לאחר מכן, לחץ על נתח והגדר קנה מידה. בחלון הבא, הקלד את המרחק במרחק הידוע ואת היחידות ביחידת אורך.לאחר מכן, לחץ על אישור. לאחר מכן, באפשרויות מדידה מוגדרות, בדוק שטח והיקף. לאחר מכן, בעזרת כלי המצולע ביד חופשית, צייר קו סביב כל צינור בתא האפיתל.בחר מדידה ורשום את ההיקף והשטח. השתמש שוב בכלי המצולע ביד חופשית, צייר קו לאורך הצד האפיקלי של אפיתל הצינור בתוך החלק הפנימי של הלומן. לאחר מכן, בחר מדידה ורשום את ההיקף והשטח.הפחיתו את שטח תא הלומנל מאזור תא השריר כדי להשיג את שטח אפיתל הצינור. הפחיתו את היקף תא הלומנל מהיקף תא השריר כדי להשיג את היקף אפיתל הצינור. כדי לבצע ניתוח אימונוהיסטוכימי, העלה תמונות שדה בהיר לתוכנה אנליטית, כגון ImageJ או Fiji Suite.באמצעות תפריט התוסף ב-ImageJ, פתח את ארגז הכלים של IHC. בתיבה המשולבת בחר דגם שנפתחת, בחר את הכתם המתאים. בחר באפשרות הצבע כדי לבודד את הכתם.פעולה זו תפתח חלון תוצאות. השתמש בשקופית בורר הצבעים כדי להבטיח בידוד נכון של הכתם, ללא הכללת רקע או אי הכללה מוגזמת של כתמים. עבור אל סוג תמונה, 16 סיביות, כדי להמיר את התמונה ל-16 סיביות.לאחר מכן, סף את התמונה על ידי מעבר לתמונה, התאם את הסף. לבסוף, עבור לנתח, הגדר מדידה כדי למדוד את השטח המתקבל ואת הערך האפור הממוצע, ובחר לנתח, למדוד, כדי לאסוף את המדידה. בחלקים קבועים אלה של בלוטות החלב מספר ארבע, נותחו ביטוי של קולגן, פיברונקטין וטנסין-C.החצים מצביעים על נוכחות צינורות ברקמות אלה. כדי לכמת את המאפיינים המורפולוגיים של הצינורות, חשוב לטפל בזהירות בחתכים ההיסטולוגיים, שכן טיפול לא נכון עלול לגרום לפגיעה ברקמות וצינורות שאינם ניתנים למדידה. דוגמה לרקמה פגומה שלא ניתן להשתמש בה לניתוח מוצגת כאן.דגימת רקמה שלמה שבה התעלות ניתנות למדידה וניתנות לכימות מוצגת בפאנל זה. התעלות מאופיינות לא רק בסטרומה המוכתמת בפיברונקטין שמסביב, אלא גם באוכלוסייה הצפופה של תאי אפיתל המרפדים את לומן הצינורות. בקטע מוכתם פיברונקטין זה, מספר צינורות שלמים מכילים ענפים המסומנים על ידי חצים.לצורך ניתוח זה, אין להתייחס לענפי צינורות אלה כמבני צינורות נפרדים. בעת הערכה ומדידה של תעלות, חשוב להבחין בין תעלות למבני כלי דם. מבני כלי דם מסומנים על ידי חיצים אדומים, ומבני צינורות מסומנים על ידי חצים שחורים.ניתן לזהות מבנים וסקולריים לא רק על ידי נוכחות של חד-שכבת אנדותל המצפה את הלומן, אלא גם על ידי נוכחותם של מבנים גרעיניים ואאוזינופיליים המעידים על כדוריות דם אדומות בתוך הלומן. לאחר השליטה, ניתן לבצע קצירת רקמות תוך כ-15 דקות לכל חיה, וניתן להשלים את כתמי החתך תוך כשבע עד שמונה שעות, עם תמונות שקופיות שצולמו למחרת אם הכל מבוצע כראוי. בעת ניסיון הליכים אלה, חשוב לזכור שהמטרות האישיות של הניסוי שלך עשויות לדרוש אופטימיזציות בשלבים ספציפיים.לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו דור הרמוני שני או פיזור קוהרנטי נגד סטוקס רמאן על מנת לענות על שאלות נוספות הנוגעות להרכב או ארכיטקטורת הרקמות. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחומים רבים, כגון ביולוגיה של גידולים, לחקור את ארגון הרקמות ודפוסי ביטוי החלבונים במודלים רבים של בעלי חיים של מחלות ופתולוגיות אנושיות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנתח ולבודד בלוטות חלב של עכברים.עליכם להבין גם את ההליכים של צביעה אימונוהיסטוכימית של קטעי רקמות, כולל שימוש בכתמים נגדיים. אל תשכח שעבודה עם בעלי חיים ורקמותיהם וכימיקלים כגון קסילנים וכרומוגן DAB עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון הכשרה מתאימה לגידול ושימוש בציוד מגן אישי בעת ביצוע הליכים אלה.

isolation-intact-whole-mouse-mammary-glands-for-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטה זו מתארת ​​כיצד לנתח ולהעריך התפתחות תפקוד בלוטת החלב ומן העכברים. בלוטות החלב נכרת מוערכים לתואר הפיתוח באמצעות הר שלם תוך פליטה החלב מוערך באמצעות אוקסיטוצין מבוססי assay myoepithelial התכווצות התא.

