ניטור השפעת Osmotic הלחץ על שלפוחית הפרשה, אקסוציטוזה

המטרה הכוללת של מתודולוגיה אנליטית משולבת זו היא לספק מידע על האופן שבו שלפוחיות הפרשה בתאים מגיבות לכוח פיזי, כגון לחץ אוסמוטי חוץ-תאי, וכיצד התאמות של אברונים אלה משפיעות עוד יותר על תהליך האקסוציטוזיס. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח כגון, כיצד שלפוחיות הפרשה מגיבות ישירות לשינויים בסביבה החוץ-תאית או לטיפול תרופתי? היתרון העיקרי של גישה זו הוא ניטור ההשפעות הישירות על תכולת השלפוחית בתאים חיים והידיעה להבחין בשינוי בשחרורם הכימי לפני ואחרי הטיפול באקסוציטוזיס.

כדי להשיג משטח אלקטרודה דיסק שטוח, הנח את האלקטרודה במחזיק של מיקרו-מטחנה ושיפוע כל אלקטרודת סיבי פחמן בזווית של 45 מעלות. לאחר מכן, סמן את הנימים לעיון עתידי כיצד לאתר את משטח אלקטרודת הדיסק בזווית של 45 מעלות בעת הנחת האלקטרודה ליד תאים למדידת אקסוציטוזיס. כדי לבצע הקלטה אמפרומטרית בתאים בודדים, התקן את המיקרו-אלקטרודה של דיסק סיבי הפחמן המשופעת והטרייה שנבדקה במחזיק האלקטרודה של שלב הראש המשמש עם פוטנציוסטט.

לפני השימוש, הנח כל מיקרו-אלקטרודה מסיבי פחמן בתמיסת בדיקה כדי לנטר את זרם מצב המחקר באמצעות וולטמטריה מחזורית. עבור סריקת וולטמטריה מחזורית, החל צורת גל פוטנציאלית משולשת מ-0.2 וולט שלילי ל-0.8 וולט חיובי כנגד אלקטרודת ייחוס כלוריד כסף-כסף ב-100 מילי-וולט לשנייה כדי להבטיח קינטיקה טובה של תגובה. לרישום אמפרומטריה של אקסוציטוזיס, הנח את צלחת הפטרי עם תאי כרומפין מתורבתים במאגר איזוטוני על מיקרוסקופ הפוך בכלוב פאראדיי.

השתמש בשלב חימום מיקרוסקופ כדי לשמור על טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במהלך ניסויי התאים. לאחר מכן, השתמש במכשיר מהדק תיקון בעל רעש נמוך כדי להפעיל פוטנציאל קבוע של 700 מילי-וולט חיובי באלקטרודת העבודה. להקלטת אקסוציטוזיס של תאי כרומפין, דיגיטציה של האות ב-10 קילו-הרץ והחל מסנן בסל פנימי במעבר נמוך בשני קילו-הרץ כדי לסנן את האות המוקלט.

שימו לב שאלקטרודת הדיסק הסגלגל צריכה להיות ממוקמת שטוחה על גבי התאים ובמקביל לפני השטח של צלחת הפטרי. כמו כן, אלקטרודות משופעות באותו יום כמו ניסויים כדי להבטיח משטח אלקטרודה נקי. כדי לעורר את אקסוציטוזיס התא, מקם מיקרופיפטה מזכוכית מלאה בתמיסת בריום כלוריד של חמישה מילי-מולרית במרחק של לפחות 20 מיקרומטר מהתא.

לאחר מכן, יש למרוח פולס הזרקה של חמש שניות של תמיסת בריום כלוריד של חמישה מילי-מולרית על פני התא כדי לעורר את אקסוציטוזיס התא. הנח את פיפטת הגזע בתמיסה ועורר את אקסוציטוזיס התא על ידי הפעלת דופק הזרקת בריום תוך רישום מעברי הזרם האמפרומטרי למשך כשלוש דקות. כדי להשוות את התגובות האקסוציטוטיות בתנאים איזוטוניים לתנאים היפרטוניים, דגרו את התאים למשך 10 דקות בתמיסת חיץ היפרטונית.

לאחר מכן, הפעל דופק הזרקת בריום כדי לעורר אקסוציטוזיס, ובצע שלוש דקות של הקלטה אמפרומטרית. לתגובה הפיכה של תאים, דגרו שוב על התאים למשך 10 דקות בתמיסת חיץ איזוטונית. לעורר את התאים על ידי הפעלת דופק הזרקת בריום ולבצע שלוש דקות של הקלטה של התגובה האקסוציטוטית.