הערכת התפתחות בלוטת החלב פונקציה ועל מודלים עכבר

הדמית זמן לשגות משמשת כדי להעריך את ההתנהגות של תאים ראשוניים preneoplastic חלב האפיתל הנגזרים ממודלי עכבר מהונדס גנטי של סיכון לסרטן שד על מנת לקבוע אם יש קשר בין פרמטרים התנהגותיים ספציפיים ונגעים גנטיים מובחנים.

הדמית זמן לשגות של תאי אפיתל חלב Preneoplastic ראשוניים הנגזרת ממודלי עכבר מהונדס גנטי של סרטן השד

פרוטוקול immunofluorescence העקיף המתואר במאמר זה מאפשר זיהוי והלוקליזציה של חלבונים בבלוטת החלב עכבר. שיטה שלמה ניתן להכין דגימות בלוטת החלב, לבצע אימונוהיסטוכימיה, לתמונת סעיפי רקמות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ולשחזר תמונות.

Immunofluorescence עקיף על סעיפים קפואים של עכבר בלוטת החלב

פרוטוקול זה מתאר שיטות לטיהור, quantitating, אפיון שלפוחית ​​תאיים (EVs) / exosomes מ שאינם חסיד / mesenchymal תאים אפיתל החלב ועל השימוש בהם כדי להעביר את בלוטת החלב יוצרי היכולת לתאי אפיתל החלב לומינל. EVS / exosomes נגזר גזע כמו תאי אפיתל החלב יכול להעביר תכונה זו התא לתאים לבלוע EVs / exosomes.

העברת בלוטת החלב ביצירת יכולת בין תאי אפיתל בסל החלב תאים לומיני החלב באמצעות שלפוחיות תאיים / אקסוסומות

התפתחות בלוטת החלב במכרסם הוערכה בדרך כלל באמצעות הערכות תיאוריות או על ידי מדידת תכונות פיזיות בסיסיות. צפיפות הענף היא אינדיקטור להתפתחות החלב שקשה לכמת באופן אובייקטיבי. פרוטוקול זה מתאר שיטה אמינה להערכת כמותית של מאפייני הבלוטות החלב.

כימות צפיפות הענף בבלוטת החלב עכברוש- mounts כולו באמצעות שיטת ניתוח Sholl

פיתחנו שיטה כדי להסיר בהצלחה, לעבד, קטע, כתם, להערכה histopathological, רקמת החלב שנקבע במקור על שקופיות כמו mounts שלם. שיטה זו עשויה לקדם את איסוף והערכה של בלוטת החלב כולו mounts במחקרים הנחייה מבחן הרבייה.

חתך בלוטות החלב שלמות מלא עבור זיהוי הנגע

בלוטת החלב היא מבנה מחודד, המורכב מיואפיתל חיצוני ותאי אפיתל הפנים הפנימיים. המוצג הוא פרוטוקול להכין אורגנואידים. באמצעות טריסיזציה דיפרנציאלית שיטה יעילה זו מאפשרת לחוקרים לטפל באופן נפרד בשני סוגי תאים אלה כדי לחקור שאלות הנוגעות לתפקידם בצורת בלוטת החלב ובתפקוד.

הדור של הפסיפס של חלב באמצעות טריסיזציה דיפרנציאלית

שיטת ההדמיה התוך-ורידית המתוארת כאן משתמשת בדור ההרמוני השני של הקולגן ובפלואורסצנציה אנדוגנית מהקו-פקטור המטבולי NAD(P)H כדי לפלח באופן לא פולשני מיקרו-סביבה של גידול ללא תווית לתוך תאי גידול, סטרומל וכלי דם לצורך ניתוח מעמיק של תמונות תוך-ורידיות 4D.

גישת סגמנטציה ללא תווית להדמיה תוך-ורידית של מיקרו-סביבה של גידולי יונקים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקה קלה להדמיה תוך-חיונית של בלוטת החלב של עכבר מניק, באמצעות סריקת לייזר, מיקרוסקופ קונפוקלי ומולטיפוטון.

מיקרוסקופיה תת-תאית תוך חיונית של בלוטת החלב

פרוטוקול זה דן בגישה ליצירת אורגנואידים אפיתליאליים מרקמת חלב ראשונית נורמלית וגידולית באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית. יתר על כן, הוראות כלולות עבור תרבית תלת מימדית, כמו גם הדמיה immunofluorescent של אורגנואידים משובצים.

הפקה והדמיה של אורגנואידים עכבריים ואפיתל אנושי מרקמת חלב רגילה וגידולית ללא מעבר

פרוטוקול זה מתאר גישת סקר CRISPR תוך-צינורית ניתנת להרחבה, המאפשרת מחקרים מקבילים של הכיבוי וההפעלה של הגנים בחיים בבלוטת השד של העכבר.

סקר מקביל ב-vivo של השמדת גנים והפעלה בבלוטת השד של העכברים

למדו לבודד בלוטות חלב שלמות מעכברות ללא פגע לניתוח מורפולוגי וביטוי חלבוני מטריצה חוץ-תאית. שיטה זו מאפשרת חקר אדריכלות צינורית וקולגן בבלוטות בריאות וחולות.

בידוד של בלוטות מוגדלות ללא פגע, כל עכבר לניתוח של בלוטת מורפולוגיה וביטוי מטריצה חוץ-תאית

גלה סרטונים נוספים