כדי לייצר את האלקטרודות למדידות גודל קוונטי שלפוחיתית, הכינו אלקטרודה מסיבי פחמן בקוטר של חמישה מיקרומטרים. תחת מיקרוסקופ, השתמש באזמל כדי לחתוך את סיבי הפחמן הנמשכים החוצה מקצה הזכוכית כך שיישארו רק 30 עד 100 מיקרומטר. השתמש בלהבת בוטאן כדי להכין קצה חרוט להבה של אלקטרודת סיבי הפחמן.

כדי להשיג קצה אלקטרודה בצורת גליל חרוט באופן שווה, החזק את אלקטרודת סיבי הפחמן בצורת גליל תוך כדי סיבובה. והניחו את סיבי הפחמן המשתרעים מהזכוכית לתוך הקצה הכחול של להבת הבוטאן עד שקצה הפחמן מפתח צבע אדום. לאחר תחריט הלהבה, הנח את האלקטרודה מתחת למיקרוסקופ כדי להעריך את קצה האלקטרודה.

גודל קצה האלקטרודה החרוט צריך להיות בקוטר של כ-50 עד 100 ננומטר. לאחר מכן, הכנס את המיקרו-אלקטרודה הננומטרית הגלילית לתמיסת האפוקסי למשך שלוש דקות ולאחר מכן טבילה של 15 שניות של קצה האלקטרודה בתמיסת האצטון. זה מאפשר לאפוקסי לאטום את חלל הפער הפוטנציאלי בין סיבי הפחמן לדופן נימי הגז המבודדים.

בעוד האצטון מנקה את האפוקסי ממשטח האלקטרודה של סיבי הפחמן החרוטים. כדי לרפא את האפוקסי, אופים את האלקטרודות בתנור למשך הלילה בחום של 100 מעלות צלזיוס. לפני השימוש, בדוק את זרם המצב היציב של כל מיקרו-אלקטרודה מסיבי פחמן באמצעות וולטמטריה מחזורית.

לניסויים, השתמש רק באלקטרודות המציגות זרם רמה סביב 1.5 עד 2.5 ננו-אמפר. למדידות אמפרומטריה תוך-תאית, מקם את התאים מתחת למיקרוסקופ והשתמש באותן הגדרות ניסיוניות של הפוטנציוסטט. למנוע נזק פיזי משמעותי לתא.

הכנס את המיקרואלקטרודה הגלילית הננו-קצה לתא על ידי הוספת כוח מכני עדין. מספיק כדי לדחוף את האלקטרודה דרך קרום הפלזמה של התא ולתוך הציטופלזמה של התא באמצעות מיקרומניפולטור. לאחר ההחדרה, וכאשר קרום התא אטום סביב האלקטרודה הגלילית, התחל את הרישום האמפרומטרי במקום בתא החי.

בפוטנציאל החמצון המופעל על האלקטרודה, שלפוחיות נספגות למשטח האלקטרודה ונקרעות באופן סטוכסטי. לפיכך, אין צורך בגירוי כלשהו כדי להתחיל תהליך זה. כדי לקבוע את ההשפעה האוסמוטית על הגודל הקוונטי השלפוחית, אסוף את מדידות הציטומטריה התוך תאית מקבוצת תאים שהודגרו במאגר איזוטוני ובהיפרטוני באמצעות תנאי הניסוי.

ההשפעה של אוסמולליות חוץ-תאית על פעילות אקסוציטוזיס מוצגת כתדירות אירועי אקסוציטוזיס כאשר תאי כרומפין מגורים בתמיסת בריום בתנאים איזוטוניים, לאחר מכן היפרטוניים ולבסוף בתנאים איזוטוניים. נתונים אלה מראים עיכוב בפעילות אקסוציטוזיס בתאים החווים לחץ אוסמוטי וניתן להשיג התאוששות חלקית לאחר חזרת התאים לסביבה איזוטונית. ניסוי הבקרה מראה את תדירות אירועי האקסוציטוזיס לאחר שלושה גירויים רצופים של בריום בתאי כרומפין בתנאים איזוטוניים.

זה מראה שגירוי בריום מרובה במסגרת הזמן המשמשת בניסויים אלה גורם להפחתה בפעילות האקסוציטוזיס על ידי גירוי תאים עוקב. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע שיטות אנליטיות משלימות אלה המאפשרות לך להשוות כיצד שלפוחיות הפרשה ותהליך האקסוציטוזיס מושפעים משינויים בסביבה החוץ-תאית.